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一种新型葡激酶分子的设计基因构建表达纯化及性质研究 被引量:2
1
作者 宋钢 于敏 +1 位作者 莫炜 宋后燕 《中国工程科学》 2000年第11期68-72,共5页
在葡激酶构效关系的研究过程中发现 ,葡激酶易形成二聚体 ,甚至多聚体 ,不利于葡激酶的临床应用。为了探究聚合体的形成机制以研制不易聚合的新型葡激酶分子 ,在葡激酶X射线晶体衍射结构模型的基础上 ,采用分子对接软件GRAMMV1 0 3,以... 在葡激酶构效关系的研究过程中发现 ,葡激酶易形成二聚体 ,甚至多聚体 ,不利于葡激酶的临床应用。为了探究聚合体的形成机制以研制不易聚合的新型葡激酶分子 ,在葡激酶X射线晶体衍射结构模型的基础上 ,采用分子对接软件GRAMMV1 0 3,以高分辨率整体对接方式预测了葡激酶二聚体可能的结合区。结合区主要有两种可能的形成方式 ,通过强疏水相互作用及氢键结合。根据模型设计了旨在降低聚合能力的葡激酶突变体RGD -Sak ,将F1 1 1置换为D1 1 1 ,并且改变K1 0 9为R1 0 9,恰好使分子中形成RGD结构 ,使新型分子还可能具有抑制血小板聚集作用。利用定点突变及DNA重组技术 ,构建了RGD -Sak基因 ,并利用大肠杆菌原核表达系统进行了高效表达。RGD -Sak以包涵体形式存在 ,包涵体经洗涤 ,8mol/L尿素溶解 ,稀释复性 ,离子交换色谱一步分离得到电泳纯的RGD -Sak ,纯度达 95%以上 ,分子量与理论值相符 ,比活性 5× 1 0 4 HU/mg。RGD -Sak与纤溶酶形成的复合物催化纤溶酶原的Km、Kcat值分别为 1 2 40 μmol/L、 0 81s- 1 。RGD -Sak显示了很弱的聚合能力。此研究为研制防止二聚体形成的新型葡激酶分子打下了基础。 展开更多
关键词 葡激酶 二聚体 分子对接 分子设计 定点突变 基因构建 基因表达 溶栓药物
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用计算机模型研究葡激酶与人微小纤溶酶原的相互作用 被引量:3
2
作者 宋钢 宋后燕 茅翔 《高技术通讯》 EI CAS CSCD 1999年第4期48-51,共4页
利用计算机同源模建预测人微小纤溶酶原的三维结构,与葡激酶X射线晶体结构进行了分子对接,研究了葡激酶与微小溶酶原的结合区,并设计了分子量小、低抗原性的新型葡激酶分子。
关键词 葡激酶 微小纤溶酶原 分子设计 计算机模型
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t-PA蛋白质分子的改造
3
作者 王结义 宋后燕 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 1989年第6期412-416,共5页
组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)与纤维蛋白有高亲和力,具有特异地溶解血栓的功能。t-PA含有多个结构域,其分子结构和功能关系的阐明,促进了改造t-PA分子以发展更特异的血栓溶解剂的研究。
关键词 T-PA 蛋白质分子 纤溶酶原 激活剂
全文增补中
t PA、u PA/u PAR及其抑制剂PAI 1在乳腺肿瘤的表达 被引量:3
4
作者 唐辉滨 何诚 +4 位作者 廖劲晖 田昱 应其龙 宋后燕 朱运松 《中国癌症杂志》 CAS CSCD 1999年第3期237-240,共4页
目的 研究组织型纤溶酶原激活剂(tPA) 、尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA) 及其受体uPAR、1 型纤溶酶原激活剂抑制剂PAI1 在乳腺肿瘤中的分布及酶学活性。 方法 用免疫组织化学ABC方法,分析4 种因子在... 目的 研究组织型纤溶酶原激活剂(tPA) 、尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA) 及其受体uPAR、1 型纤溶酶原激活剂抑制剂PAI1 在乳腺肿瘤中的分布及酶学活性。 方法 用免疫组织化学ABC方法,分析4 种因子在乳腺肿瘤组织中的定位及半定量表达,用发色底物法测定乳腺肿瘤组织提取物中的tPA 和uPA 的活性。 结果 tPA、uPA、PAI1 主要分布在正常腺上皮及癌上皮细胞的胞质中,uPAR 则在癌细胞的胞膜及胞浆中;总PA 活性和tPA 活性在乳腺良、恶性组织中均无显著性改变,但uPA,uPAR 和PAI1 在乳腺癌组织中的表达明显高于良性组织及癌旁组织;uPA/uPAR在转移灶中的表达较原发灶有不同程度的下降,而PAI1 在转移灶中却较原发灶中为高。 结论 tPA 可能与乳腺癌的恶性表型无关。而uPA/uPAR 与恶性表型相关;uPA/uPAR 和PAI1的相互制约及平衡在调节肿瘤原发灶癌细胞的移动中可能起到重要作用。 展开更多
