pSiRNA-Notch1逆转录病毒载体的构建及对恶性脑胶质瘤细胞的作用 被引量：4

1

作者 尹昌林 吕胜青 +3 位作者 黄轶 李光辉 唐莉 杨辉 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第12期1211-1214,共4页

目的建立逆转录病毒介导的人Notch1基因RNA干扰体外表达体系并观察对恶性脑胶质瘤细胞的作用。方法将人Notch1基因RNAi双链转录DNA片段重组到逆转录病毒质粒Psilencer5.1-H1Retro中,构建成携带人Notch1基因RNAi逆转录病毒载体pSiRNA-Not... 目的建立逆转录病毒介导的人Notch1基因RNA干扰体外表达体系并观察对恶性脑胶质瘤细胞的作用。方法将人Notch1基因RNAi双链转录DNA片段重组到逆转录病毒质粒Psilencer5.1-H1Retro中,构建成携带人Notch1基因RNAi逆转录病毒载体pSiRNA-Notch1,经PT67细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染U251和CHG-5恶性脑胶质瘤细胞,用WST-8、RT-PCR和Western blot分别检测对转染细胞活性、人Notch1 mRNA和蛋白表达的影响。结果重组pSiRNA-Notch1质粒经测序鉴定正确。重组逆转录病毒滴度可达224×104cfu/ml,感染U251和CHG-5恶细胞后3d能明显抑制细胞生长,RT-PCR和Western blot检测人Notch1 mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组。结论携带人Notch1基因RNAi双链转录DNA片段的逆转录病毒有明显的抑制恶性脑胶质瘤细胞生长作用,为下一步开展基因治疗恶性脑胶质瘤奠定了基础。 展开更多

关键词 psirna—notch1逆转录病毒载体 恶性脑胶质瘤 基因治疗

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人PD-L1(B7-H1)基因克隆及其逆转录病毒载体的构建和稳定表达 被引量：7

2

作者 陈永井 施勤 +5 位作者 葛彦 徐宽枫 古涛 孙建军 李文香 张学光 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2003年第2期110-114,共5页

目的 :克隆人PD L1(B7 H1)基因 ,并构建含有该目的基因的重组逆转录病毒载体 ,获得稳定表达PD L1基因的L92 9细胞。方法 :从人心脏cDNA文库中扩增出PD L1基因 ,通过双酶切装入逆转录病毒载体 pGEZ Term中 ,脂质体法共转染包装细胞 2 93... 目的 :克隆人PD L1(B7 H1)基因 ,并构建含有该目的基因的重组逆转录病毒载体 ,获得稳定表达PD L1基因的L92 9细胞。方法 :从人心脏cDNA文库中扩增出PD L1基因 ,通过双酶切装入逆转录病毒载体 pGEZ Term中 ,脂质体法共转染包装细胞 2 93T ,用含有完整病毒颗粒的 2 93T细胞的培养上清感染L92 9细胞 ,72h后 ,加入Zeocin进行筛选 ,挑选出能稳定表达PD L1蛋白的L92 9细胞株。结果 :构建了用于表达的含PD L1基因的重组逆转录病毒载体 ;经转染包装细胞 2 93T后 ,包装出具有感染能力的重组PD L1逆转录病毒 ;经RT PCR、流式细胞仪表型检测表明 ,筛选出的L92 9转基因细胞能稳定表达人PD L1蛋白。结论 :构建了含人PD L1基因重组逆转录病毒载体和稳定表达人PD L1蛋白的细胞株 ,为该基因功能的后续研究和单克隆抗体的研制奠定了基础。 展开更多

关键词 PD-L1 基因克隆 逆转录病毒载体 构建 稳定表达

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逆转录病毒载体PLXRN介导的人IL-1Ra在关节滑膜细胞中的表达 被引量：3

