拟南芥受体激酶At CERK1胞外结构域互作蛋白的筛选与验证

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作者 史文炯 付振超 曾洪梅 《植物保护》 北大核心 2025年第3期113-121,134,共10页

几丁质激发子受体激酶1(chitin elicitor receptor kinase 1,CERK1)是一种含有溶素基序(lysin motif,LysM)的模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR),在植物免疫响应过程中起重要作用。目前发现CERK1识别的激发子主要为碳水化... 几丁质激发子受体激酶1(chitin elicitor receptor kinase 1,CERK1)是一种含有溶素基序(lysin motif,LysM)的模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR),在植物免疫响应过程中起重要作用。目前发现CERK1识别的激发子主要为碳水化合物,是否识别蛋白类配体还不清楚。禾谷镰刀菌Fusarium graminearum是众所周知的真菌病原体,可以侵染谷物也可以侵染拟南芥。为了确定CERK1的新功能并筛选获得新的激发子,我们以拟南芥几丁质激发子受体激酶胞外结构域(Arabidopsis thaliana chitin elicitor receptor kinase 1 extra cellular domain,At CERK1-ECD)为诱饵,通过酵母双杂交(yeast-two-hybrid,Y2H)筛选禾谷镰刀菌cDNA文库,获得候选互作蛋白内切葡聚糖酶5(Fg-endoglucanase-5)。内切葡聚糖酶是一类参与植物免疫反应及微生物侵染、定殖、共生的蛋白,Fg-endoglucanase-5是其中的一种。进一步,通过谷胱甘肽S-转移酶下拉(GST pull-down)和双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)试验验证了At CERK1-ECD与Fg-endoglucanase-5的相互作用,并分析了Fg-endoglucanase-5的功能。本研究获得了At CERK1-ECD的互作蛋白Fg-endoglucanase-5并阐明了它们在植物-微生物相互作用中的功能,有助于开发新型激发子并找到植物病害防治的新策略。 展开更多

关键词 拟南芥 几丁质激发子受体激酶胞外结构域 酵母双杂交 互作蛋白

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Notch1胞内结构域慢病毒表达载体及干扰载体的构建

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作者 周学亮 刘季春 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期692-696,共5页

目的构建高滴度大鼠N1ICD慢病毒过表达载体(LV-N1ICD)及N1ICD慢病毒干扰载体(LV-N1ICD-sh RNA)。方法以大鼠c DNA文库为模板,PCR法扩增N1ICD,通过定向克隆构建p GC-FU-N1ICD-3Flag穿梭质粒;设计4对N1ICD-sh RNA寡核苷酸序列,以构建GVC11... 目的构建高滴度大鼠N1ICD慢病毒过表达载体(LV-N1ICD)及N1ICD慢病毒干扰载体(LV-N1ICD-sh RNA)。方法以大鼠c DNA文库为模板,PCR法扩增N1ICD,通过定向克隆构建p GC-FU-N1ICD-3Flag穿梭质粒;设计4对N1ICD-sh RNA寡核苷酸序列,以构建GVC112-N1ICD-sh RNA干扰质粒,将p GC-FU-N1ICD-3Flag和GVC112-N1ICD-sh RNA共转293T细胞,检测Flag的表达,筛选理想的GVC112-N1ICD-sh RNA干扰质粒。将p GC-FU-N1ICD-3Flag或GVC112-N1ICD-sh RNA与p Helper 1.0、p Helper 2.0共转293T细胞,以包装LV-N1ICD和LV-N1ICD-sh RNA,分别利用Real-time PCR、药物筛选法进行病毒滴度测定。LV-N1ICD及LV-N1ICD-sh RNA分别感染H9c2心肌细胞,利用CCK-8检测细胞活力。结果 p GC-FU-N1ICD-3Flag和GVC112-N1ICD-sh RNA质粒经PCR、基因测序及Western-blotting验证构建成功,与p Helper 1.0、p Helper 2.0共转293T细胞后,取上清浓缩,分别获得高滴度LV-N1ICD和LV-N1ICD-sh RNA。LV-N1ICD可明显提高心肌细胞活力,LV-N1ICDsh RNA可降低心肌细胞活力。结论 LV-N1ICD和LV-N1ICD-sh RNA包装成功,具有Notch1信号通路生物学功能。 展开更多

关键词 notch信号通路 胞内结构域 慢病毒 质粒构建 RNA干扰 病毒包装

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淀粉样前体蛋白胞内结构域对阿尔茨海默病模型小鼠神经发生和学习记忆的影响

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作者 蒋梅 邓栩 +2 位作者 邱子雄 崔晓军 付媛 《中山大学学报（医学科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期683-693,共11页

