环状RNA hsa_circ_0050900在乳腺癌中的表达及其对细胞生物学行为影响的机制研究 被引量：2

1

作者 王晓松 陈俊霞 《中国癌症杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第12期977-983,共7页

背景与目的:环状RNA(circular RNA,circRNA)作为特殊的非编码RNA,一般在体内低表达,且不易被RNA酶降解,结构与表达稳定。随着测序技术的进步,目前发现多种肿瘤的发生、发展与circRNA有关。但未见乳腺癌的发生、发展与hsa_circ_0050900... 背景与目的:环状RNA(circular RNA,circRNA)作为特殊的非编码RNA,一般在体内低表达,且不易被RNA酶降解,结构与表达稳定。随着测序技术的进步,目前发现多种肿瘤的发生、发展与circRNA有关。但未见乳腺癌的发生、发展与hsa_circ_0050900的异常表达相关的报道。探究乳腺癌组织中hsa_circ_0050900的表达以及其影响乳腺癌细胞生物学行为的机制。方法:选取在重庆医科大学附属第一医院经手术切除的4例女性乳腺癌组织及对应的癌旁组织,采用RNA测序(RNA sequencing,RNA-seq)进行测序分析,并运用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)验证乳腺癌中hsa_circ_0050900的表达,其中包括30例乳腺癌组织及其癌旁组织(在重庆医科大学附属第一医院经手术切除),正常人乳腺上皮细胞系即对照组细胞MCF-10A以及两种乳腺癌细胞系MCF-7、SK-BR-3。通过RTFQ-PCR验证乳腺癌细胞中hsa_circ_0050900被敲低后的表达水平;分别运用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)实验和EdU实验、细胞划痕实验、transwell实验验证细胞的增殖、迁移功能;细胞凋亡的检测采用TUNEL一步法;Hoechst 33342实验通过对细胞核染色确定细胞的状态以检测细胞凋亡;细胞周期蛋白D2(cyclin D2,CCND2)和周期蛋白依赖性激酶4(cyclin-dependent kinase 4,CDK4)的表达采用蛋白质印迹法(Western blot)检测。结果:根据测序结果,挑选出在乳腺癌和细胞中明显高表达的circRNA hsa_circ_0050900;构建的si-circ质粒可显著降低hsa_circ_0050900在乳腺癌细胞中的表达,转染si-circ的细胞增殖能力降低,并促进细胞凋亡,且降低细胞周期相关蛋白CCND2、CDK4的表达。结论:circRNA hsa_circ_0050900在乳腺癌组织中的表达显著高于癌旁组织,敲低hsa_circ_0050900对细胞增殖、迁移能力、细胞凋亡及细胞周期有调控作用。 展开更多

关键词 环状RNA 乳腺癌 hsa_circ_0050900 增殖 迁移 凋亡 细胞周期

在线阅读 下载PDF 职称材料

特异性ILK-siRNA对膀胱癌EJ细胞侵袭和迁移的影响 被引量：6

2

作者 朱军 高娟 +2 位作者 李红彦 潘湘阳 陈俊霞 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期360-364,共5页

目的设计合成有效的ILK-siRNA,并检测其对EJ细胞侵袭和迁移的影响。方法构建针对ILK基因mRNA的2个特异性siRNA表达载体pGenSil-1 siRNA1、pGensil-1 siRNA2和1个阴性对照载体pGenSil-1 siRNA3。稳定转染膀胱癌EJ细胞后,通过RT-PCR检测E... 目的设计合成有效的ILK-siRNA,并检测其对EJ细胞侵袭和迁移的影响。方法构建针对ILK基因mRNA的2个特异性siRNA表达载体pGenSil-1 siRNA1、pGensil-1 siRNA2和1个阴性对照载体pGenSil-1 siRNA3。稳定转染膀胱癌EJ细胞后,通过RT-PCR检测EJ细胞中ILK mRNA水平的表达,并通过Western blot和细胞免疫荧光检测ILK蛋白水平的表达;观察EJ细胞形态变化;检测EJ细胞迁移、黏附和侵袭能力及基质金属蛋白酶的变化。结果重组质粒构建成功。干扰组细胞ILK mRNA及蛋白的表达分别较3个对照组(未转染组、转空质粒组和转阴性对照质粒组)比较,呈显著性下降(P<0.05);HE染色结果显示,细胞铺展良好,核质比减小;转染干扰质粒的2个实验组细胞的黏附能力相对于对照组分别增加87%和76%,黏附能力显著升高,迁移及侵袭能力明显降低(P<0.05);与3个对照组比较,转染pGenSil-1 siRNA1与pGensil-1 siRNA2质粒到EJ细胞后,MMP-2及MMP-9的表达水平明显降低(P<0.05)。结论成功构建的干扰质粒能抑制ILK基因及蛋白水平的表达,显著抑制细胞的生长、侵袭及迁移能力。 展开更多

关键词 RNA 小分子干扰 膀胱肿瘤 细胞系 肿瘤 侵袭 迁移 整合素连接激酶

在线阅读 下载PDF 职称材料

IRE1α重组腺病毒载体对ATDC5软骨干细胞增殖及凋亡的影响 被引量：5

3

作者 李祥柱 张鹏 +3 位作者 韩晓凤 李美玲 夏飞 郭风劲 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第8期639-643,共5页

