不可分型流感嗜血杆菌重组Hap蛋白的表达及其生物学活性分析 被引量：3

1

作者 姚锋 李婉宜 +4 位作者 邝玉 李明远 丰锋 冯伟 张强 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第5期953-956,共4页

目的在原核系统中表达并纯化不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)的重要粘附因子Hap蛋白,并对其免疫原性和粘附活性进行初步研究。方法 IPTG诱导重组质粒pET32a(+)-Hap在E.coliBL21中高效表达,Ni2+亲和层析柱纯化表达产物。用纯化的Hap重组蛋白... 目的在原核系统中表达并纯化不可分型流感嗜血杆菌(NTHi)的重要粘附因子Hap蛋白,并对其免疫原性和粘附活性进行初步研究。方法 IPTG诱导重组质粒pET32a(+)-Hap在E.coliBL21中高效表达,Ni2+亲和层析柱纯化表达产物。用纯化的Hap重组蛋白进行体外竞争黏附实验,SEM观察及菌落形成单位计数法分析该重组蛋白的黏附活性。纯化蛋白与黏膜免疫佐剂CT-B联合鼻腔免疫BALB/C小鼠,ELISA检测小鼠抗Hap的IgA及IgG抗体水平。结果纯化产物的SDS-PAGE分析显示获得单一的目的蛋白条带,Gelanalysis软件分析蛋白纯度可达85%,纯化产物超滤浓缩后,测得其蛋白浓度为3.2g/L。体外竞争黏附实验观察到Hap重组蛋白的加入可明显抑制NTHi对胞外基质的黏附,且细菌黏附量的减少与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.01)。该重组蛋白与免疫佐剂CT-B联合免疫小鼠,可刺激机体产生较高水平的IgG或IgA抗体,与重组抗原单独免疫组相比,差异具有显著性(P<0.05)。结论 Hap蛋白在原核系统中获得较高浓度和纯度的表达,纯化Hap重组蛋白具有良好的免疫原性和粘附活性。 展开更多

关键词 不可分型流感嗜血杆菌 Hap重组蛋白 免疫原性 粘附活性

在线阅读 下载PDF 职称材料

抗人SOCS3单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定 被引量：3

2

作者 陈长春 李婉宜 +2 位作者 章崇杰 魏大鹏 邝玉 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第11期1778-1780,1783,共4页

目的制备高效价的抗人SOCS3单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法以重组GST-SOCS3融合蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0细胞融合,经多次筛选及克隆化,建立可稳定分泌抗SOCS3单克隆抗体的杂交瘤细胞株。用ELISA及Western blot... 目的制备高效价的抗人SOCS3单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法以重组GST-SOCS3融合蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0细胞融合,经多次筛选及克隆化,建立可稳定分泌抗SOCS3单克隆抗体的杂交瘤细胞株。用ELISA及Western blot鉴定单克隆抗体的特性,并测定其效价、Ig亚类及相对亲和力。结果筛选到一株可稳定分泌抗人SOCS3单克隆抗体的杂交瘤细胞株。Western blotting显示在相对分子质量为6.3×104处出现特异性反应带。杂交瘤细胞培养上清效价为1∶640,腹水效价为1∶25600,Ig亚类为IgG2a,相对亲和力达4.84×106L/mol。结论成功制备能特异性识别人SOCS3的单克隆抗体,为进一步研究人体细胞因子信号传导的负反馈调节及SOCS3在微生物感染中的免疫调节作用奠定了基础。 展开更多

关键词 SOCS3 单克隆抗体 抗体制备 杂交瘤细胞

在线阅读 下载PDF 职称材料

中国口腔医学各专业实习生对乙型肝炎病毒感染知、信、行情况调查 被引量：2

3

作者 李昕怡 梅朝蓉 +4 位作者 邝玉 黄留叶 杨婷 李明远 杨远 《国际口腔医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第2期135-140,共6页

目的调查及比较中国口腔医学不同专业实习生对于乙型肝炎病毒(HBV)感染的知识、态度、行为(KAB)。方法对232名进入临床实习阶段的口腔实习生进行问卷调查,采用数据描述及双变量分析的方法得出KAB与不同专业及性别之间的关系。结果在各... 目的调查及比较中国口腔医学不同专业实习生对于乙型肝炎病毒(HBV)感染的知识、态度、行为(KAB)。方法对232名进入临床实习阶段的口腔实习生进行问卷调查,采用数据描述及双变量分析的方法得出KAB与不同专业及性别之间的关系。结果在各专业口腔实习生中,超过80%的调查对象具有"较高"或者"高"的知识等级,其中修复科实习生的知识得分高于口腔内科(P=0.035)和口腔外科(P=0.01987)。口腔内科实习生的态度与是否接触HBV感染患者有关(P=0.006),口腔外科亦然(P=0.047)。超过60%的实习生接受过至少3次的乙肝疫苗接种,特别是正畸科实习生(约80%);34%的口腔内科实习生表示"总是"或者"经常"检查抗体滴度,但66%的正畸科实习生表示"很少"或者"从不";正畸科实习生比口腔内科的针头扎伤率低(P=0.044),与口腔外科相比,有相对较低的趋势(P=0.053);100%的正畸科实习生"总是"使用工作服。此外,口腔内科实习生相比于口腔外科(P=2.31e^(-6)),修复科(P=1.704e^(-7))及正畸科(P=1.3e^(-5))实习生来说,行为得分更高,女性学生的行为得分显著高于男性学生(P=2.584e^(-5))。结论修复科实习生应掌握更多关于HBV传播的知识,正畸科实习生应提升疫苗注射率及检查抗体滴度,口腔内科实习生应更注重理论与实践结合,口腔外科实习生可提升自我效能及保持积极态度。 展开更多