3

作者 张晓玲 于长隆 +2 位作者 毛泽斌 傅欣 张继英 《体育科学》 CSSCI 北大核心 2005年第7期21-24,30,共5页

目的:建立逆转录病毒介导的人IL-1Ra体外表达体系。方法:应用DNA重组技术,将人IL-1RacDNA片段重组到逆转录病毒质粒pLXRN中,经PT67细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染原代关节滑膜细胞,用ELISA检测IL-1Ra表达。结果:重组pLXRN-IL-1Ra... 目的:建立逆转录病毒介导的人IL-1Ra体外表达体系。方法:应用DNA重组技术,将人IL-1RacDNA片段重组到逆转录病毒质粒pLXRN中,经PT67细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染原代关节滑膜细胞,用ELISA检测IL-1Ra表达。结果:重组pLXRN-IL-1Ra质粒,经酶切鉴定正确。重组逆转录病毒pLXRN-IL-1Ra滴度可达5.5×104CFU/ml,感染原代关节滑膜细胞后能稳定表达。结论:逆转录病毒能介导人IL-1Ra在关节滑膜细胞中的稳定表达,为下一步开展基因治疗运动创伤性骨关节炎奠定了基础。 展开更多

关键词 IL-1RA 逆转录病毒载体 基因转移 创伤性骨关节炎

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逆转录病毒载体介导大鼠乳腺癌细胞共表达MIP-1α和B7-1 被引量：2

4

作者 王振发 王烈 +5 位作者 王瑜 陈少全 林晨 卫立辛 覃林花 张长松 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2007年第2期132-136,共5页

目的:建立共表达小鼠MIP-1α和B7-1基因的大鼠乳腺癌细胞株,并进行体外活性检测。方法:应用含不同选择标记的重组逆转录病毒载体,经1mg/mlG418和2μg/ml puromycin双药物筛选后获得MIP-1α+B7-1基因共表达的大鼠乳腺癌细胞株。RT-PCR、... 目的:建立共表达小鼠MIP-1α和B7-1基因的大鼠乳腺癌细胞株,并进行体外活性检测。方法:应用含不同选择标记的重组逆转录病毒载体,经1mg/mlG418和2μg/ml puromycin双药物筛选后获得MIP-1α+B7-1基因共表达的大鼠乳腺癌细胞株。RT-PCR、免疫组化检测mMIP-1α的表达,RT-PCR、流式细胞术检测mB7-1的表达;将共表达MIP-1α和B7-1的肿瘤细胞与大鼠脾淋巴细胞混合培养后,MTT法检测淋巴细胞的增殖指数、琼脂糖打孔法检测共表达MIP-1α和B7-1肿瘤细胞对单个核细胞的趋化活性。结果:经脂质体转染包装细胞产生的重组逆转录病毒上清病毒滴度达4.6×107CFU/L。细胞生长曲线显示,重组逆转录病毒感染对乳腺癌细胞增殖无明显影响。重组逆转录病毒感染的大鼠乳腺癌细胞株SHZ-88/mMIP-1α+mB7-1有B7-1和MIP-1α mRNA及蛋白的表达。淋巴细胞增殖指数PI值SHZ-88/PLXSN组为(0.76±0.25),SHZ-88/mMIP-1α+mB7-1组为(1.95±0.31),后者体外刺激淋巴细胞增殖能力增强(P<0.01),SHZ-88/pBabe puro组的趋化指数为(0.99±0.19),mMIP-1α+mB7-1组的为(3.88±0.33),后者显著增强了趋化活性。结论:通过逆转录病毒载体介导建立MIP-1α和B7-1基因共表达的大鼠乳腺癌细胞株具有招引单个核细胞,并将其激活的体外生物学活性。 展开更多

关键词 MIP-1Α B7—1 逆转录病毒载体 大鼠乳腺癌 SHZ-88细胞

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人MCPH1基因shRNA逆转录病毒载体的构建及鉴定 被引量：1

5

作者 袁成福 程莉 +3 位作者 黄秀凝 卜友泉 刘革力 宋方洲 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第4期450-453,共4页