目的构建重组人IRE1α腺病毒,观察其对软骨干细胞ATDC5增殖与凋亡的影响。方法应用pAdEasyTM腺病毒载体系统构建包含全长IRE1α基因和RNase+Kinase核心结构域的重组穿梭质粒pAdTrack-IRE1α、pAdTrack-R+K,通过电转法分别与腺病毒骨架质... 目的构建重组人IRE1α腺病毒,观察其对软骨干细胞ATDC5增殖与凋亡的影响。方法应用pAdEasyTM腺病毒载体系统构建包含全长IRE1α基因和RNase+Kinase核心结构域的重组穿梭质粒pAdTrack-IRE1α、pAdTrack-R+K,通过电转法分别与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组,获得重组腺病毒pAd-IRE1α、pAd-R+K。随后在HEK-293细胞中包装并扩增重组腺病毒颗粒Ad-IRE1α、Ad-R+K。用直接PCR法鉴定重组腺病毒,后者体外感染软骨干细胞ATDC5,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)感染效率,并应用流式细胞仪分别检测在内质网应激(ERS)和非ERS状态时重组腺病毒对ATDC5细胞增殖和凋亡的影响。结果酶切鉴定和PCR证实成功构建了重组腺病毒质粒pAd-IRE1α、pAd-R+K。流式细胞仪检测结果显示,在ERS状态时,重组腺病毒质粒Ad-IRE1α、Ad-R+K感染后ATDC5细胞G1期比例明显降低,S期细胞比例明显升高(P<0.05),细胞凋亡率明显增高(P<0.05)。结论含IRE1α基因的重组腺病毒感染可促进ATDC5细胞的增殖和凋亡。 展开更多

关键词 IRE1α 腺病毒科 ATDC5细胞 细胞增殖 细胞凋亡

在线阅读 下载PDF 职称材料

miRNA-451表达质粒的构建及对人A549肺癌细胞侵袭转移及凋亡的影响 被引量：8

4

作者 姚莉 孙艳 +1 位作者 查何 彭惠民 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第10期841-845,共5页

目的:探讨miRNA-451对人A549肺癌细胞侵袭转移及凋亡的影响。方法:Hsa-miRNA-451序列通过miRBase数据库查找,根据此序列设计出2条寡核苷酸片段,将目的基因经过退火处理后克隆至真核表达载体pGenesil-1.1质粒中,从而构建成为miRNA-451真... 目的:探讨miRNA-451对人A549肺癌细胞侵袭转移及凋亡的影响。方法:Hsa-miRNA-451序列通过miRBase数据库查找,根据此序列设计出2条寡核苷酸片段,将目的基因经过退火处理后克隆至真核表达载体pGenesil-1.1质粒中,从而构建成为miRNA-451真核表达载体(pGenesil-1.1-miRNA-451质粒)。将pGenesil-1.1-miRNA-451及pGenesil-1.1-control质粒分别转染人A549肺癌细胞,经过G418的筛选,建立pGenesil-1.1-miRNA-451及pGenesil-1.1-control稳定表达的细胞株。流式细胞术分析检测细胞凋亡的情况;Transwell小室检测miRNA-451对细胞侵袭能力的影响;细胞划痕实验检测细胞的迁移情况。结果:经测序证实miRNA-451真核表达质粒构建成功,与未处理的人A549肺癌细胞和稳定表达pGenesil-1.1-control的细胞相比,稳定表达了pGenesil-1-miRNA-451的人A549肺癌细胞的侵袭和迁移能力均明显受到抑制影响,而细胞凋亡无明显变化(P>0.05)。结论:miRNA-451对人A549肺癌细胞侵袭转移具有显著的抑制作用,但对细胞凋亡作用不明显。 展开更多

关键词 肺癌 miRNA-451 侵袭 转移 凋亡

在线阅读 下载PDF 职称材料

稳定表达HBx的肝前体细胞株的构建及其对增殖的影响 被引量：4

5

作者 芦永良 申利红 +5 位作者 李红丽 胡代曦 张锡峰 胡斌 冯涛 黄佳祎 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期256-260,共5页

目的构建稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)的肝前体细胞株,检测对肝前体细胞增殖,细胞周期及Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法重组质粒pSEB-Flag-HBx与包装质粒pAmpho共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,包装获得携带HBx基因的重组... 目的构建稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)的肝前体细胞株,检测对肝前体细胞增殖,细胞周期及Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法重组质粒pSEB-Flag-HBx与包装质粒pAmpho共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,包装获得携带HBx基因的重组逆转录病毒,并感染小鼠肝前体细胞HP14.5,稻瘟菌素(blasticidin)筛选出稳定表达HBx基因的细胞克隆并扩大培养(HP14.5/HBx组),设HP14.5/Rv(空质粒pSEEB-Flag感染组)及空细胞组HP14.5组为对照组。MTS比色法检测各组细胞的增殖活力,流式细胞术检测细胞周期中各时相所占的比例,荧光定量PCR检测cyclin D1和c-myc mRNA的表达量,Western blot法检测HBx、GSK3β、p-GSK3β(ser-9)、β-catenin、cyclin D1以及c-myc等蛋白的表达。结果 RT-PCR和Westernblot法检测到HBx基因和蛋白阳性表达,与对照组相比,HP14.5/HBx细胞增殖活力显著增加(P<0.05);G1细胞比例明显减少(P<0.05),S期和G2细胞比例显著升高(P<0.05);cyclin D1和c-myc mRNA的表达量显著升高(P<0.05);GSK3β蛋白水平表达无明显变化(P>0.05),p-GSK3β、β-catenin、cyclin D1和c-myc蛋白的表达水平显著升高(P<0.05)。结论成功筛选出稳定表达HBx的肝前体细胞株,HBx通过活化Wnt/β-catenin信号途径促进肝前体细胞的增殖。 展开更多