关键词 乙型肝炎病毒 知、信、行 口腔实习生 专业 调查研究

在线阅读 下载PDF 职称材料

QS系统中LasR和RhlR蛋白对铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响以及免疫原性研究(英文) 被引量：13

4

作者 谢轶 曾蔚 +6 位作者 贾文祥 杨发龙 杨维青 程曦 康梅 王兰兰 张再容 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2006年第1期31-38,共8页

为探讨铜绿假单胞菌 PAO1 中 lasR 和 rhlR 基因表达产物的分子生物学特性,研究它们对铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响以及对小鼠的免疫保护效果,采用聚合酶链式反应 (PCR) 方法扩增铜绿假单胞菌标准株 PAO1 中的 lasR 和 rhlR 基因,全... 为探讨铜绿假单胞菌 PAO1 中 lasR 和 rhlR 基因表达产物的分子生物学特性,研究它们对铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响以及对小鼠的免疫保护效果,采用聚合酶链式反应 (PCR) 方法扩增铜绿假单胞菌标准株 PAO1 中的 lasR 和 rhlR 基因,全自动荧光测序仪测序,并用 Blast 方法检测克隆片段. 利用 pGEX4T-1 载体分别构建 lasR/rhlR-pGEX4T-1 重组质粒,在大肠杆菌 BL21(DE3)中诱导表达,并经过免疫印迹实验验证其生物学活性. 用硅胶膜培养法建立生物被膜模型,诱导转入了pGFPuv 质粒的铜绿假单胞菌 PAG0305 形成生物被膜,并测定 LasR 蛋白和 RhlR 蛋白对生物被膜形成的影响. 同时用纯化的重组蛋白免疫小鼠,菌落计数法检测免疫组和对照组鼠肺对铜绿假单胞菌的清除率. 以 PAO1 染色体 DNA 为模板的 PCR 结果显示,lasR 的全基因序列为 720 bp,rhlR 基因序列为 726 bp,经序列分析和同源性比较分别与 GenBank 中 lasR/rhlR 基因(登录号:M59425; AE004768) 的同源性为 100%. 大肠杆菌 BL21 (DE3) 分别转化重组质粒 lasR/rhlR-pGEX4T-1 后,经 IPTG诱导和 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,表达的融合蛋白分子质量均为 54 ku 左右,与预期蛋白质分子质量相同. 荧光显微镜观察和测定结果表明,在硅胶膜上 PAG0305 能够形成典型的发荧光的生物被膜,LasR 或 RhlR 蛋白 (10 mg/L) 存在的情况下,PAG0305 生物被膜的形成速度在前三天比对照组平均提高 40.77%,而且两蛋白单独存在与同时存在时的作用相同. 体内实验中,免疫小鼠肺部对铜绿假单胞菌的清除率显著高于未经免疫的正常组 (P < 0.05). 上述结果表明:构建的lasR/rhlR-pGEX4T-1 重组质粒能够在大肠杆菌 BL21(DE3)中成功地表达并具有生物学活性. LasR/RhlR 蛋白在体外模型中能够加快铜绿假单胞菌生物被膜的形成速度,是调节铜绿假单胞菌生物被膜形成的重要因素之一. 免疫结果表明,重组蛋白对小鼠表现出一定的保护作用,这为进一步开展疫苗研究奠定了基础. 展开更多

关键词 铜绿假单胞菌 数量感知系统 生物被膜 免疫原性

在线阅读 下载PDF 职称材料

鼠β-防御素2(mBD2)真核表达质粒的构建及稳定表达株的鉴定 被引量：7

5

作者 魏晓丽 施桥发 +3 位作者 李虹 李婉宜 蒋忠华 李明远 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期28-31,共4页