目的:建立逆转录病毒介导的MCPH1基因RNA干扰表达体系并观察其在宫颈癌细胞(HeLa)中对MCPH1表达的影响。方法:将人MCPH1基因RNA干扰双链DNA片段重组到逆转录病毒质粒pSilencer5.1-H1 Retro中,构建携带人MCPH1基因RNA干扰逆转录病毒载体p... 目的:建立逆转录病毒介导的MCPH1基因RNA干扰表达体系并观察其在宫颈癌细胞(HeLa)中对MCPH1表达的影响。方法:将人MCPH1基因RNA干扰双链DNA片段重组到逆转录病毒质粒pSilencer5.1-H1 Retro中,构建携带人MCPH1基因RNA干扰逆转录病毒载体pSi RNA-MCPH1,经PT67细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染宫颈癌细胞株HeLa细胞,并用嘌呤霉素筛选产生稳定的细胞克隆,用RT-PCR和Western印迹检测细胞中MCPH1 mRNA和蛋白表达的变化。结果:重组pSi RNA-MCPH1质粒经测序鉴定正确;重组逆转录病毒感染HeLa细胞后用嘌呤霉素筛选出稳定的细胞克隆;RT-PCR和Western印迹检测人MCPH1 mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组。结论:携带人MCPH1基因RNA干扰双链DNA片段的逆转录病毒感染HeLa细胞后能明显抑制MCPH1 mRNA和蛋白表达,为进一步研究MCPH1在宫颈癌中的作用奠定了基础。 展开更多

关键词 MCPH1 RNA干扰 逆转录病毒载体 宫颈肿瘤

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MDR1基因RNAi逆转录病毒载体的构建及表达 被引量：1

6

作者 马淑梅 刘扬 刘晓冬 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期6-10,共5页

目的:构建并鉴定MDR-1基因沉默载体pSUPER-retro-puro-shRNA(MDR1),并检测其对于乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR耐药表型的逆转效果。方法:根据MDR-1基因序列,利用在线软件IDTdna设计2个干扰MDR-1基因的寡聚核苷酸序列,合成回收DNA序列退火... 目的:构建并鉴定MDR-1基因沉默载体pSUPER-retro-puro-shRNA(MDR1),并检测其对于乳腺癌耐药细胞株MCF-7/ADR耐药表型的逆转效果。方法:根据MDR-1基因序列,利用在线软件IDTdna设计2个干扰MDR-1基因的寡聚核苷酸序列,合成回收DNA序列退火后克隆至线性化pSUPER质粒载体,重组质粒载体经双酶切电泳鉴定和测序分析后,再转染293T包装细胞产生病毒颗粒后感染MCF-7/ADR细胞。用RT-PCR检测MDR1基因mRNA表达,Westernblotting测定转染后MCF-7/ADR细胞中P-gp蛋白的表达量。结果:重组MDR基因沉默载体经双酶切电泳鉴定和DNA测序分析证实插入60bp序列与原序列一致,位置正确;与对照组比较,转入MCF-7/ADR细胞后RT-PCR结果显示MDRmRNA水平明显下降,Western blotting显示P-gp蛋白表达量明显降低。结论:逆转录病毒MDR1基因沉默载体构建成功,并在MCF-7/ADR细胞中起到抑制MDR1基因表达的作用。 展开更多

关键词 RNAI MDR1 逆转录病毒载体 乳腺癌

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人B7-1、IFN-γ双顺反子逆转录病毒载体的构建和表达 被引量：1

7

作者 曹善津 钱和年 +3 位作者 冯捷 付天云 叶雪 姚煜 《北京医科大学学报》 CSCD 2000年第6期492-495,共4页

目的 :制备免疫基因修饰的卵巢癌肿瘤疫苗。方法 :利用口蹄疫病毒的内在性核糖体插入位点 (internalribosomeentrysites,IRES) ,通过基因克隆技术构建人B7 1、IFN γ双顺反子逆转录病毒载体PLXSN/B7 1IFN γ。结果 :将PLXSN/B7 1IFN γ... 目的 :制备免疫基因修饰的卵巢癌肿瘤疫苗。方法 :利用口蹄疫病毒的内在性核糖体插入位点 (internalribosomeentrysites,IRES) ,通过基因克隆技术构建人B7 1、IFN γ双顺反子逆转录病毒载体PLXSN/B7 1IFN γ。结果 :将PLXSN/B7 1IFN γ转染逆转录病毒包装细胞 ,包装成病毒 ,经滴度测定后 ,转导卵巢上皮癌细胞系 3AO ,筛选稳定表达克隆 ,RT PCR和免疫流式细胞测定均可证实B7 1、IFN γ在同一转导细胞的共表达。结论 :口蹄疫病毒的IRES可提供B7 1、IFN 展开更多