【目的】探讨淀粉样前体蛋白胞内结构域(AICD)对阿尔茨海默病(AD)模型动物神经发生、学习记忆的影响。【方法】本研究使用免疫荧光染色检测AICD转基因小鼠来源的体外培养的神经前体细胞(NPCs)、胚胎大脑皮质、成年海马齿状回(DG)中增殖... 【目的】探讨淀粉样前体蛋白胞内结构域(AICD)对阿尔茨海默病(AD)模型动物神经发生、学习记忆的影响。【方法】本研究使用免疫荧光染色检测AICD转基因小鼠来源的体外培养的神经前体细胞(NPCs)、胚胎大脑皮质、成年海马齿状回(DG)中增殖和分化的细胞数目;水迷宫实验检测老年AICD转基因小鼠对学习记忆能力影响;生物信息学预测和分析潜在的分子机制。【结果】免疫荧光染色结果显示AICD转基因模型体外NPCs、胚胎皮质、海马DG区域的神经干细胞和神经元数量减少(P<0.05),即AICD抑制不同时期AD模型小鼠的神经发生。水迷宫结果显示AICD增加AD模型小鼠逃逸潜伏期,减少其跨越平台次数,并减少DG区域神经元数目(P<0.05)。生物信息学结果显示,AICD参与调节AD发病进程中神经发生和学习记忆的靶点有1723个,关键靶点有TP53、CTNNB1、Akt1、EGFR、SRC、EP300、HDAC1、STAT3、HSP90AA1和MAPK1;另外,KEGG通路注释分析发现PI3KAkt、HIF-1等信号通路在AICD调节神经发生和学习记忆起关键作用。【结论】表明AICD可以抑制AD模型小鼠海马神经发生进而损害学习记忆能力,这可能与PI3K-Akt和HIF-1等信号通路有关。本研究为进一步理解AICD在AD发病进程中作用提供实验依据。 展开更多

关键词 淀粉样前体蛋白胞内结构域 阿尔茨海默病 神经发生 学习记忆 网络药理学

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铜绿假单胞菌群体感应代谢产物通过细胞表面脂质结构域溶解诱导宿主淋巴细胞死亡的机制 被引量：1

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作者 祝司霞 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第8期922-926,共5页

目的:探讨铜绿假单胞菌群体感应代谢产物通过细胞表面脂质结构域溶解诱导宿主淋巴细胞死亡的机制。方法:SPF级C57BL/6野生型小鼠于8~10周龄时给予铜绿假单胞菌感染,并进行3oc治疗。AnnexinV/PI凋亡检测法检测T细胞凋亡情况,免疫共沉淀和... 目的:探讨铜绿假单胞菌群体感应代谢产物通过细胞表面脂质结构域溶解诱导宿主淋巴细胞死亡的机制。方法:SPF级C57BL/6野生型小鼠于8~10周龄时给予铜绿假单胞菌感染,并进行3oc治疗。AnnexinV/PI凋亡检测法检测T细胞凋亡情况,免疫共沉淀和Western blot检测凋亡相关蛋白活性,RT-qPCR检测IL-1 mRNA、IL-6 mRNA表达。H9细胞与500μm 3oc HSL或3-oxo-C8HSL或3-oxo-C10 HSL孵育5/10 min,检测铜绿假单胞菌通过3oc诱导溶解诱导宿主淋巴细胞情况。结果:3oc浓度增加,T细胞活细胞数减少(P<0.05)。与对照组相比,3oc处理的CD4 T细胞中caspase-3和caspase-9蛋白活性降低,Cld caspase-3和Cld caspase-9蛋白活性增强(P<0.05),3oc浓度与caspase-3和caspase-9表达呈负相关,与Cld caspase-3和Cld caspase-9表达呈正相关。3oc浓度增加,caspase-3和caspase-3蛋白活性降低,Cld caspase-3和Cld caspase-9蛋白活性增加(P<0.05)。与对照组相比,3oc处理的IL-1和IL-6 mRNA表达增加,随着3oc浓度增加,IL-1和IL-6 mRNA表达增加(P<0.05)。lasI缺陷和lasR缺陷均导致细胞数减少(P<0.05)。突变体感染小鼠的肺部提取物显示,铜绿假单胞菌菌落形成单位减少(P<0.05)。结论:3oc通过直接引发宿主自身TNFR1信号解除免疫反应治疗铜绿假单胞菌感染。 展开更多

关键词 铜绿假单胞菌 群体感应 代谢产物 脂质结构域 淋巴细胞

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PH结构域与细胞方向感觉

5

作者 李世迎 李晓辉 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2001年第2期145-147,共3页