目的:对小鼠β防御素-2(mBD2)基因进行克隆,构建其真核表达载体,筛选出稳定表达细胞株,并研究mBD2的生物学特性及其抗肿瘤机制。方法:通过向BALB/c小鼠腹腔注射内毒素(LPS),建立小鼠急性时相反应,取其肺组织提取总RNA,采用RT-PCR方法扩... 目的:对小鼠β防御素-2(mBD2)基因进行克隆,构建其真核表达载体,筛选出稳定表达细胞株,并研究mBD2的生物学特性及其抗肿瘤机制。方法:通过向BALB/c小鼠腹腔注射内毒素(LPS),建立小鼠急性时相反应,取其肺组织提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增小鼠mBD2基因,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后插入相同酶切的pcDNA3.1(+)真核表达载体,对其进行酶切和测序鉴定。将构建好的真核表达质粒pcDNA3.1(+)/mBD2转染SiHa细胞,采用G418进行稳定表达株的筛选,用免疫荧光染色和RT-PCR鉴定细胞内mBD2蛋白表达情况。结果:提取小鼠肺组织总RNA,采用RT-PCR方法扩增了250bp左右的产物,通过EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)/mBD2。SiHa被该质粒转染后,在100mg/LG418浓度下筛选20d,得到了稳定表达mBD2的细胞株,用免疫荧光染色显示mBD2蛋白在胞质中有大量表达,RT-PCR反应扩增到了mBD2的mRNA。结论:成功地构建了pcDNA3.1(+)/mBD2真核表达质粒,mBD2蛋白在SiHa细胞中能稳定表达,这些结果为进一步深入研究mBD2的生物学特性及其抗肿瘤的作用奠定了基础。 展开更多

关键词 mBD2 真核表达 免疫荧光 RT-PCR

在线阅读 下载PDF 职称材料

维生素C对病毒灭活中血浆蛋白活性的保护效应 被引量：11

6

作者 李燕 李明远 +1 位作者 蒋仁举 贾文祥 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 2006年第2期392-396,共5页

本研究探测在亚甲蓝(methyleneblue,MB)光化学法处理单份血浆过程中,加入维生素C(vitamineC,VitC)是否影响病毒的灭活效果,是否对血浆蛋白活性成分具有保护作用。用水泡性口炎病毒(vesicularstomatitisvi-rus,VSV)作为指示病毒,在人血... 本研究探测在亚甲蓝(methyleneblue,MB)光化学法处理单份血浆过程中,加入维生素C(vitamineC,VitC)是否影响病毒的灭活效果,是否对血浆蛋白活性成分具有保护作用。用水泡性口炎病毒(vesicularstomatitisvi-rus,VSV)作为指示病毒,在人血浆中加入不同浓度VitC和终浓度为1μmol/L的亚甲蓝,应用40000lx荧光强度照射并于不同时间取样检测。以细胞病变效应评价对VSV的灭活效果,用RT-PCR检测病毒核酸的变化,并采用Clauss法、一期法和微量免疫电泳等方法对亚甲蓝光化学法处理前后的血浆蛋白含量和活性进行分析。结果发现,VSV血浆在加入240μmol/LVitC并经MB-光照60分钟后,病毒滴度下降>8lgTCID50/ml;RT-PCR法也检测不到病毒核酸;血浆中的纤维蛋白原和凝血因子Ⅷ的回收率分别为83.55%和81.67%,与不加VitC进行亚甲蓝光化学法处理结果相比有显著提高(P<0.05);微量免疫电泳显示,血浆中的大部分蛋白成分含量没有明显改变,免疫原性也未受到明显影响。结论:血浆中加入一定量的VitC不仅不影响亚甲蓝光化学法对病毒的灭活效果,而且有效地保护了血浆蛋白活性成分,因此VitC可作为亚甲蓝光化学法处理血浆时的保护剂,能有效地提高单份新鲜冷冻血浆的质量。 展开更多

关键词 维生素C 亚甲蓝光化学法 病毒灭活 血浆蛋白

在线阅读 下载PDF 职称材料

ST6Gal I基因特异性siRNA对SW480细胞黏附和侵袭力的影响 被引量：3

7

作者 苑天红 李明远 +2 位作者 李婉宜 李虹 蒋忠华 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第1期39-41,45,共4页

目的:探讨人α-2,6-唾液酸转移酶(ST6GalI)小分子干扰RNA(siRNA)对ST6GalI高表达的结肠癌SW480细胞株的黏附和侵袭力的影响。方法:设计并合成ST6GalI靶向的siRNA,用脂质体Lipofectamine2000包裹后转染SW480细胞。实验设空白对照组、脂... 目的:探讨人α-2,6-唾液酸转移酶(ST6GalI)小分子干扰RNA(siRNA)对ST6GalI高表达的结肠癌SW480细胞株的黏附和侵袭力的影响。方法:设计并合成ST6GalI靶向的siRNA,用脂质体Lipofectamine2000包裹后转染SW480细胞。实验设空白对照组、脂质体对照组、非特异性siRNA组和ST6GalIsiRNA组,采用RT-PCR测定细胞中ST6GalImRNA表达水平,流式细胞术检测细胞表面α-2,6-唾液酸含量,并分别用CytoMatrixTM细胞黏附试剂盒及细胞侵袭分析试剂盒,检测细胞对细胞外基质(ECM)黏附与侵袭力。结果:与空白对照组、脂质体对照组、非特异性siRNA组相比,转染48h后,ST6GalIsiRNA组细胞中ST6GalImRNA表达明显下调;转染72h后,ST6GalIsiRNA组细胞表面α-2,6-唾液酸的含量及细胞对ECM的黏附和侵袭力均明显低于其他3个对照组(P<0.05)。结论:化学合成的靶向ST6GalI的siRNA能够下调SW480细胞中ST6GalI基因的表达,降低细胞对ECM的黏附和侵袭力。本实验为进一步研究应用RNA干扰技术抗肿瘤治疗奠定基础。 展开更多