关键词 B7-1 干扰素Γ 肿瘤 基因治疗 逆转录病毒 载体

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HSV1-tk基因重组逆转录病毒载体的构建与表达 被引量：1

8

作者 李爱华 刘天承 田竟生 《首都医科大学学报》 CAS 1999年第2期83-85,共3页

通过ＤＮＡ重组技术，将ＨＳＶ１ｔｋ基因片段重组到含有ＨＳＶ１ｔｋ启动子的ｐＮ２Ａ型逆转录病毒载体中。选取正向克隆的逆转录病毒重组ＤＮＡ，以磷酸钙法转染ψ２，ＰＡ３１７包装细胞后，经Ｇ４１８筛选，抗性克隆细胞上清能... 通过ＤＮＡ重组技术，将ＨＳＶ１ｔｋ基因片段重组到含有ＨＳＶ１ｔｋ启动子的ｐＮ２Ａ型逆转录病毒载体中。选取正向克隆的逆转录病毒重组ＤＮＡ，以磷酸钙法转染ψ２，ＰＡ３１７包装细胞后，经Ｇ４１８筛选，抗性克隆细胞上清能成功地感染ＮＩＨ３Ｔ３，细胞系测定平均滴度为６．２×１０５ＣＦＵ／ｍＬ，最高可达１．５×１０６ＣＦＵ／ｍＬ。 展开更多

关键词 HSV1-tk基因 逆转录病毒载体 基因转移 基因重组

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反义Cyclin D_1逆转录病毒表达载体的构建 被引量：1

9

作者 黄海长 王海燕 吕有勇 《北京医科大学学报》 CSCD 1997年第1期84-85,共2页

关键词 CyclimD1 反义逆转录病毒 载体构建

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人抑癌基因 nm23-H_1 在逆转录病毒载体上表达的研究

10

作者 杨瑞仪 张美英 赵利淦 《暨南大学学报（自然科学与医学版）》 CAS CSCD 1998年第6期48-48,共1页

应用基因工程的方法，将抑癌基因ｎｍ２３－Ｈ１的ＤＮＡ片段克隆到逆转录病毒表达载体ｐＬＸＳＮ，得到重组质粒ｐＬＸＳＮ－ｎｍｈ１。用磷酸钙沉淀技术将重组质粒转染到辅助包装细胞ψＣＲＩＰ中，通过Ｇ４１８筛选，得到抗性克隆。... 应用基因工程的方法，将抑癌基因ｎｍ２３－Ｈ１的ＤＮＡ片段克隆到逆转录病毒表达载体ｐＬＸＳＮ，得到重组质粒ｐＬＸＳＮ－ｎｍｈ１。用磷酸钙沉淀技术将重组质粒转染到辅助包装细胞ψＣＲＩＰ中，通过Ｇ４１８筛选，得到抗性克隆。经ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ杂交检测证实：ｎｍ２３－Ｈ１基因已整合到克隆细胞的染色体上，并且得到表达。获得的逆转录病毒滴度达１０５ＣＦＵ／ｍＬ。 展开更多

