目的:了解金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)联合PML-RARα融合多肽体外诱导正常人外周血T细胞活化TCRζ链基因表达情况。方法:利用T细胞液体培养法分别与正常人外周血淋巴细胞加入PML-RARα融合多肽、SEA和SEA联合PML-RARα多肽诱导培养T细胞...目的:了解金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)联合PML-RARα融合多肽体外诱导正常人外周血T细胞活化TCRζ链基因表达情况。方法:利用T细胞液体培养法分别与正常人外周血淋巴细胞加入PML-RARα融合多肽、SEA和SEA联合PML-RARα多肽诱导培养T细胞,其中SEA刺激包括培养初始或培养第5天加入SEA两组(PS、PSI),并设空白对照组(不加多肽及SEA)。分别收集各组培养20 d后细胞提取mRNA并合成cDNA,采用SYBR G reenⅠ荧光定量PCR和相对定量检测TCRζ链在不同组别T淋巴细胞中的表达情况,以β2微球蛋白基因(β2M)作为内参,根据相对定量公式:2-△△C t分析TCRζ链表达差异。结果:与空白组相比,联合诱导组在培养初始加入SEA及第5天加入SEA的培养T细胞中TCRζ链表达上升,而单独SEA诱导组的TCRζ链表达下降。结论:超抗原SEA联合PML-RARα多肽体外诱导T细胞可使TCRζ链基因表达水平升高,有望为研制急性早幼粒细胞白血病疫苗提供新的切入点。展开更多
目的构建经MHCⅡ通路的屋尘螨1类变应原Der p 1的T细胞表位肽疫苗重组载体。方法分别合成TAT、Ih C和含编码Der p 1的3段T细胞表位的融合核苷酸序列,用特异性引物PCR扩增相应的基因片段,分别用相应的双酶切后,用T4 DNA连接酶连接形成TAT...目的构建经MHCⅡ通路的屋尘螨1类变应原Der p 1的T细胞表位肽疫苗重组载体。方法分别合成TAT、Ih C和含编码Der p 1的3段T细胞表位的融合核苷酸序列,用特异性引物PCR扩增相应的基因片段,分别用相应的双酶切后,用T4 DNA连接酶连接形成TAT-Ih C-Der p 1-3T融合基因,并插入至原核表达载体p ET-28a(+)中,构建重组原核表达载体p ET-28a(+)-TATIh C-Der p 1-3T,Bam HⅠ和XhoⅠ进行双酶切和测序鉴定。重组载体转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)菌株,IPTG诱导后,经SDS-PAGE电泳分析和Western blot验证,纯化TAT-Ih C-Der p 1-3T蛋白后进行Ig E结合试验。结果双酶切和测序结果表明,成功构建了p ET-28a-TAT-Ih C-Der p 1-3T重组原核表达载体;SDS-PAGE电泳分析显示TAT-Ih C-Der p 1-3T可诱导表达;Western blot检测表明该融合蛋白纯化成功;Ig E结合试验表明TAT-Ih C-Der p 1-3T结合屋尘螨过敏病人血清Ig E的能力强于Der p 1变应原(P<0.001)。结论成功构建了可表达经MHC通路的编码Der p 1的3段T细胞表位的重组p ET-28a-TAT-Ih C-Der p 1-3T载体,纯化的TAT-Ih C-Der p 1-3T具有较强的Ig E结合能力,从而为后续经MHC通路的特异性免疫治疗奠定基础。展开更多
文摘目的:了解金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)联合PML-RARα融合多肽体外诱导正常人外周血T细胞活化TCRζ链基因表达情况。方法:利用T细胞液体培养法分别与正常人外周血淋巴细胞加入PML-RARα融合多肽、SEA和SEA联合PML-RARα多肽诱导培养T细胞,其中SEA刺激包括培养初始或培养第5天加入SEA两组(PS、PSI),并设空白对照组(不加多肽及SEA)。分别收集各组培养20 d后细胞提取mRNA并合成cDNA,采用SYBR G reenⅠ荧光定量PCR和相对定量检测TCRζ链在不同组别T淋巴细胞中的表达情况,以β2微球蛋白基因(β2M)作为内参,根据相对定量公式:2-△△C t分析TCRζ链表达差异。结果:与空白组相比,联合诱导组在培养初始加入SEA及第5天加入SEA的培养T细胞中TCRζ链表达上升,而单独SEA诱导组的TCRζ链表达下降。结论:超抗原SEA联合PML-RARα多肽体外诱导T细胞可使TCRζ链基因表达水平升高,有望为研制急性早幼粒细胞白血病疫苗提供新的切入点。
基金grant of State Natural Science Foundation(30671832)Key Science and Technology Programof Guangdong Province (2003B31602)Key Science and Technology Program of Guangzhou (2005Z3-E0211) .
文摘目的构建经MHCⅡ通路的屋尘螨1类变应原Der p 1的T细胞表位肽疫苗重组载体。方法分别合成TAT、Ih C和含编码Der p 1的3段T细胞表位的融合核苷酸序列,用特异性引物PCR扩增相应的基因片段,分别用相应的双酶切后,用T4 DNA连接酶连接形成TAT-Ih C-Der p 1-3T融合基因,并插入至原核表达载体p ET-28a(+)中,构建重组原核表达载体p ET-28a(+)-TATIh C-Der p 1-3T,Bam HⅠ和XhoⅠ进行双酶切和测序鉴定。重组载体转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)菌株,IPTG诱导后,经SDS-PAGE电泳分析和Western blot验证,纯化TAT-Ih C-Der p 1-3T蛋白后进行Ig E结合试验。结果双酶切和测序结果表明,成功构建了p ET-28a-TAT-Ih C-Der p 1-3T重组原核表达载体;SDS-PAGE电泳分析显示TAT-Ih C-Der p 1-3T可诱导表达;Western blot检测表明该融合蛋白纯化成功;Ig E结合试验表明TAT-Ih C-Der p 1-3T结合屋尘螨过敏病人血清Ig E的能力强于Der p 1变应原(P<0.001)。结论成功构建了可表达经MHC通路的编码Der p 1的3段T细胞表位的重组p ET-28a-TAT-Ih C-Der p 1-3T载体,纯化的TAT-Ih C-Der p 1-3T具有较强的Ig E结合能力,从而为后续经MHC通路的特异性免疫治疗奠定基础。