关键词 SIRNA 结肠肿瘤 唾液酸转移酶 黏附 肿瘤侵袭力

在线阅读 下载PDF 职称材料

ureI和ctB-ureI真核质粒构建及表达分析 被引量：3

8

作者 王保宁 杨远 +3 位作者 邝玉 曹康 李明远 李婉宜 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第8期764-766,770,共4页

目的：构建ureI和ctB—ureI真核表达质粒并分析其在细胞的表达情况。方法：用pIRES-RD2真核表达载体分别在5’端连接ureI和ctB—ureI基因，经双酶切和测序鉴定正确后，相应质粒用脂质体转染HEK293T细胞，用荧光显微镜观察荧光标签，确... 目的：构建ureI和ctB—ureI真核表达质粒并分析其在细胞的表达情况。方法：用pIRES-RD2真核表达载体分别在5’端连接ureI和ctB—ureI基因，经双酶切和测序鉴定正确后，相应质粒用脂质体转染HEK293T细胞，用荧光显微镜观察荧光标签，确定质粒的转染率；用人抗幽门螺旋杆菌抗体和马抗CtB抗体，采用免疫荧光和免疫酶组织化学等方法研究该两种真核表达质粒在细胞中目的蛋白表达情况。结果：成功构建了ureI和ctB—ureI的真核表达质粒pIRES—RD2-ureI和pIRES-RD2-ctB—ureI，用此质粒转染HEK293T细胞48～72h后，荧光显微镜显示该两种质粒的转染率约为80％；用免疫荧光和免疫酶组织化学方法表明了该两种基因均能在HEK293T细胞表达并有免疫反应性，表达的ureI主要分布在胞质内或细胞膜附近，ctB—ureI在CtB信号肽引导下分布于HEK293T细胞质、细胞膜附近以及细胞外。结论：成功构建了真核载体pIRES2-DsRed2-ureI和pIRES2-DsRed2-ctB—ureI，目的蛋白表达于HEK293T细胞胞质内并有一定免疫反应性。 展开更多

关键词 尿素膜通道蛋白(ureI) 霍乱毒素B亚单位与尿素膜通道蛋白融合(CtB-ureI) 真核表达

在线阅读 下载PDF 职称材料

HPV16 E5蛋白原核表达、鉴定及真核表达稳定株的筛选 被引量：2

9

作者 施桥发 魏晓丽 +5 位作者 李虹 王保宁 张卫东 蒋忠华 曹康 李明远 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期31-35,共5页

目的研究HPV16 E5蛋白的生物学特性及其细胞转化机制,对HPV16 E5蛋白原核和真核表达质粒进行构建、表达和鉴定。方法以临床确诊的HPV16感染患者子宫颈细胞DNA为模板,采用PCR方法扩增HPV16 E5基因,经 BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切后插入相同酶... 目的研究HPV16 E5蛋白的生物学特性及其细胞转化机制,对HPV16 E5蛋白原核和真核表达质粒进行构建、表达和鉴定。方法以临床确诊的HPV16感染患者子宫颈细胞DNA为模板,采用PCR方法扩增HPV16 E5基因,经 BamH Ⅰ和HindⅢ双酶切后插入相同酶切的pET32a(+)载体,转染JM109感受态细胞,并进行阳性克隆筛选。经IPTG 对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS-PAGE和Westem blotting检测目标蛋白表达情况。将BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切 pET32(+)／E5质粒后取得的E5全基因片段转入pcDNA3．1(+)空质粒,构建pcDNA3．1(+)／E5真核表达质粒并对NIH3T3 细胞进行转染,最后用G418进行稳定表达株的筛选,并采用RT-PCR鉴定细胞内HPV16 E5基因表达情况。结果成功构建了原核表达质粒pET32／E5,在1 mmol／L IPTG、28℃诱导条件下BL21(DE3)菌体中HPV16E5-TRX融合蛋白占菌体总蛋白的10％左右。真核表达质粒pcDNA3．1(+)／E5在成功转染NIH3T3细胞后于250μg/ml G418浓度时筛选21 d得到了E5基因稳定表达株,RT-PCR产物测序得到了HPV16 E5基因全序列。结论成功构建了pET32／E5原核和 pcDNA3．1(+)／E5真核表达质粒,HPV16E5蛋白在大肠杆菌和NIH3T3细胞中的稳定表达,这些结果为进一步深入研究HPV16 E5蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用奠定了坚实基础。 展开更多

关键词 HPV16 原核表达 SDS-PAGE 免疫印迹 RT-PCR

在线阅读 下载PDF 职称材料

小鼠β-防御素2与甲型流感病毒HA1融合基因真核载体的构建与表达 被引量：2

10

作者 朱元军 张卫东 +4 位作者 李虹 王丰平 钟利 蒋忠华 李明远 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期8-10,15,共4页