关键词 逆转录病毒载体 PLXSN nm23-H1质粒 抑癌基因

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Islet-1基因逆转录病毒表达载体的构建

11

作者 刘佳梅 陈东 孟晓婷 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期831-833,共3页

目的:分离大鼠胰岛素基因增强结合蛋白1(Islet-1)基因,构建plEGFP-C1-Islet-1逆转录病毒表达载体。方法:利用RT-PCR技术钓取大鼠Islet-1基因,克隆到测序载体PGET-1TA中,测序后再亚克隆到逆转录病毒载体plEGFP-C1中,通过脂质体2000将其... 目的:分离大鼠胰岛素基因增强结合蛋白1(Islet-1)基因,构建plEGFP-C1-Islet-1逆转录病毒表达载体。方法:利用RT-PCR技术钓取大鼠Islet-1基因,克隆到测序载体PGET-1TA中,测序后再亚克隆到逆转录病毒载体plEGFP-C1中,通过脂质体2000将其导入包装细胞PA317中,经G418筛选后,获得阳性克隆。结果:RT-PCR产物为1050bp条带,经测序鉴定与GenBank中Islet-1基因的序列相同;构建的plEGFP-C1-Islet-1载体经酶切鉴定,证实Islet-1基因片段正确插入逆转录表达载体中。用共聚焦激光扫描显微镜观察导入Islet-1基因的PA317细胞,可见细胞发出绿色荧光。结论:分离得到了大鼠Islet-1基因并成功构建了plEGFP-C1-Islet-1表达载体。 展开更多

关键词 胰岛素基因增强结合蛋白1基因 克隆 重组逆转录病毒载体

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携带TIMP-1基因逆转录病毒载体的构建及其实验研究 被引量：1

12

作者 龚涌灵 陈龙邦 黄伟达 《南京大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 1999年第2期174-179,共6页

构建携带组织金属蛋白酶抑制物ＴＩＭＰ－１基因的逆转录病毒载体，并用于感染胰腺癌ＳＷ１９９０细胞系，观察其侵袭、转移能力的变化．利用常规分子克隆技术，通过对逆转录病毒表达载体ＰＭＮＳＭ（Ｆ６）质粒的去磷酸化、粘端连接，... 构建携带组织金属蛋白酶抑制物ＴＩＭＰ－１基因的逆转录病毒载体，并用于感染胰腺癌ＳＷ１９９０细胞系，观察其侵袭、转移能力的变化．利用常规分子克隆技术，通过对逆转录病毒表达载体ＰＭＮＳＭ（Ｆ６）质粒的去磷酸化、粘端连接，构建ＴＩＭＰ－１基因逆转录病毒表达载体ＰＭＮＳＭ／ｈＴＩＭＰ；经限制性内切酶酶切、电泳鉴定其结构正确后，用电穿孔法对体外培养的ＰＡ１３７包装细胞进行基因转移，Ｇ４１８筛选阳性克隆，收集上清，并用于感染胰腺癌ＳＷ１９９０细胞系的研究．构建获得ＴＩＭＰ－１基因逆转录病毒表达载体ＰＭＮＳＭ／ｈＴＩＭＰ，有效滴度为１０４ＣＦＵ／ｍＬ～１０６ＣＦＵ／ｍＬ．本研究构建获得的ＴＩＭＰ－１基因逆转录病毒表达载体，在感染胰腺癌ＳＷ１９９０细胞系，观察其侵袭。 展开更多

关键词 逆转录病毒 载体构建 转染 胰腺癌 TIMP-1基因

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携带人NFBD1基因shRNA重组逆转录病毒载体的构建及鉴定

13

作者 程莉 袁成福 +5 位作者 黄秀凝 卜友泉 易发平 刘革力 汪长东 宋方洲 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第9期87-91,共5页

建立逆转录病毒介导的NFBD1基因RNA干扰表达体系,并观察其在宫颈癌SiHa细胞中对NFBD1表达的影响。将人NFBD1基因RNA干扰双链DNA片段重组到pSUPER Retro质粒中,构建携带人NFBD1基因RNA干扰的逆转录病毒载体pSUPER-shRNA-NFBD1,经PT67细... 建立逆转录病毒介导的NFBD1基因RNA干扰表达体系,并观察其在宫颈癌SiHa细胞中对NFBD1表达的影响。将人NFBD1基因RNA干扰双链DNA片段重组到pSUPER Retro质粒中,构建携带人NFBD1基因RNA干扰的逆转录病毒载体pSUPER-shRNA-NFBD1,经PT67细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染宫颈癌细胞株SiHa细胞,并用嘌呤霉素筛选产生稳定的细胞克隆,用实时荧光定量PCR和Westernblotting检测细胞中NFBD1mRNA和蛋白表达的变化。重组逆转录病毒质粒经测序鉴定正确;逆转录病毒感染SiHa细胞后用嘌呤霉素筛选出稳定的细胞克隆;实时荧光定量PCR和Westernblot-ting检测人NFBD1mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组。携带人NFBD1基因RNA干扰双链DNA片段的逆转录病毒感染SiHa细胞后能明显抑制NFBD1mRNA和蛋白表达,为进一步研究NFBD1在宫颈癌中的作用奠定了基础。 展开更多