关键词 乙型肝炎病毒X蛋白 肝前体细胞 细胞增殖 WNT β-catenin信号途径

在线阅读 下载PDF 职称材料

Let-7a表达质粒的构建及其对肺癌A549细胞k-Ras蛋白表达的抑制作用 被引量：2

6

作者 何晓燕 陈俊霞 +2 位作者 欧阳溪 张政 彭惠民 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第11期2427-2431,共5页

目的探讨let-7a介导的基因表达调控在肺癌形成中的作用。方法依据miRBase数据库中hsa-let-7a序列,设计两条寡核苷酸片段,退火处理后克隆至pGenesil-1质粒,构建重组质粒pGenesil-let-7a,同时设计并构建一个阴性对照质粒pGenesil-control... 目的探讨let-7a介导的基因表达调控在肺癌形成中的作用。方法依据miRBase数据库中hsa-let-7a序列,设计两条寡核苷酸片段,退火处理后克隆至pGenesil-1质粒,构建重组质粒pGenesil-let-7a,同时设计并构建一个阴性对照质粒pGenesil-control。将pGenesil-let-7a及pGenesil-control转染肺癌A549细胞,经G418筛选,建立稳定表达let-7a-GFP及control-GFP的细胞株。采用MTT比色法检测活细胞数并绘制生长曲线;半定量RT-PCR、Western blotting及免疫细胞化学检测k-Ras表达的差异。结果经测序证实重组质粒构建成功,与未处理的A549细胞和稳定表达pGenesil-control的细胞相比,在稳定表达pGenesil-let-7a的A549细胞中,细胞生长明显减慢,k-Ras的蛋白表达明显降低,而k-Ras的mRNA水平无明显变化。结论 let-7a在翻译水平抑制了k-Ras的表达,并对细胞生长具有显著的抑制作用。 展开更多

关键词 微RNA let-7a 肺癌 K-RAS 基因表达

在线阅读 下载PDF 职称材料

FNBP1参与HeLa细胞的形态控制与生长调控 被引量：1

7

作者 李鑫 温泉 +2 位作者 周云飞 何玉霞 张军 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第19期2046-2050,共5页

目的研究FNBP1在HeLa细胞形态控制及生长调控过程中的作用。方法运用RT-PCR、Western blot法在mRNA和蛋白水平验证FNBP1在HeLa细胞中的表达;运用RT-PCR、Western blot法检测靶向siRNA干扰HeLa细胞内源FNBP1的表达情况,并于完全沉默和表... 目的研究FNBP1在HeLa细胞形态控制及生长调控过程中的作用。方法运用RT-PCR、Western blot法在mRNA和蛋白水平验证FNBP1在HeLa细胞中的表达;运用RT-PCR、Western blot法检测靶向siRNA干扰HeLa细胞内源FNBP1的表达情况,并于完全沉默和表达恢复2个时相点检测HeLa细胞在细胞形态、细胞周期等方面的变化。结果FNBP1在HeLa细胞中稳定表达;FNBP1表达沉默后,HeLa细胞形态发生纤维状转变;FNBP1表达恢复后,HeLa细胞形态恢复至上皮状;FNBP1表达沉默后,干扰组处于S期的细胞为30.36%,较正常组(25.45%)明显增多(P<0.05);而G2期干扰组细胞比例(9.28%)低于正常组(11.88%,P<0.05);HeLa细胞周期在S期出现阻滞。结论 FNBP1作为关键调控分子,为HeLa细胞的形态建成及维持所必需;FNBP1可能参与HeLa细胞周期调控相关过程。 展开更多

关键词 FNBP1 HELA细胞 形态控制 生长调控

在线阅读 下载PDF 职称材料

Let-7a负性调控人肾上皮细胞293T中UHRF1基因的表达

8

作者 文利 彭睿 +3 位作者 孙艳 武天慧 彭惠民 张政 《西南大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2017年第7期77-83,共7页