目的:构建小鼠β-防御素2(mBD2)与甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)血凝素(HA1)基因融合表达的真核载体,并检测其在HEK293细胞中的表达。方法:用PCR技术分别从质粒pcDNA3.1(+)/mBD2和pcDNA3.1(+)/HA1中扩增mBD2与HA1基因片段,再用重叠延伸PC... 目的:构建小鼠β-防御素2(mBD2)与甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)血凝素(HA1)基因融合表达的真核载体,并检测其在HEK293细胞中的表达。方法:用PCR技术分别从质粒pcDNA3.1(+)/mBD2和pcDNA3.1(+)/HA1中扩增mBD2与HA1基因片段,再用重叠延伸PCR法(overlap-PCR)将HA1与mBD2通过一段多肽接头Gly4Ser融合为mBD2-HA1。将mBD2-HA1融合基因插入真核表达载体pcDNA3.1(+),经酶切、PCR和测序鉴定正确后,用脂质体转入HEK293细胞,通过免疫荧光检测其瞬时表达。结果:融合基因mBD2-HA1的真核表达载体pcDNA3.1(+)/mBD2-HA1构建成功,并在HEK293细胞中成功表达融和蛋白。结论:融合基因mBD2-HA1真核表达载体的成功构建,为研究防御素在流感病毒核酸疫苗中的佐剂作用奠定了基础。 展开更多

关键词 Β-防御素 流感病毒 融合基因 重叠延伸PCR 免疫荧光

在线阅读 下载PDF 职称材料

hTR-siRNA腺病毒的构建及其体外抗肿瘤的初步研究 被引量：2

11

作者 李燕 肖丽英 +5 位作者 姚刚 李虹 杨志伟 李婉宜 蒋忠华 李明远 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期570-573,共4页

目的:构建RNA干扰(RNAi)腺病毒,通过体外实验观察其抑制肿瘤细胞中人端粒酶RNA(hTR)基因表达、降低瘤细胞中的端粒酶活性、以及促进肿瘤细胞凋亡等作用。方法:首先用一种新的体外连接法构建腺病毒Ad-hTR-siR-NA,表达靶向hTR的小干扰RNA... 目的:构建RNA干扰(RNAi)腺病毒,通过体外实验观察其抑制肿瘤细胞中人端粒酶RNA(hTR)基因表达、降低瘤细胞中的端粒酶活性、以及促进肿瘤细胞凋亡等作用。方法:首先用一种新的体外连接法构建腺病毒Ad-hTR-siR-NA,表达靶向hTR的小干扰RNA分子(siRNA),用100MOI的重组腺病毒感染不同的肿瘤细胞系,再用TRAP-ELISA法测定细胞端粒酶活性、Real-timePCR测定hTR的mRNA水平、流式细胞术(FCM)测定肿瘤细胞凋亡率及人端粒酶反转录酶(hTERT)的蛋白变化。结果:感染了Ad-hTR-siRNA的肿瘤细胞的端粒酶活性明显降低,其中以HeLa细胞降低最明显,其端粒酶活性抑制率达到58.87%,hTR的mRNA表达下调70.21%,细胞凋亡率为29.7%,但hTERT的蛋白表达并不被阻断。结论:Ad-hTR-siRNA可以有效、特异地抑制hTR基因表达,诱导体外培养的肿瘤细胞凋亡,具有抗肿瘤活性;此结果提示Ad-hTR-siRNA在肿瘤基因治疗方面具有潜在的应用价值。 展开更多

关键词 HTR 腺病毒 RNA干扰 端粒酶 抗肿瘤作用

在线阅读 下载PDF 职称材料

产金属酶铜绿假单胞菌携带Ⅰ类整合子的研究 被引量：2

12

作者 程曦 杜宝中 +5 位作者 范红 陶传敏 刘梅 张磊 谢轶 贾文祥 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第6期792-794,共3页

目的研究产金属酶铜绿假单胞菌携带Ⅰ类整合子及其基因盒的情况。方法收集铜绿假单胞菌68临床株,进行金属酶IMP-1、VIM基因的PCR检测,选取阳性株再作第Ⅰ类整合酶基因的PCR检测,然后选取整合酶基因阳性株进行Ⅰ类整合子相关基因盒的PCR... 目的研究产金属酶铜绿假单胞菌携带Ⅰ类整合子及其基因盒的情况。方法收集铜绿假单胞菌68临床株,进行金属酶IMP-1、VIM基因的PCR检测,选取阳性株再作第Ⅰ类整合酶基因的PCR检测,然后选取整合酶基因阳性株进行Ⅰ类整合子相关基因盒的PCR检测。结果PCR检测出68株铜绿假单胞菌中的1株同时含有IMP-1基因和Ⅰ类整合子基因盒;55株含有VIM基因,其中26株含有Ⅰ类整合酶基因,在这26株中只有18株含有Ⅰ类整合子基因盒,根据电泳条带可分为5种类别。结论首次在中国西南地区发现产IMP-1并同时带有Ⅰ类整合子的铜绿假单胞菌。Ⅰ类整合子在产金属酶铜绿假单胞菌中分布广泛,基因盒携带率为69.2%,对细菌的耐药性传播具有重要意义。 展开更多