关键词 逆转录病毒载体 SHRNA NFBD1基因 宫颈癌

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小鼠H1foo逆转录病毒载体的构建及表达

14

作者 许荣 张春林 +2 位作者 宁静 李建 雷安民 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2015年第5期21-26,共6页

【目的】构建小鼠pMX-H1foo逆转录病毒载体,并使其在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中异位表达,为进一步研究H1foo在重编程方面的作用奠定理论基础。【方法】根据NCBI公布的小鼠H1foo基因的mRNA序列设计引物,以小鼠卵巢组织总RNA为模板,RT-PC... 【目的】构建小鼠pMX-H1foo逆转录病毒载体,并使其在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中异位表达,为进一步研究H1foo在重编程方面的作用奠定理论基础。【方法】根据NCBI公布的小鼠H1foo基因的mRNA序列设计引物,以小鼠卵巢组织总RNA为模板,RT-PCR扩增小鼠H1foo CDS序列,并连接到逆转录病毒载体pMX上。经双酶切鉴定和测序比对正确后,利用磷酸钙转染包装细胞plat-E的方法制备H1foo病毒液并感染MEF细胞,进一步收集感染的细胞进行半定量RT-PCR和免疫荧光染色检测,分析其在细胞中的表达情况。【结果】克隆得到915bp的H1foo基因,构建得到逆转录病毒载体pMX-H1foo。该载体制备的病毒能够感染MEF细胞,并且H1foo在MEF细胞中与细胞核共定位,而对照组绿色荧光蛋白(GFP)遍布整个细胞。【结论】成功构建了pMX-H1foo逆转录病毒载体,并在MEF中进行表达。 展开更多

关键词 H1foo基因 逆转录病毒载体 多潜能性干细胞

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Jagged1RNA干扰慢病毒载体抑制舌癌Cal-27细胞增殖、侵袭作用的研究 被引量：4

15

作者 张同韩 刘海潮 +5 位作者 梁玉洁 梁立中 郑广森 廖贵清 吴纪楠 黄洪章 《实用医学杂志》 CAS 北大核心 2012年第16期2678-2681,共4页

目的:观察Jagged1RNA干扰慢病毒载体抑制舌癌Cal-27细胞增殖、侵袭作用。方法:采用RT-PCR和Western Blot检测Jagged1siRNA对Cal-27细胞Jagged1基因和蛋白表达水平的敲减效果;克隆形成实验检测干扰后细胞群体依赖性和增殖能力;流式细胞... 目的:观察Jagged1RNA干扰慢病毒载体抑制舌癌Cal-27细胞增殖、侵袭作用。方法:采用RT-PCR和Western Blot检测Jagged1siRNA对Cal-27细胞Jagged1基因和蛋白表达水平的敲减效果;克隆形成实验检测干扰后细胞群体依赖性和增殖能力;流式细胞仪检测细胞周期的变化;Tranwell检测RNA干扰后侵袭率变化。结果:KD组较NC组Jagged1基因和蛋白表达受到明显的敲减。KD组细胞克隆形成率明显降低,较NC组下降42.42%。S期细胞比率均明显下调,约62.98%,G1期细胞比率上调,凋亡率明显增高。72hKD细胞生长抑制率为32.50%。Jagged1RNAi慢病毒载体感染后,KD组侵袭率无下降。结论:下调Jagged1基因和蛋白的表达,可使舌癌细胞克隆形成率明显降低、增殖活性降低、S期细胞比率下降、凋亡率升高、成瘤能力下降。 展开更多

关键词 舌肿瘤 notch JAGGED1 RNA干扰 慢病毒载体

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稳定表达猪水疱病病毒P1基因的PK-15细胞系的建立 被引量：2

16

作者 田宏 吴锦艳 +5 位作者 龚真莉 郑海学 孙世琪 尚佑军 刘湘涛 谢庆阁 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期478-482,共5页