目的:探讨人肾上皮细胞293T中let-7a对靶基因UHRF1的负性调控作用.方法:运用生物信息学技术对let-7a靶基因进行预测和分析.构建含有UHRF1 3'UTR全长的野生型(pmiR-RB-UHRF1-3'UTR-wt)和突变型荧光素酶报告质粒(pmiR-RB-UHRF1-3&... 目的:探讨人肾上皮细胞293T中let-7a对靶基因UHRF1的负性调控作用.方法:运用生物信息学技术对let-7a靶基因进行预测和分析.构建含有UHRF1 3'UTR全长的野生型(pmiR-RB-UHRF1-3'UTR-wt)和突变型荧光素酶报告质粒(pmiR-RB-UHRF1-3'UTR-mut),分别将pmiR-RB-UHRF1-3'UTR-wt,pmiR-RB-UHRF1-3'UTRmut,pmiR-RB-REPORT vector与let-7amimics或mimics control共转染293T细胞,双荧光素酶报告系统检测转染后293T细胞的荧光素酶表达水平.293T细胞分别转染let-7amimics和inhibitor,western blot和real-time RT PCR检测UHRF1基因的表达.结果:生物信息学结果显示let-7a有48个预测靶基因,包括UHRF1,HMGA2,MAPK6等,主要涉及microRNA在肿瘤、细胞周期、PI3K-AKT、p53等信号通路.其中UHRF1 3'UTR含有一个let-7a的结合位点,且在多个物种中呈高度保守.进一步双荧光素酶检测发现,共转染let-7amimics和pmiR-RBUHRF1-3'UTR-wt的293T细胞荧光素酶活性显著降低(p<0.01).Western blot和real-time RT PCR结果显示转染let-7amimics的293T细胞UHRF1表达降低,而转染let-7ainhibitor的293T细胞UHRF1表达增高.结论:人肾上皮细胞293T中let-7a能通过与UHRF13'UTR靶向结合,负性调控UHRF1的表达. 展开更多

关键词 微RNA UHRF1 基因表达

在线阅读 下载PDF 职称材料

抑制miR-130b-3p通过上调PTEN和灭活PI3K-AKT及整合素β1/FAK信号通路抑制膀胱癌细胞增殖 被引量：15

9

作者 吕梦欣 陈俊霞 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第2期150-159,共10页

miR-130家族在癌的进展中发挥作用;然而,其家族成员在膀胱癌中的作用尚罕见报告。本研究证明,抑制miR-130家族成员miR-130b-3p表达促进PTEN表达,诱导细胞凋亡,抑制膀胱癌细胞增殖。首先,我们采用微阵列对来自膀胱癌患者的4对膀胱癌和癌... miR-130家族在癌的进展中发挥作用;然而,其家族成员在膀胱癌中的作用尚罕见报告。本研究证明,抑制miR-130家族成员miR-130b-3p表达促进PTEN表达,诱导细胞凋亡,抑制膀胱癌细胞增殖。首先,我们采用微阵列对来自膀胱癌患者的4对膀胱癌和癌旁组织进行了miRNA和mRNA组学分析,发现miR-130b-3p和miR-106b-3p在膀胱癌组织高表达,而miR-99a-3p、miR-199a-5p和miR-145-3p低表达。RT-q PCR检测30对膀胱癌组织5种miRNA的表达与微阵列中的表达状况一致。此外,我们在mRNA组学分析中还发现,miR-130b-3p在膀胱癌组织的高表达与PTEN表达呈负相关。为此,在后续研究中集中探索了miR-130b-3p在膀胱癌中的作用及其作用机制。生物信息学及荧光素酶报告结果证明,miR-130b-3p可直接结合PTEN的3'-UTR,靶向抑制PTEN的表达。转染结合CCK-8、EDU、流式分析、划痕及Transwell小室实验显示,转染miR-130b-3p模拟物可明显促进膀胱癌T24细胞的增殖、迁移及侵袭能力;相反,转染miR-130b-3p抑制物可明显诱导T24细胞凋亡。鬼笔环肽染色揭示,转染miR-130b-3p模拟物可促进细胞骨架形成,而转染miR-130b-3p抑制物抑制细胞骨架形成。Western印迹证明,转染miR-130b-3p可下调PTEN在T24细胞的表达,上调p-PI3K、p-AKT、p-FAK和整合素β1的表达;而转染miR-130b-3p抑制物上调PTEN的表达,下调p-PI3K、p-AKT、p-FAK和整合素β1的表达。上述结果提示,miR-130b-3p通过抑制PTEN表达,激活PI3K-AKT及整合素β1/FAK信号通路,在膀胱癌中发挥癌基因样作用;相反,抑制miR-130b-3p可上调PTEN表达,抑制PI3K-AKT及整合素β1/FAK信号通路的激活,诱导凋亡,抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。我们的结果还提示,miR-130b-3p作为可能的临床标志物,对膀胱癌的诊断、靶向治疗具有潜在的应用价值。 展开更多

关键词 微RNA组 miR-130b PTEN 膀胱癌 PI3K和整合素β1信号通路

在线阅读 下载PDF 职称材料

过表达UHRF2通过上调p53及p21表达引起HEK293细胞G_1期阻滞 被引量：1

10

作者 宣艳艳 张婷 +1 位作者 白露 段昌柱 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期604-610,共7页