关键词 t-PA U-PA U-PAR PAI-1 乳腺癌 抑制剂 基因表达
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人纤溶酶原激活剂抑制物2型(PAI-2)在大肠杆菌中的表达和分离纯化 被引量:3
5
作者 田昱 沈俊卿 +2 位作者 李平 宋后燕 朱运松 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 1998年第5期536-541,共6页
用PCR方法从pPAIJ.7中扩增人纤溶酶原激活剂抑制物2型(PAI-2)cDNA,与pUC18重组,经限制性内切酶片段分析与核苷酸序列分析,获得全长人PAI-2cDNA.PAI-2cDNA与原核表达载体重组,构建原... 用PCR方法从pPAIJ.7中扩增人纤溶酶原激活剂抑制物2型(PAI-2)cDNA,与pUC18重组,经限制性内切酶片段分析与核苷酸序列分析,获得全长人PAI-2cDNA.PAI-2cDNA与原核表达载体重组,构建原核表达质粒并转化大肠杆菌.经温度诱导表达,重组PAI-2占全菌总蛋白的14%,以可溶性形式存在,具纤溶抑制活性.工程菌发酵、压榨后,用硫酸铵分级沉淀,沉淀物经分子筛、离子交换和疏水性色谱的分离,每升菌液可获得约30mg纯度达90%的蛋白质,比活性为11866AIU/mg蛋白质,得率为19.2%. 展开更多
关键词 原核表达 分离纯化 PAI-2 大肠杆菌
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丁酸钠对杂交瘤细胞增殖及抗体分泌的影响 被引量:2
6
作者 丁皓 吴晓俐 +2 位作者 陈幼妹 朱运松 宋后燕 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 1991年第6期346-348,共3页
用含不同浓度丁酸钠完全培养液和无血清培养液培养分泌抗组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)单克隆抗体的杂交瘤细胞。当丁酸钠浓度为0.25~0.5 mmol/L时,对杂交瘤细胞分泌抗体能力具有刺激作用,提高抗体效价2~4倍,对细胞生长无抑制作用。表... 用含不同浓度丁酸钠完全培养液和无血清培养液培养分泌抗组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)单克隆抗体的杂交瘤细胞。当丁酸钠浓度为0.25~0.5 mmol/L时,对杂交瘤细胞分泌抗体能力具有刺激作用,提高抗体效价2~4倍,对细胞生长无抑制作用。表明丁酸钠可作为一种添加剂用以提高杂交瘤细胞分泌抗体的能力。 展开更多
关键词 丁酸钠 抗体分泌 杂交瘤 细胞
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抗人尿激酶单克隆抗体制备和鉴定 被引量:3
7
作者 丁皓 吴晓俐 +1 位作者 朱运松 宋后燕 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 1992年第3期148-150,共3页
用人高分子量尿激酶(HMW-UK)为抗原,通过杂交瘤技术获得了两株阳性杂交瘤细胞(2B8、3A2)。采用葡萄球菌 A 蛋白(SPA)亲和层析或 Water's650快速蛋白分离系统纯化抗 UK 单克隆抗体(McAb).3A2McAb 为 IgG 1亚类,特异地识别 HMW-UK 和... 用人高分子量尿激酶(HMW-UK)为抗原,通过杂交瘤技术获得了两株阳性杂交瘤细胞(2B8、3A2)。采用葡萄球菌 A 蛋白(SPA)亲和层析或 Water's650快速蛋白分离系统纯化抗 UK 单克隆抗体(McAb).3A2McAb 为 IgG 1亚类,特异地识别 HMW-UK 和低分子量 LMW-UK,抑制 UK 活性,表明3A2McAb 所作用的位点为 UK 的 B 链,即活性中心。EIA 测定3A2McAb 与 UK 的亲和常数为8.43×10~8M^(-1)。2B_8McAb 亦为IgG_(?)亚类,特异地识别 HMW-UK 及其氨基端1~135氨基酸片段(ATF),不抑制活性,EIA 测定2B_8McAb 与UK 的亲和常数为2.8×10~9M^(-1)。2B_8McAb 可用于导向溶栓的研究以及 UK 与其受体间反应的研究。 展开更多