PH (pleckstrinhomology)结构域与细胞方向感觉关系密切 ,目前已发现 ,PH结构域存在于 6 0多种蛋白质中 ,这些蛋白质能与趋化细胞胞膜表面的相关结合位点结合 ,进而激发信号转导的下游事件 .这种结合有以下特点 :a 迅速而短暂 ;b 只与... PH (pleckstrinhomology)结构域与细胞方向感觉关系密切 ,目前已发现 ,PH结构域存在于 6 0多种蛋白质中 ,这些蛋白质能与趋化细胞胞膜表面的相关结合位点结合 ,进而激发信号转导的下游事件 .这种结合有以下特点 :a 迅速而短暂 ;b 只与外界环境中两点间浓度梯度差相关 ,据此提出了“空间模式” ;c 改变趋化剂的位置时 ,结合位点在胞膜上的分布也随之改变 ,由此提出了“时间模式” .深入而全面地探讨各种PH结构域及其结合位点在细胞方向感觉中的作用 ,对于细胞方向感觉的研究具有巨大的推动作用和深远的理论意义 . 展开更多

关键词 PH结构域 细胞方向感觉 胞浆腺苷酸环化酶调节因子 定向移动 趋化细胞

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His-tag的人胞浆磷脂酶A_2的C2结构域的表达、纯化及性质

6

作者 谭波 张文河 张洪杰 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第4期502-506,共5页

带有His tag的人胞浆磷脂酶A2 的C2结构域高效表达 ,用内源荧光的变化测定了其稳定性和其与钙离子结合的结合常数 .结果表明 ,带有His tag的C2结构域仍可有效用于研究其折叠及其与钙离子的协同性结合 ,温度从 2 2℃升高到 35℃时 ,C2结... 带有His tag的人胞浆磷脂酶A2 的C2结构域高效表达 ,用内源荧光的变化测定了其稳定性和其与钙离子结合的结合常数 .结果表明 ,带有His tag的C2结构域仍可有效用于研究其折叠及其与钙离子的协同性结合 ,温度从 2 2℃升高到 35℃时 ,C2结构域和钙离子结合的协同性程度显著增强 . 展开更多

关键词 C2结构域 人胞浆磷脂酶A2 去折叠 钙离子结合 协同性

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Ccdc115基因对鼠伤寒沙门菌感染RAW264.7细胞吞噬体酸化及生存能力的影响

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作者 谢荣现 程龙云 +3 位作者 袁西露 李丽 李冰清 贾海红 《中国人兽共患病学报》 北大核心 2025年第6期559-566,共8页

目的分析CCDC115(Coiled-Coil Domain-Containing Protein 115)的蛋白性质,利用Ccdc115基因缺失的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7),探究CCDC115对胞内鼠伤寒沙门菌生存的影响,为开展CCDC115功能研究及调控胞内沙门菌生存的机制研... 目的分析CCDC115(Coiled-Coil Domain-Containing Protein 115)的蛋白性质,利用Ccdc115基因缺失的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7),探究CCDC115对胞内鼠伤寒沙门菌生存的影响,为开展CCDC115功能研究及调控胞内沙门菌生存的机制研究提供理论基础。方法采用生物信息学分析,对CCDC115的基本性质进行探究。依据CRISPR/Cas9基因编辑技术构建RAW264.7-Ccdc115-KO细胞系。将鼠伤寒沙门菌感染RAW264.7及RAW264.7-Ccdc115-KO细胞,通过RT-qRCR、Western Blot、CFU(Colony-Forming Units)计数、酸化成像研究CCDC115在鼠伤寒沙门菌胞内生存中的作用。结果CCDC115是由2个α螺旋及中间无序区组成的不稳定蛋白,无跨膜结构域。成功构建敲除Ccdc115基因的RAW264.7细胞系。鼠伤寒沙门菌感染细胞后,在RAW264.7细胞中mRNA水平和蛋白水平CCDC115表达增加,并且在RAW264.7-Ccdc115-KO细胞内增殖数量是RAW264.7细胞的1.5倍。在吞噬体酸化成像中,鼠伤寒沙门菌吞噬体在RAW264.7细胞中发生酸化,而在RAW264.7-Ccdc115-KO细胞中没有发生酸化。结论成功构建RAW264.7-Ccdc115-KO细胞系;CCDC115在鼠伤寒沙门菌感染过程中表达增加,并可能通过使吞噬体发生酸化抑制鼠伤寒沙门菌在细胞内生存。 展开更多