UHRF2(ubiquitin-like with PHD and ring finger domains 2)是新近发现的具有多个结构域的核蛋白,在细胞周期调控和表观遗传学中发挥重要作用.近期研究提示,UHRF2是肿瘤抑制蛋白p53的1个E3连接酶,在体内外能与p53相互结合并促进其泛素... UHRF2(ubiquitin-like with PHD and ring finger domains 2)是新近发现的具有多个结构域的核蛋白,在细胞周期调控和表观遗传学中发挥重要作用.近期研究提示,UHRF2是肿瘤抑制蛋白p53的1个E3连接酶,在体内外能与p53相互结合并促进其泛素化,过表达UHRF2能使细胞周期停滞于G1期.然而,UHRF2介导的G1期阻滞及其与p53联系尚不清楚.通过共转染UHRF2质粒及p53特异性小干扰RNA(siRNAs)到HEK293细胞构建细胞模型,探索UHRF2引起细胞周期停滞与p53之间的关系.结果显示,UHRF2能促进HEK293细胞中p53的稳定,从而引起p21(CIP1/WAF1)基因表达,并使细胞周期停滞于G1期;但在siRNA抑制p53的表达后p21(CIP1/WAF1)表达降低,UHRF2引起的细胞周期阻滞消除.研究结果提示,UHRF2可通过稳定p53,上调p21的表达,从而介导细胞周期阻滞于G1期;同时UHRF2可能参与细胞周期调控及DNA损伤反应(DNA damage response,DDR).UHRF2稳定p53的具体分子机制及其在DDR中的作用有待进一步研究证明. 展开更多

关键词 UHRF2 细胞周期阻滞 P53 泛素化

在线阅读 下载PDF 职称材料

环状RNA hsacirc0005320在三阴性乳腺癌中的表达及其对细胞增殖的影响 被引量：2

11

作者 郑夏颖 陈俊霞 《中国癌症杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第11期845-854,共10页

背景与目的:环状RNA(circular RNA,circRNA)作为新近发现的具有重要调节潜能的非编码RNA,与多种肿瘤的发生、发展密切相关,但在三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)中罕见报道。探讨hsacirc0005320在TNBC中的表达变化及... 背景与目的:环状RNA(circular RNA,circRNA)作为新近发现的具有重要调节潜能的非编码RNA,与多种肿瘤的发生、发展密切相关,但在三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)中罕见报道。探讨hsacirc0005320在TNBC中的表达变化及其对细胞增殖的影响。方法:通过RNA测序(RNA sequencing,RNA-Seq)分析4对于重庆医科大学附属第一医院行手术切除的TNBC组织和癌旁组织,采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerasechainreaction,RTFQ-PCR)验证20对TNBC组织和癌旁组织以及正常人乳腺上皮细胞MCF-10A和TNBC细胞MDA-MB-231、BT-549中hsacirc0005320的表达,并通过荧光原位杂交(fluorescencein situhybridization,FISH)实验进一步检测其在TNBC中的表达。采用RTFQ-PCR检测沉默hsacirc0005320后TNBC细胞中hsacirc0005320的表达;采用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)和EdU实验检测细胞增殖;采用流式细胞术、Hoechst 33342、Tunel实验检测细胞凋亡;采用流式细胞术检测细胞周期;采用蛋白质印迹法(Western blot)检测LIF-STAT3通路相关蛋白的表达情况。结果:hsacirc0005320在TNBC组织和细胞中显著高表达;在TNBC细胞中沉默hsacirc0005320后其表达量显著降低,细胞增殖能力下降,促进细胞凋亡,导致细胞周期阻滞在G1期,且LIF、P-STAT3蛋白表达水平明显下降。结论:hsacirc0005320在TNBC中高表达,沉默hsacirc0005320可显著抑制TNBC细胞的增殖,诱导细胞凋亡。 展开更多

关键词 环状RNA 三阴性乳腺癌 hsacirc0005320 增殖

在线阅读 下载PDF 职称材料

LncRNARP11-79H23.3在膀胱癌细胞中的作用及其发生、发展的研究 被引量：1

12

作者 池虹 陈俊霞 《中国癌症杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第1期22-29,共8页

背景与目的:虽然许多长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)的异常表达与膀胱癌的发生有密切关系,但对于lnc RNA RP11-79H23.3暂未见报道。该研究旨在探讨lnc RNA RP11-79H23.3在膀胱癌EJ细胞中的作用及其发生、发展的机制。方法... 背景与目的:虽然许多长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)的异常表达与膀胱癌的发生有密切关系,但对于lnc RNA RP11-79H23.3暂未见报道。该研究旨在探讨lnc RNA RP11-79H23.3在膀胱癌EJ细胞中的作用及其发生、发展的机制。方法:采用微阵列方法对4对膀胱癌患者的癌和癌旁组织进行组学分析,随后用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)检测膀胱癌组织、癌旁组织及正常人膀胱上皮细胞sv-HUC-1、膀胱癌EJ细胞中RP11-79H23.3的表达。通过转染p IRES2-RP11-79H23.3上调该基因后,采用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)和Ed U的方法检测EJ细胞的增殖活性,通过Transwell小室和平板划痕实验分别检测EJ细胞的侵袭和迁移能力,应用流式细胞术、Hoechst33342及Tunel检测细胞凋亡,应用细胞免疫荧光检测PTEN在膀胱癌细胞中的定位,采用鬼笔环肽染色观察细胞骨架形成,应用蛋白[质]印迹法(Western blot)分析过表达RP11-79H23.3后EJ细胞中PI3K/AKT信号通路中相关蛋白的表达情况。结果:Lnc RNA RP11-79H23.3在膀胱癌组织和膀胱癌EJ细胞中表达下调(P<0.001,P<0.01),p IRES2-RP11-79H23.3转染EJ细胞结果显示,RP11-79H23.3的表达量较转染前显著增加(P<0.01)。上调RP11-79H23.3的表达可诱导膀胱癌EJ细胞的凋亡,相反,转染p IRES2-EGFP可促进EJ细胞的增殖、侵袭和迁移能力,同时,Western blot结果显示,转染p IRES2-RP11-79H23.3后可上调PTEN在EJ细胞中的表达,下调p-PI3K、p-AKT及p-Gsk3β蛋白的表达(P<0.05)。结论:Lnc RNA RP11-79H23.3在膀胱癌组织和膀胱癌EJ细胞中低表达(P<0.001,P<0.01),并且过表达RP11-79H23.3会降低膀胱癌细胞增殖、侵袭和迁移能力,其作用机制可能与PI3K/AKT信号通路有关。提示lnc RNA RP11-79H23.3在膀胱癌恶性肿瘤中发挥重要的作用,可能会成为治疗膀胱癌的药物作用靶点。 展开更多