关键词 铜绿假单胞菌 金属酶 整合子 整合子相关基因盒

在线阅读 下载PDF 职称材料

非分型流感嗜血杆菌Hap_s蛋白的分离纯化 被引量：2

13

作者 李婉宜 邝玉 +4 位作者 李明远 杨远 蒋中华 姚锋 陈长春 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第12期1880-1883,共4页

目的优化非分型流感嗜血杆菌Haps蛋白质片段的分离纯化方法。方法采用盐析、透析脱盐、超滤浓缩、弱阳离子交换柱Hitrap CM Sepharose Fast Flow层析纯化Haps蛋白,优化Haps蛋白质片段的洗脱条件,包括pH值和离子强度,测定各洗脱液样品在2... 目的优化非分型流感嗜血杆菌Haps蛋白质片段的分离纯化方法。方法采用盐析、透析脱盐、超滤浓缩、弱阳离子交换柱Hitrap CM Sepharose Fast Flow层析纯化Haps蛋白,优化Haps蛋白质片段的洗脱条件,包括pH值和离子强度,测定各洗脱液样品在280nm波长处的光吸收值(D280),用折线图显示,SDS-PAGE电泳检测分布图中处于峰值的样品,观察目的蛋白条带的出现。结果弱阳离子交换柱Hitrap CM Sepharose Fast Flow层析纯化HapS蛋白,缓冲液1洗脱液的D280分布为基线,缓冲液2洗脱液的D280分布折线图中有峰值出现,但峰有拖尾,SDS-PAGE电泳检测该洗脱峰主要为低分子量的蛋白条带;五种不同离子强度的缓冲液3洗脱液在100mmol/LNaCl离子强度时,D280的分布折线图显示有较高洗脱峰出现,SDS-PAGE电泳检测该洗脱峰有较明显的110000D的目的条带,其余离子强度下均未见明显洗脱峰出现。结论Sepharose CM FF层析柱分离纯化HapS蛋白质片段时,不同pH值的缓冲液对目的蛋白的洗脱没有明显影响,而主要影响杂蛋白的洗脱;100mmol/LNaCl离子强度的缓冲液3洗脱液获得较好的洗脱效果。 展开更多

关键词 Haps蛋白 阳离子交换层析 蛋白纯化

在线阅读 下载PDF 职称材料

靶向ST6GalI的siRNA与反义寡核苷酸联合应用对结肠癌细胞转移能力的影响 被引量：1

14

作者 苑天红 李明远 +2 位作者 李婉宜 李虹 蒋忠华 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第2期136-140,共5页

目的探讨人α2,6-唾液酸转移酶(ST6GalI)小分子干扰RNA(siRNA)及其与相同或不同靶点的反义寡核苷酸(ASO)联合应用,对ST6GalI高表达的结肠癌SW480细胞的粘附和侵袭力的影响。方法设计并合成靶向ST6GalI的siRNA及ASO,用脂质体Lipofectamin... 目的探讨人α2,6-唾液酸转移酶(ST6GalI)小分子干扰RNA(siRNA)及其与相同或不同靶点的反义寡核苷酸(ASO)联合应用,对ST6GalI高表达的结肠癌SW480细胞的粘附和侵袭力的影响。方法设计并合成靶向ST6GalI的siRNA及ASO,用脂质体Lipofectamine2000包裹后转染SW480细胞。实验分为空白对照组、脂质体对照组、siRNA组、ASO1组(与siRNA不同靶点)、ASO2组(与siRNA相同靶点)、siRNA+ASO1组及siRNA+ASO2组,应用RT-PCR测定细胞中ST6GalImRNA水平,流式细胞术检测细胞表面α2,6-唾液酸含量,分别用CytoMatrixTM细胞粘附试剂盒及细胞侵袭分析试剂盒,检测细胞对细胞外基质的粘附与侵袭力。结果siRNA组、ASO1组、ASO2组、siRNA+ASO1组、siRNA+ASO2组中,SW480细胞的ST6GalImRNA表达水平、细胞表面α2,6-唾液酸含量及细胞对ECM的粘附与侵袭力均明显低于空白对照组、脂质体对照组(P<0.05),以siRNA+ASO1组最明显,且siRNA+ASO1组与siRNA组比较,差异有统计学意义(P<0.05),而siRNA+ASO2组与siRNA组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论化学合成的靶向ST6GalI的siRNA能够下调SW480细胞中ST6GalI基因的表达,继而降低细胞对ECM的粘附和侵袭力,并且与不同靶点的ASO联合应用具有相加和协同效应。 展开更多

关键词 RNA 小分子干扰 反义寡核苷酸 唾液酸转移酶 结肠肿瘤

在线阅读 下载PDF 职称材料

不可分型流感嗜血杆菌重组Hap蛋白免疫抗小鼠急性感染的实验研究 被引量：1

15

作者 李婉宜 王保宁 +5 位作者 左凤琼 曾蔚 丰锋 邝玉 蒋中华 李明远 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第7期635-637,641,共4页