从猪水疱病全长感染性cDNA中,应用PCR技术扩增到SVDV结构蛋白P1基因,并在目的片段的5′端引入Kozak序列(Kozak,1987),定向克隆于逆转录病毒载体pBABE puro。经PCR、酶切和序列分析鉴定,获得阳性重组质粒。将该重组质粒与水疱性口炎病毒... 从猪水疱病全长感染性cDNA中,应用PCR技术扩增到SVDV结构蛋白P1基因,并在目的片段的5′端引入Kozak序列(Kozak,1987),定向克隆于逆转录病毒载体pBABE puro。经PCR、酶切和序列分析鉴定,获得阳性重组质粒。将该重组质粒与水疱性口炎病毒载体pVSV-G共转染GP2-293细胞,收获假型病毒,在Polybrene的介导下感染PK-15细胞,嘌呤霉素筛选阳性细胞克隆。免疫荧光连续检测阳性克隆传代细胞,发现在不同代次的细胞中均有SVDV P1蛋白表达,而且表达的蛋白可被SVD阳性血清所识别;同时应用PCR技术,可从体外反复传代阳性细胞基因组中扩增到SVD P1基因。表明本次所筛选的阳性细胞克隆不但能持续稳定地表达SVD P1蛋白,而且可携带外源基因进行传代,具有良好的遗传稳定性。 展开更多

关键词 猪水疱病病毒P1基因 重组逆转录病毒载体 PK-15细胞 基因表达

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携TGFβ1正、反义基因载体对膀胱癌细胞体外生长的作用

17

作者 李文录 赵秀英 +2 位作者 朱锡真 牛瑞芳 姚欣 《中国癌症杂志》 CAS CSCD 2003年第6期527-530,共4页

目的 :探讨表达TGFβ1正、反义基因的复制缺陷型逆转录病毒载体 ,对人膀胱癌细胞生长及细胞周期调控的作用。方法 :以逆转录病毒 pRevTRE为载体 ,构建表达TGFβ1正、反义基因的复制缺陷型逆转录病毒载体 pRevTβ和 pRevTβ AS ;分别转... 目的 :探讨表达TGFβ1正、反义基因的复制缺陷型逆转录病毒载体 ,对人膀胱癌细胞生长及细胞周期调控的作用。方法 :以逆转录病毒 pRevTRE为载体 ,构建表达TGFβ1正、反义基因的复制缺陷型逆转录病毒载体 pRevTβ和 pRevTβ AS ;分别转染膀胱癌细胞株EJ ,观察不同载体对膀胱癌细胞体外增殖、克隆形成和细胞周期时相的影响。结果 :pRevTβ、pRevTβ AS载体病毒滴度分别为 0 84、0 88× 10 5CFU/ml,对EJ细胞的整合率为10 0 % ,并有效表达 ;抑制TGFβ1表达可以降低靶细胞的生长速度和克隆形成率 ,同时出现G0 /G1期细胞比例增高和S期细胞比例降低。结论 :携TGFβ1反义基因的复制缺陷型逆转录病毒载体可以下调EJ细胞内源性TGFβ1表达 ,诱导肿瘤细胞G1期阻滞 ,抑制肿瘤细胞体外生长增殖。 展开更多

关键词 TGFΒ1 复制缺陷型逆转录病毒载体 反义RNA 膀胱癌 培养的肿瘤细胞 细胞周期

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慢病毒介导shRNA干扰ADAM10基因对多发性骨髓瘤MM.1S细胞增殖作用的研究 被引量：2

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作者 许利凡 罗建萍 +6 位作者 李护君 陆倩 张倩楠 姚瑶 姚若斯 徐开林 李振宇 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第4期1074-1079,共6页