关键词 膀胱癌 长链非编码RNA RP11-79H23.3 EJ细胞

在线阅读 下载PDF 职称材料

sFRP5抑制Wnt3a对黑素细胞黑素形成作用的初步研究

13

作者 汤寅虹 杨珂 +5 位作者 杨恬 叶吉星 刘鹏 连小华 郭海英 彭惠民 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第3期228-231,共4页

目的研究sFRP5抑制Wnt3a对黑素细胞黑素形成的作用。方法以永生化的黑素细胞为模型,利用腺病毒表达载体,设置Control组、Wnt3a处理组、Wnt3a+sFRP5处理组进行以下实验:L-DOPA测定酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)活性;Masson-Fontanas银染色法... 目的研究sFRP5抑制Wnt3a对黑素细胞黑素形成的作用。方法以永生化的黑素细胞为模型,利用腺病毒表达载体,设置Control组、Wnt3a处理组、Wnt3a+sFRP5处理组进行以下实验:L-DOPA测定酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)活性;Masson-Fontanas银染色法观察黑素形成情况;RT-PCR检测酪氨酸酶相关蛋白1(tyrosinase-related protein 1,TRP-1)、TYR基因的表达;Western blot检测TRP-1、TYR蛋白的表达水平。结果 L-DOPA测定酪氨酸酶活性结果显示Wnt3a+sFRP5处理组TYR活性低于Wnt3a处理组,差异有统计学意义(P<0.05);Masson-Fontanas银染色法显示Wnt3a+sFRP5处理组形成的黑素明显低于Wnt3a处理组;RT-PCR检测结果显示Wnt3a+sFRP5处理组能下调TRP-1、TYR基因的表达(P<0.05);Western blot检测结果显示Wnt3a+sFRP5处理组能下调TRP-1、TYR蛋白的表达水平(P<0.05)。结论 sFRP5能抑制Wnt3a对黑素细胞黑素生成的作用。 展开更多

关键词 sFRP5 WNT3A 黑素细胞

在线阅读 下载PDF 职称材料

过表达核糖核酸酶抑制因子通过调节ILK/PI3K/AKT信号途径抑制小鼠黑色素瘤B16-F10细胞体内外生长

14

作者 黄梦鸽 潘湘阳 +1 位作者 陈俊霞 田强 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第4期373-382,共10页

核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)是胞浆内的一种酸性蛋白质.已有研究证明,RI与核糖核酸酶A(RNase A)和血管生成素(angiogenin,ANG)结合可抑制其活性.本室前期实验证实,RI可有效抑制某些肿瘤的生长和转移.然而,RI抑制肿... 核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor,RI)是胞浆内的一种酸性蛋白质.已有研究证明,RI与核糖核酸酶A(RNase A)和血管生成素(angiogenin,ANG)结合可抑制其活性.本室前期实验证实,RI可有效抑制某些肿瘤的生长和转移.然而,RI抑制肿瘤的分子机制尚不清楚.本研究探讨RI对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞生长和凋亡的影响及其机制.MTT法结合流式细胞术分析结果证明,RI基因稳定转染导致B16-F10黑色素瘤细胞S期阻滞,抑制B16-F10黑色素瘤细胞增殖.Annexin V/PI结合流式细胞术结果显示,RI过表达引起细胞凋亡.与此相一致,蛋白质印迹分析显示,过表达RI引起抗凋亡分子Bcl-2表达下调,而Bax上调,同时伴有Pro-casepase 3激活.C57BL/6小鼠移植成瘤实验显示,与对照相比,转染RI的B16-F10细胞形成的肿瘤重量显著减少,同时伴有肿瘤组织微血管密度降低.提示RI过表达能抑制微血管生成.此外,体内外组织/细胞免疫化学和蛋白质印迹结果揭示,过表达RI可显著抑制整合素连接激酶(integrin-linked kinase,ILK)下游靶分子Akt和GSK-3β的磷酸化,并降低β-联蛋白的表达.研究结果证明,过表达RI可通过抑制ILK/PI3K/AKT信号通路,促进细胞凋亡,引起S期阻滞,并抑制血管生成,从而显著抑制小鼠黑色素瘤B16-F10细胞在体内、外的生长.上述结果提示,RI可能是治疗黑色素瘤的有效分子靶点. 展开更多