目的：观察重组Hap蛋白免疫抗不可分型流感嗜血杆菌（NHTi）感染的免疫保护效果，初步探讨其保护机制。方法：用纯化的Hap重组蛋白与黏膜免疫佐剂霍乱肠毒素B亚单位（CT-B）联合鼻腔免疫C57BL／6小鼠。NHTi琼脂珠悬液对免疫小鼠进行气... 目的：观察重组Hap蛋白免疫抗不可分型流感嗜血杆菌（NHTi）感染的免疫保护效果，初步探讨其保护机制。方法：用纯化的Hap重组蛋白与黏膜免疫佐剂霍乱肠毒素B亚单位（CT-B）联合鼻腔免疫C57BL／6小鼠。NHTi琼脂珠悬液对免疫小鼠进行气管内注射，建立小鼠NHTi急性肺部感染模型。NHTi攻击5d后，收集实验小鼠的支气管肺泡灌洗液（BALF）进行白细胞计数，并取其肺组织进行肺部荷菌数检测及肺组织的病理检测。结果：Hap重组蛋白与CT—B的联合免疫能显著降低小鼠BALF中的白细胞总数、中性粒细胞渗出（P〈0．05）及感染小鼠肺组织内NTHi的荷菌数，并减轻感染小鼠支气管、细支气管周围及肺泡内的炎性浸润程度，明显改善其肺组织的病变。结论：鼻腔免疫的Hap重组蛋白在动物体内能发挥良好抗NTHi感染的免疫保护作用，为NTHi新型疫苗的研发提供了理论基础和实验依据。 展开更多

关键词 重组Hap蛋白 CT—B NTHi急性肺部感染模型 黏膜免疫

在线阅读 下载PDF 职称材料

甲型流感病毒M2e与CtB基因融合表达及其免疫特性初步研究 被引量：1

16

作者 杨晓芳 江滟 +4 位作者 李婉宜 邝玉 蒋忠华 王丰平 李明远 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期263-266,共4页

目的:构建真核表达重组质粒pcDNA 3.1a(+)-M2e/CtB,并初步研究其在NIH3T3细胞中的表达特性及免疫特性。方法:重叠PCR法扩增甲型流感病毒M2e基因和霍乱毒素CtB基因,将扩增得到的融合基因片段M2e-CtB定向克隆入真核表达载体pcDNA 3.1a(+)... 目的:构建真核表达重组质粒pcDNA 3.1a(+)-M2e/CtB,并初步研究其在NIH3T3细胞中的表达特性及免疫特性。方法:重叠PCR法扩增甲型流感病毒M2e基因和霍乱毒素CtB基因,将扩增得到的融合基因片段M2e-CtB定向克隆入真核表达载体pcDNA 3.1a(+)中,再转化E.coli JM109。将酶切鉴定、PCR扩增及序列鉴定正确的重组质粒命名为pcDNA3.1a(+)-M2e/CtB。用KEGEN TRANSⅢ阳离子聚合物将重组质粒pcDNA 3.1a(+)-M2e/CtB转染NIH3T3细胞,经免疫荧光、RT-PCR产物序列分析、Western blot检测其稳定表达产物。结果:重组质粒pcDNA 3.1a(+)-M2e/CtB含完整的M2e和CtB基因,与相对应基因的序列同源性分别为100%。重组质粒转染NIH3T3细胞后获得了有效表达,并且稳筛株细胞裂解物和上清均能用抗霍乱毒素抗体和抗流感病毒抗体检测到Mr约18000的蛋白条带。结论:成功构建了真核表达重组质粒pcDNA 3.1a(+)-M2e/CtB,初步证明其在体外表达的重组蛋白可分泌至胞外,且有M2e和CTB的双特异反应原性和免疫原性,为流感病毒核酸疫苗的进一步研究奠定了坚实基础。 展开更多

关键词 甲型流感病毒 M2e 黏膜免疫佐剂 霍乱毒素B亚单位 融合蛋白

在线阅读 下载PDF 职称材料

免疫毒素基因DT390真核表达载体的构建及功能研究 被引量：1

17

作者 陈文捷 李虹 +4 位作者 贾怡 张林 吕梅励 李明远 蒋中华 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第3期299-301,305,共4页

目的构建一种新型免疫毒素DT390-mIP10(白喉杆菌毒素390-小鼠γ干扰素诱导性蛋白10)基因的真核表达质粒,并对其功能进行初步研究。方法通过RT-PCR扩增mIP10基因,并插入到含有DT390基因片段的真核质粒SRα中,构建重组质粒。以PolyFect脂... 目的构建一种新型免疫毒素DT390-mIP10(白喉杆菌毒素390-小鼠γ干扰素诱导性蛋白10)基因的真核表达质粒,并对其功能进行初步研究。方法通过RT-PCR扩增mIP10基因,并插入到含有DT390基因片段的真核质粒SRα中,构建重组质粒。以PolyFect脂质体转染NIH3T3细胞,用免疫荧光检测重组质粒的表达;用MTT比色法测定重组免疫毒素质粒的生物学活性。结果构建了DT390-mIP10的真核表达载体SRα-DT390-mIP10,并在NIH3T3细胞中获得表达。表达的DT390-mIP10在体外能有效地杀伤活化的T细胞。结论免疫毒素基因重组真核表达载体DT390-mIP10的构建成功并在真核细胞中表达,为其在肿瘤及自身免疫性疾病治疗方面的进一步应用研究奠定了基础。 展开更多