目的:探讨干扰ADAM10基因对多发性骨髓瘤MM.1S细胞增殖与凋亡的影响及其作用机制。方法:设计4对针对ADAM10 mRNA不同位点的shRNA编码序列,分别连接到慢病毒载体质粒p LVshRNA-EGFP(2A)Puro中去,构建sh/ADAM10-1,sh/ADAM10-2,sh/ADAM10-3... 目的:探讨干扰ADAM10基因对多发性骨髓瘤MM.1S细胞增殖与凋亡的影响及其作用机制。方法:设计4对针对ADAM10 mRNA不同位点的shRNA编码序列,分别连接到慢病毒载体质粒p LVshRNA-EGFP(2A)Puro中去,构建sh/ADAM10-1,sh/ADAM10-2,sh/ADAM10-3,sh/ADAM10-4和sh/Con;将重组质粒与慢病毒包装质粒及包膜质粒共转染293FT细胞,收获病毒颗粒,浓缩后测定病毒滴度,感染MM.1S细胞,流式细胞术分选GFP+细胞。利用实时定量PCR及Westem blot检测慢病毒载体介导的shRNA干扰ADAM10基因的作用。选取ADAM10下调最显著的细胞株,CCK-8法检测干扰ADAM10后细胞的增殖,Annexin V/7-AAD双染流式细胞术检测细胞存活与凋亡,定量PCR检测促凋亡基因BAD、BAK、BIK抑凋亡基因BCL-2、c-Myc以及Notch1及其下游靶基因Hes-1的转录变化。结果:成功构建了特异性干扰ADAM10表达的慢病毒载体,干扰ADAM10基因对MM.1S细胞的增殖具有抑制作用,并能诱导MM.1S细胞的凋亡,且促凋亡基因BAD、BAK表达升高,抑凋亡基因BCL-2、c-Myc表达降低。Q-PCR结果显示,干扰ADAM10后Notch1水平升高,Hes-1水平降低。结论:干扰ADAM10基因可显著抑制MM.1S细胞的增殖,促进其凋亡,其机制与Notch1信号通路有关。 展开更多

关键词 ADAM10基因 notch1信号通路 慢病毒载体 多发性骨髓瘤 MM.1S细胞

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人白介素-1受体拮抗剂、人白介素-10基因治疗载体构建与鉴定

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作者 韩飞 张宁 唐福林 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第5期482-482,共1页

关键词 白介素-1受体拮抗剂 白介素-10 逆转录病毒载体 基因治疗

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E1A激活基因阻遏子促进人血管平滑肌细胞分化和迁移 被引量：11

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作者 韩雅玲 胡叶 +3 位作者 刘海伟 康建 闫承慧 李少华 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2005年第6期517-522,共6页

为探讨E1A激活基因阻遏子(cellularrepressorofE1A-stimulatedgenes,CREG)蛋白在人血管平滑肌细胞株HITASY分化和迁移中的调控作用,构建了重组逆转录病毒载体pLNCX2(+)/CREG和pLXSN(-)/CREG.以带绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,G... 为探讨E1A激活基因阻遏子(cellularrepressorofE1A-stimulatedgenes,CREG)蛋白在人血管平滑肌细胞株HITASY分化和迁移中的调控作用,构建了重组逆转录病毒载体pLNCX2(+)/CREG和pLXSN(-)/CREG.以带绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)的空载体pLNCX(+)/GFP和正常HITASY为对照,用磷酸钙共沉淀法将重组逆转录病毒载体转染293细胞,包装出完整的逆转录病毒后,感染HITASY.经G418筛选,获得稳定感染的细胞克隆.应用免疫荧光染色、蛋白质印迹等方法检测CREG和平滑肌分化标志蛋白α-肌动蛋白(SMα-actin)表达,同时通过刮伤实验、慢速显微摄像技术检测细胞迁移能力以及用明胶酶谱方法分析细胞基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMPs)的活性.结果表明:pLNCX2(+)/CREG稳定感染的HITASY中CREG和SMα-actin蛋白表达上调,MMP-2和MMP-9活性升高,细胞迁移速度加快;pLXSN(-)/CREG稳定感染的HITASY中CREG和SMα-actin蛋白表达下调,MMP-2和MMP-9活性降低,细胞迁移速度减慢.上述研究提示CREG在诱导血管平滑肌细胞分化的同时促进细胞迁移. 展开更多

关键词 阻遏子 腺病毒蛋白E1A 分化 迁移 逆转录病毒载体 平滑肌

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