关键词 核糖核酸酶抑制因子 B16-F10细胞 细胞凋亡 ILK/PI3K/AKT信号通路

在线阅读 下载PDF 职称材料

HBc蛋白与NIRF蛋白细胞外相互作用鉴定 被引量：2

15

作者 杨艳 金方敏 +2 位作者 白露 王筱绘 段昌柱 《生物学杂志》 CAS CSCD 2012年第1期21-24,46,共5页

构建原核表达质粒pGST-HBc,真核表达质粒pFLAG-NIRF,表达并纯化GST-HBc蛋白,表达FLAG-NIRF蛋白,利用GST pull down技术鉴定HBc与NIRF蛋白的相互作用。利用PCR技术分别扩增HBc编码框和NIRF基因全长,并将其分别插入到原核表达载体pGEX-4T-... 构建原核表达质粒pGST-HBc,真核表达质粒pFLAG-NIRF,表达并纯化GST-HBc蛋白,表达FLAG-NIRF蛋白,利用GST pull down技术鉴定HBc与NIRF蛋白的相互作用。利用PCR技术分别扩增HBc编码框和NIRF基因全长,并将其分别插入到原核表达载体pGEX-4T-1和真核表达载体p3*FLAG-CMV-10中,构建出pGST-HBc及pFLAG-NIRF。pFLAG-NIRF转染HEK293,培养48 h,收获前10 h加入MG132抑制蛋白酶体,收获细胞,经NP40裂解后离心收集上清pGST-HBc转化BL21(DE3)细菌,优化培养条件使GST-HBc在上清中大量表达,然后用GST4Bgel亲合纯化该蛋白,结合有GST-HBc蛋白与含FLAG-NIRF的细胞上清孵育后,离心收集GST 4Bgel,经洗脱液洗脱后蛋白电泳,western blotting分析。构建了pGST-HBc及pFLAG-NIRF,在上清中成功表达GST-HBc并纯化该蛋白,在细胞中成功表达FLAG-NIRF,GST pull down结果显示两者存在体外相互结合。HBc与NIRF能够在细胞外发生相互结合。 展开更多

关键词 HBC NIRF 相互作用 GST PULL down

在线阅读 下载PDF 职称材料

内质网应激对ATF6调控XBP1启动子转录的影响 被引量：11

16

作者 赵文君 朱慧芳 +3 位作者 周菁华 李祥柱 刘艳娜 郭风劲 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第4期317-321,共5页

目的确定XBP1启动子的转录核心区域,探讨激活转录因子6(ATF6)在内质网应激(ERS)与非ERS状态下对XBP1启动子转录活性的调控作用。方法采用基因重组技术构建ATF6基因及两个缺失体ATF6s1p、ATF6s2p的真核表达载体pcDNA3.1(-)-ATF6、pcDNA3.... 目的确定XBP1启动子的转录核心区域,探讨激活转录因子6(ATF6)在内质网应激(ERS)与非ERS状态下对XBP1启动子转录活性的调控作用。方法采用基因重组技术构建ATF6基因及两个缺失体ATF6s1p、ATF6s2p的真核表达载体pcDNA3.1(-)-ATF6、pcDNA3.1(-)-s1p、pcDNA3.1(-)-s2p,以及XBP1启动子报告基因载体pGL3-XBP1。针对XBP1启动子的各个组成元件设计和构建XBP1一系列截短体的报告基因载体。采用双荧光素酶报告基因法检测并确定XBP1启动子的核心启动子区,Western blotting检测ATF6及缺失体s2p、s1p在ERS与非ERS状态下对XBP1核心启动子区转录的调控作用。结果 XBP1启动子的-407bp-+133bp区域是转录活性调控的核心区域,-2000bp--407bp区域不具有转录活性,该区域可能含有抑制转录活性的组成元件。非ERS状态时,ATF6及两个缺失体s2p、s1p可明显上调XBP1启动子的转录活性及XBP1蛋白表达;而在ERS状态时,ATF6及两个缺失体s2p、s1p下调了XBP1启动子的转录活性和XBP1蛋白表达。结论 ATF6对XBP1的转录调控作用在ERS状态和非ERS状态下存在差异。非ERS状态时,ATF6上调XBP1的转录和表达,而ERS状态时,ATF6下调XBP1的转录和表达。 展开更多

关键词 激活转录因子6 基因表达调控 转录启动子

在线阅读 下载PDF 职称材料

应用于PCR及实时荧光定量PCR的细菌DNA提取方法 被引量：11

17

作者 胡晓红 刘昕 +4 位作者 黄正根 彭惠民 袁科 程英 高云 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第7期734-735,共2页

目的建立特异灵敏的适应于PCR及实时荧光定量PCR的细菌DNA提取方法。方法于细菌样本离心所得沉淀中加入提取液(25%Chelex-100,0·5%NP40,TE配制,pH=9·0);56℃孵育30min;100℃水浴10min;离心后所得上清即为DNA。电泳、PCR及Real... 目的建立特异灵敏的适应于PCR及实时荧光定量PCR的细菌DNA提取方法。方法于细菌样本离心所得沉淀中加入提取液(25%Chelex-100,0·5%NP40,TE配制,pH=9·0);56℃孵育30min;100℃水浴10min;离心后所得上清即为DNA。电泳、PCR及Real-time PCR扩增评价该方法的特异性及灵敏度。结果本方法所提细菌DNA电泳条带清晰,未见假阳性,D(260)/D(280)=(1·79±0·03);PCR及Real-time PCR扩增未见假阳性及假阴性,灵敏度达101/ml细菌浓度。结论本研究细菌DNA提取方法特异灵敏,适应于PCR及Real-time PCR。 展开更多