关键词 尿激酶 单克隆抗体 尿激酶活性
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nm23-H1-GFP融合蛋白在人肺癌细胞株中的表达及其对肿瘤细胞体外侵袭能力的影响 被引量:10
8
作者 何诚 贺平 朱运松 《中国生物化学与分子生物学报》 CSCD 2000年第1期51-56,共6页
研究 nm2 3- H1在肿瘤细胞中的定位及其对肿瘤细胞体外侵袭能力的影响 .用 RT- PCR方法检测人高和低转移肺巨细胞癌细胞株 95 D和 95 C中 nm2 3- H1的表达 ;利用分子克隆技术构建nm2 3- H1 -绿色荧光蛋白 ( GFP)融合基因表达质粒 ( p NM... 研究 nm2 3- H1在肿瘤细胞中的定位及其对肿瘤细胞体外侵袭能力的影响 .用 RT- PCR方法检测人高和低转移肺巨细胞癌细胞株 95 D和 95 C中 nm2 3- H1的表达 ;利用分子克隆技术构建nm2 3- H1 -绿色荧光蛋白 ( GFP)融合基因表达质粒 ( p NM2 3- GFP) ,经脂质体转染将此质粒导入95 D和 95 C细胞中 ,筛选高荧光强度的克隆 ,用 Boyden小室模型检测其体外侵袭能力的变化 .结果显示 nm2 3- H1在 95 C细胞中的表达比 95 D高 .95 D细胞中表达的 nm2 3- H1 c DNA未发生突变 .表达的 nm2 3- H1 - GFP融合蛋白位于细胞的胞浆近胞膜处 .转染 p NM2 3- GFP质粒的 95 D和 95 C细胞体外侵袭能力明显比对照组低 .这些提示 nm2 3- H1高表达能明显降低肿瘤细胞体外侵袭能力 . 展开更多
关键词 NM23-H1 肺巨细胞癌 肿瘤侵袭转移 GFP 基因表达
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天然和氧化修饰型LDL、VLDL及HDL对培养人动脉平滑肌细胞原癌基因fos及myc表达的影响 被引量:8
9
作者 汪浩川 刘秉文 付明德 《生物化学杂志》 CSCD 1995年第3期304-310,共7页
动脉平滑肌细胞(SMC)是动脉粥样硬化(AS)斑块中的主要细胞,它的增殖在AS形成过程中极其重要。脂蛋白和氧化修饰型脂蛋白对SMC增殖的影响以及SMC增殖与原癌基因异常表达的关系是当前AS发病机制研究的热点之一。我们... 动脉平滑肌细胞(SMC)是动脉粥样硬化(AS)斑块中的主要细胞,它的增殖在AS形成过程中极其重要。脂蛋白和氧化修饰型脂蛋白对SMC增殖的影响以及SMC增殖与原癌基因异常表达的关系是当前AS发病机制研究的热点之一。我们在建立人主动脉SMC体外培养方法的基础上,观察了LDL,VLDL及HDL和相应的氧化修饰型脂蛋白对培养人SMCfos,myc,erb-B原癌基因转录表达的影响。结果表明:①HDL对SMCfos,myc基因表达无影响;②LDL和VLDL有使这些基因表达增加的趋势,但与对照比较差异不显著(P>0.05);③OX-VLDL,OX-VLDL和OX-HDL有使SMCfos,myc基因表达显著增强的作用(P<0.01),且其作用较相应的天然脂蛋白大(P<0.01).上述结果说明:LDL,VLDL,OX-LDL,OX-VLDL和0X-HDL的致AS作用可能与刺激SMCfos和myc癌基因表达增加有关。 展开更多
关键词 平滑肌细胞 原癌基因 脂蛋白 动脉粥样硬化
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低免疫原性的新型葡激酶ΔNMSak在大肠杆菌中的高效表达和分离纯化 被引量:2
10
作者 宋钢 莫炜 宋后燕 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 2000年第6期727-731,共5页