关键词 免疫毒素 mIP10 DT390 真核表达

在线阅读 下载PDF 职称材料

小鼠β防御素2在MDCK细胞中的表达和抗流感病毒活性研究

18

作者 巩天祥 冯伟 +5 位作者 李婉宜 张强 戴军 裴德翠 蒋忠华 李明远 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第9期792-795,共4页

目的探索小鼠β防御素2(mouseβ-defensin 2,mBD2)表达载体在狗肾传代细胞(Madin-Darby canine kidney,MDCK)中的表达和抗甲型流感病毒(influenza Avirus,IAV)活性。方法将真核表达载体pcDNA3.1/mBD2利用脂质体法转染MDCK细胞,G418筛选... 目的探索小鼠β防御素2(mouseβ-defensin 2,mBD2)表达载体在狗肾传代细胞(Madin-Darby canine kidney,MDCK)中的表达和抗甲型流感病毒(influenza Avirus,IAV)活性。方法将真核表达载体pcDNA3.1/mBD2利用脂质体法转染MDCK细胞,G418筛选得到稳定转染的阳性细胞,用RT-PCR方法鉴定目的基因和免疫荧光法鉴定目的蛋白在转染细胞中的表达。用TCID50测定转染细胞的抗IAV活性。用pcDNA3.1/mBD2质粒免疫小鼠,观察死亡保护率。结果 pcDNA3.1/mBD2转染MDCK细胞后在细胞中稳定表达,转染细胞的TCID50比对照组的病毒效价降低近77.98倍;重组质粒免疫小鼠后,死亡保护率为55.55%。结论 mBD2能够在MDCK细胞中稳定表达,并且在体外及体内实验中显示出抗流感病毒活性,该结果为抗流感病毒制剂研究奠定了实验基础。 展开更多

关键词 小鼠β防御素2 表达载体 甲型流感病毒

在线阅读 下载PDF 职称材料

人源抗乳腺癌单链抗体ScFv的基因克隆

19

作者 杨春 贾文祥 +2 位作者 邱岳 郑崛村 李学儒 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第6期587-588,共2页

乳腺癌的发病率在我国呈上升趋势.鼠源性单克隆抗体(mAb)抗不适用于人体, 而人源化mAb则在乳腺癌的诊断、靶向治疗中具有较高的应用价值[1,2].为此,我们从乳腺癌细胞体外致敏乳腺癌患者外周血中分离的淋巴细胞, 利用噬菌体抗体库技术克... 乳腺癌的发病率在我国呈上升趋势.鼠源性单克隆抗体(mAb)抗不适用于人体, 而人源化mAb则在乳腺癌的诊断、靶向治疗中具有较高的应用价值[1,2].为此,我们从乳腺癌细胞体外致敏乳腺癌患者外周血中分离的淋巴细胞, 利用噬菌体抗体库技术克隆了人抗体基因, 以期获得抗乳腺癌的人源化单链抗体. 展开更多

关键词 乳腺癌 单链抗体 PCR

在线阅读 下载PDF 职称材料

甲型流感病毒NP基因真核载体的构建及初步表达 被引量：3

20

作者 钟利 李婉宜 +3 位作者 李明远 李虹 张卫东 蒋忠华 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期366-369,共4页

目的构建甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)NP基因的真核表达载体,转染HEK293细胞,检测其表达情况。方法采用RT-PCR技术克隆甲型流感病毒株NP基因,将克隆的片段插入真核表达载体pcDNA3.1(+)。经酶切、PCR和测序鉴定后,构建好的pcDNA3.1(+)/N... 目的构建甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)NP基因的真核表达载体,转染HEK293细胞,检测其表达情况。方法采用RT-PCR技术克隆甲型流感病毒株NP基因,将克隆的片段插入真核表达载体pcDNA3.1(+)。经酶切、PCR和测序鉴定后,构建好的pcDNA3.1(+)/NP用脂质体转染法转染HEK293细胞,通过免疫荧光技术检测其目的蛋白的瞬时表达。结果RT-PCR扩增到NP基因,插入真核表达载体pcDNA3.1(+),转染HEK293后经免疫荧光技术检测到目的蛋白的表达。结论本实验构建的甲型流感病毒NP部分基因序列的真核表达载体,为深入研究流感病毒核衣壳蛋白和有效的核酸疫苗奠定了基础。 展开更多

关键词 甲型流感病毒 NP基因 PCDNA3.1(+) 免疫荧光技术

在线阅读 下载PDF 职称材料