关键词 PCR 实时荧光定量PCR DNA提取

在线阅读 下载PDF 职称材料

NIRF对P53蛋白泛素化作用的研究 被引量：12

18

作者 段昌柱 蒲淑萍 +2 位作者 TSUTOMU MORI HIDEO KOCHI 邱宗荫 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2006年第2期163-168,共6页

HEK293和HeLa细胞分别被Np95/ICBP90-likeRINGfingerprotein(NIRF)和P53转染后,细胞上清和免疫沉淀产物用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳免疫印迹法分析;细菌合成GST-P53后,用GSTpull-down技术检测NIRF与P53相互作用;在GST-P53、E1、E2和NIRF... HEK293和HeLa细胞分别被Np95/ICBP90-likeRINGfingerprotein(NIRF)和P53转染后,细胞上清和免疫沉淀产物用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳免疫印迹法分析;细菌合成GST-P53后,用GSTpull-down技术检测NIRF与P53相互作用;在GST-P53、E1、E2和NIRF体外泛素化反应系统中,检测NIRF对P53的体外泛素化.结果表明:NIRF能与P53相互作用,NIRF不仅能与P53特异性结合,而且还会将P53泛素化,这种相互作用在细胞内和细胞外均能发生.推测NIRF可能是P53的一个新的负调节蛋白. 展开更多

关键词 NIRF P53 GST pull-down 泛素化

在线阅读 下载PDF 职称材料

BiP调控IRE1启动子转录活性及蛋白表达的效应 被引量：4

19

作者 周菁华 韩晓凤 +2 位作者 刘艳娜 张鹏 郭风劲 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期343-351,共9页

正常条件下,外分泌或者跨膜的蛋白需要在内质网中完成正确的折叠。在营养缺乏、分化或其他应激状态下,内质网中的蛋白质会发生错误折叠并不断积聚,形成内质网应激(Endoplasmic reticulum stress),引发未折叠蛋白反应(Unfolded protein r... 正常条件下,外分泌或者跨膜的蛋白需要在内质网中完成正确的折叠。在营养缺乏、分化或其他应激状态下,内质网中的蛋白质会发生错误折叠并不断积聚,形成内质网应激(Endoplasmic reticulum stress),引发未折叠蛋白反应(Unfolded protein response)。内质网应激条件下,内质网腔中的分子伴侣结合免疫球蛋白BiP(Binding immunoglobulin protein)与需肌醇酶IRE1(Inositol-requiring kinase 1)解离并与未折叠蛋白结合从而帮助蛋白形成正确结构;同时未折叠蛋白通过与跨膜蛋白IRE1直接结合活化其内切核糖核酸酶结构域,活化的IRE1能够剪切Xbp1的mRNA使其形成有活性的转录因子进而起始分子伴侣与未折叠蛋白反应相关蛋白的表达使细胞脱离内质网应激状态。文章克隆了IRE1的启动子用荧光素酶报告基因法检测到BiP能够上调IRE1的启动子活性。通过构建IRE1启动子一系列截短体的报告基因载体确定了IRE1启动子活性的核心区域进一步通过逆转录PCR和免疫印迹在mRNA水平和蛋白水平分别检测BiP对IRE1启动子的调控作用。结果发现在内质网应激条件下分子伴侣BiP通过上调IRE1启动子转录活性增加IRE1的表达进而提高细胞处理内质网应激时未折叠蛋白的能力为揭示内质网应激条件下BiP调控IRE1转录调控机制提供理论依据,同时为阐明ER stress各信号分子之间的作用机制奠定实验基础。 展开更多

关键词 BIP IRE1 内质网应激 未折叠蛋白反应

在线阅读 下载PDF 职称材料

糖尿病肾病循环microRNA差异表达谱的分析 被引量：7

20

作者 彭睿 查何 +2 位作者 周吉 彭惠民 张政 《西南大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2014年第11期75-82,共8页

为了解循环microRNA在早期糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)发病机制中的作用,该文采用芯片筛查结合real-time PCR检测早期糖尿病肾病患者循环microRNA差异表达谱,同时应用生物信息学方法预测差异表达谱microRNA的靶基因.结果表明:... 为了解循环microRNA在早期糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)发病机制中的作用,该文采用芯片筛查结合real-time PCR检测早期糖尿病肾病患者循环microRNA差异表达谱,同时应用生物信息学方法预测差异表达谱microRNA的靶基因.结果表明:芯片筛查出49个microRNA在DN中呈差异表达,其中信号值在两组中均大于1 000的microRNA有22个,17个上调,5个下调.选择其中差异倍数大于2的5个microRNA进行realtime PCR验证,结果与芯片结果一致,分别为let-7a,let-7d,let-7f和miR-363在DN中低表达,miR-4429在DN中高表达.同时,应用生物信息学技术预测了5个microRNA的靶基因,主要涉及细胞代谢过程调控、生长因子反应和细胞增殖等的相关基因.DN差异表达谱的建立为探寻microRNA发病中的作用以及DN的早期诊治提供了新的思路. 展开更多

关键词 糖尿病肾病 MICRORNA 表达谱

在线阅读 下载PDF 职称材料