为了降低野生型葡激酶 (wild- type staphylokinase,wt- Sak)的免疫原性 ,对已构建的葡激酶N端缺失突变体 (ΔNSak) c DNA进行改造 ,将其主要的抗原决定簇编码序列突变为丙氨酸密码子 .该突变体 (ΔNMSak) c DNA与原核表达载体 p LY- 4... 为了降低野生型葡激酶 (wild- type staphylokinase,wt- Sak)的免疫原性 ,对已构建的葡激酶N端缺失突变体 (ΔNSak) c DNA进行改造 ,将其主要的抗原决定簇编码序列突变为丙氨酸密码子 .该突变体 (ΔNMSak) c DNA与原核表达载体 p LY- 4重组后 ,转化大肠杆菌 JF1 1 2 5.经温度诱导 ,ΔNMSak获得高效表达 ,重组蛋白占全菌总蛋白的 60 % ,以包涵体形式存在 .包涵体经洗涤 ,8mol/L尿素溶解 ,稀释复性 ,离子交换色谱一步分离至电泳纯 ,纯度达 95%以上 ,分子量与理论值相符 ,比活性 8.5× 1 0 4 HU/mg.经 ELISA法、发色底物法测定 ,ΔNMSak与 wt- Sak制备的兔抗wt- Sak抗血清的免疫反应性显著降低 ,经抗血清温育后 ,wt- Sak活性下降程度远高于 ΔNMSak.ΔNMSak、wt- Sak分别免疫豚鼠 ,以 ELISA法测定豚鼠血清中相应抗体的效价 ,ΔNMSak组的抗体效价明显低于 wt- Sak组 ,表明 ΔNMSak的免疫原性显著下降 . 展开更多
关键词 葡激酶 免疫原性 突变性 表达 纯化 大肠杆菌
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人纤溶酶原激活剂抑制物2型(PAI-2)在Pichia pastoris中的表达 被引量:2
11
作者 田昱 李平 朱运松 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 1998年第3期258-263,共6页
用PCR方法从pPAIJ.7中扩增人纤溶酶原激活剂抑制物2型(PAI-2)基因,与pPUC18重组,经限制性内切酶片段分析与核苷酸序列分析,获得全长人PAI-2基因.PAI-2基因与表达载体pPIC9重组,构建受乙醇... 用PCR方法从pPAIJ.7中扩增人纤溶酶原激活剂抑制物2型(PAI-2)基因,与pPUC18重组,经限制性内切酶片段分析与核苷酸序列分析,获得全长人PAI-2基因.PAI-2基因与表达载体pPIC9重组,构建受乙醇氧化酶1基因(AOX1)启动子与转录终止区控制的酵母表达质粒,转化GS115宿主菌,经表型筛选和PCR扩增筛选阳性克隆,用甲醇诱导表达,重组PAI-2以分泌型表达,占分泌总蛋白的30%,具PAI-2抗原性,与低分子量尿激酶形成了抗SDS复合物,具抑制纤溶的活性(91.4AIU/ml).对培养条件也进行了探讨. 展开更多
关键词 纤溶酶原激活剂 抑制物2型 酵母表达 PCR
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癌基因及抗癌基因在实验性动脉粥样硬化斑块中的转录表达 被引量:1
12
作者 汪浩川 刘秉文 +1 位作者 付明德 曾成林 《北京大学学报(医学版)》 CAS CSCD 1994年第S1期241-242,共2页
癌基因及抗癌基因在实验性动脉粥样硬化斑块中的转录表达成都华西医科大学生物化学与分子生物学研究所610041汪浩川,刘秉文,付明德,曾成林AS是一种以动脉SMC和单核/巨噬细胞增殖为主的疾病。就其本质而言,它的发生与肿... 癌基因及抗癌基因在实验性动脉粥样硬化斑块中的转录表达成都华西医科大学生物化学与分子生物学研究所610041汪浩川,刘秉文,付明德,曾成林AS是一种以动脉SMC和单核/巨噬细胞增殖为主的疾病。就其本质而言,它的发生与肿瘤有相似之处,可能是癌基因异常表达... 展开更多
关键词 抗癌基因 转录表达 基因异常 巨噬细胞 汪浩 刘秉文 华西医科大学 基因表达 高胆固醇膳食 生长因子
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测定尿激酶含量夹心法 ELISA 的建立 被引量:1
13
作者 丁皓 吴晓俐 +1 位作者 朱运松 宋后燕 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 1992年第5期308-310,共3页
采用两种识别不同抗原决定簇的抗尿激酶(UK)单克隆抗体建立了测定人 UK 含量的夹心法ELISA.本法灵敏度为0.15ng/ml,批内 CV4.3%,批间 CV8.7%,平均回收率98%.应用本法测定了部分正常细胞和肿瘤细胞株培养上清中的 UK 含量,肿瘤细胞培养上... 采用两种识别不同抗原决定簇的抗尿激酶(UK)单克隆抗体建立了测定人 UK 含量的夹心法ELISA.本法灵敏度为0.15ng/ml,批内 CV4.3%,批间 CV8.7%,平均回收率98%.应用本法测定了部分正常细胞和肿瘤细胞株培养上清中的 UK 含量,肿瘤细胞培养上清 UK 量明显高于正常细胞.测定82名正常人血浆中 UK 含量,其结果为1.31±0.6ng/ml. 展开更多
关键词 尿激酶 夹心法 ELISA 单克隆抗体
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特异性DNA倍增技术(PCR)及其应用 被引量:2
14
作者 付四清 宋后燕 程立 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 1990年第2期88-92,共5页
特异性DNA倍增技术(PCR)是近年来发展的一种新技术,具有快速、简便、灵敏、特异性高和重复性好等优点,尤其适合于临床分子生物学检测。PCR技术包括三个循环过程:(1)模板DNA的变性,(2)模板DNA-引物的复性,(3)DNA聚合酶作用下的引物链的... 特异性DNA倍增技术(PCR)是近年来发展的一种新技术,具有快速、简便、灵敏、特异性高和重复性好等优点,尤其适合于临床分子生物学检测。PCR技术包括三个循环过程:(1)模板DNA的变性,(2)模板DNA-引物的复性,(3)DNA聚合酶作用下的引物链的延伸。本文对耐高温Taq DNA聚合酶、PCR的反应体系、PCR产物特异性的影响因素和PCR技术的应用等几个方面进行了综述。 展开更多
关键词 PCR 分子病检测
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Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂cDNA在P.pastoris酵母菌中的表达和鉴定
15
作者 何诚 唐辉滨 +2 位作者 田昱 宋后燕 朱运松 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 1998年第5期547-552,共6页
将编码379个氨基酸残基的PAI-1cDNA插入到含AOX1启动子和PHO1分泌信号肽序列的甲醇营养型酵母载体中,构建成表达质粒pYIS-1.表达质粒转化P.pastoris甲醇营养型酵母细胞,筛选His+Mut-表... 将编码379个氨基酸残基的PAI-1cDNA插入到含AOX1启动子和PHO1分泌信号肽序列的甲醇营养型酵母载体中,构建成表达质粒pYIS-1.表达质粒转化P.pastoris甲醇营养型酵母细胞,筛选His+Mut-表型的转化子,经低密度摇瓶培养,1%甲醇诱导表达7d后,培液经SDS-PAGE分析,PAI-1生物活性测定和Westernblot证实表达出分子量为43~51kD的4条PAI-1条带.表达的PAI-1能有效地分泌到培液中,占培液总蛋白的26%左右,达4mg/L培液;其比活性为1.16×104AU/mg. 展开更多
关键词 甲醇营养型酵母 表达 寡糖链 PAI-1
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天然和氧化修饰型脂蛋白对培养人动脉平滑肌细胞基因转录表达及DNA合成的影响
16
作者 汪浩川 刘秉文 《北京大学学报(医学版)》 CAS CSCD 1994年第S1期240-241,共2页
天然和氧化修饰型脂蛋白对培养人动脉平滑肌细胞基因转录表达及DNA合成的影响成都华西医科大学生物化学与分子生物学研究所610041汪浩川,刘秉文AS是一种以动脉SMC和单核/巨噬细胞增殖为主的疾病。就其本质而言,它的发... 天然和氧化修饰型脂蛋白对培养人动脉平滑肌细胞基因转录表达及DNA合成的影响成都华西医科大学生物化学与分子生物学研究所610041汪浩川,刘秉文AS是一种以动脉SMC和单核/巨噬细胞增殖为主的疾病。就其本质而言,它的发生与肿瘤有相似之处,可能是癌基因异... 展开更多
关键词 DNA合成 氧化修饰 基因转录 巨噬细胞 汪浩 刘秉文 华西医科大学 癌基因 基因表达 实验观察
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