关键词 卷曲螺旋结构域蛋白115 鼠伤寒沙门菌 RAW264.7 胞内生存 吞噬体酸化

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细菌四类胞外感觉结构域的概述

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作者 许阳阳 袁文肃 《湖北农业科学》 2022年第11期149-157,共9页

细菌通过信号转导网络系统感知外界的环境变化,并通过调节自身基因表达,控制菌体的行为、代谢以及发育等。细菌和古细菌大多数使用双组分转导系统和化学传感系统感知环境变化。基于基因组研究发现在细菌的双组份转导系统和化学传感系统... 细菌通过信号转导网络系统感知外界的环境变化,并通过调节自身基因表达,控制菌体的行为、代谢以及发育等。细菌和古细菌大多数使用双组分转导系统和化学传感系统感知环境变化。基于基因组研究发现在细菌的双组份转导系统和化学传感系统中存在多种不同的胞外结构域,这些胞外结构域能感知胞外信号,对细菌的各种生理功能具有重要作用。介绍了Cache结构域、CHASE结构域、NIT结构域以及4HB结构域这4类胞外感觉结构域的结构特性以及功能,为胞外感觉结构域的分类以及识别信号的位点提供借鉴。 展开更多

关键词 信号转导 双组份系统 化学传感系统 胞外感觉结构域

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Notch家族4个蛋白质对人胰腺癌细胞HPAC中YY1和EGFR表达的影响 被引量：1

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作者 陈佳 李炳秋 张玉祥 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第6期599-607,共9页

Notch信号通路是肿瘤形成过程中一种重要的信号通路,其中心分子为Notch受体.Notch受体为细胞膜上的单次跨膜蛋白,介导细胞间信号转导,哺乳动物细胞内包括Notch1、Notch2、Notch3和Notch4的4个成员.Notch家族4个蛋白质在结构和功能上存... Notch信号通路是肿瘤形成过程中一种重要的信号通路,其中心分子为Notch受体.Notch受体为细胞膜上的单次跨膜蛋白,介导细胞间信号转导,哺乳动物细胞内包括Notch1、Notch2、Notch3和Notch4的4个成员.Notch家族4个蛋白质在结构和功能上存在差异.前期研究显示,Notch1信号通路与转录因子YY1(YING-YANG 1)、表皮生长因子受体(EGFR)间存在调控作用.本研究在人胰腺癌细胞HPAC中,采用RNA干扰技术,分别降低细胞中Notch家族4个蛋白质的表达,检测YY1和EGFR在m RNA和蛋白质水平上的表达;并构建相应的激活形式的Notch受体——Notch胞内结构域(Notch intracellular domain,NICD)真核表达质粒,在HPAC细胞中分别过表达4种NICD,检测其对YY1和EGFR表达水平的影响.结果显示,降低细胞中Notch1或Notch3的表达,均使HPAC细胞中EGFR m RNA和蛋白质水平升高(P<0.05),而降低Notch2和Notch4后,EGFR m RNA和蛋白质水平没有改变(P>0.05).分别降低4个Notch的表达,对YY1的蛋白质和m RNA表达水平均没有改变(P>0.05).在HPAC细胞中过表达N1ICD和N3ICD后,YY1和EGFR的蛋白质水平降低(P<0.05),而过表达N2ICD和N4ICD后,YY1和EGFR蛋白质水平没有改变(P>0.05).分别过表达4种NICD均没有改变YY1和EGFR的m RNA表达水平(P>0.05).初步得出结论是,在HPAC细胞中,Notch信号通路经Notch1和Notch3影响EGFR的表达.Notch1和Notch3对EGFR的表达可能具有负调控作用.在Notch1和Notch3过度激活时,这种调控作用通过YY1介导.本文可为深入研究Notch信号通路对胰腺癌发生发展的作用机制提供有意义的参考. 展开更多

关键词 胰腺癌 notch信号通路 notch胞内结构域 YY1(YING-YANG1) 表皮生长因子受体

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激活Notch1信号通路对胰腺癌细胞增殖的影响 被引量：8

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作者 杜潇 张思琴 +5 位作者 程中 李旸 王自强 陈志新 胡建昆 周总光 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第10期1494-1498,共5页

目的探讨转染人Notchl受体胞内段（NIcD）质粒激活Notchl信号通路对胰腺癌细胞增殖的影响及其可能机制。方法构建带免疫荧光的NICD质粒与对照质粒，细胞转染后荧光激发显微镜下观察转染效率，Real-timePcR检测靶基因Hesl表达水平变化；... 目的探讨转染人Notchl受体胞内段（NIcD）质粒激活Notchl信号通路对胰腺癌细胞增殖的影响及其可能机制。方法构建带免疫荧光的NICD质粒与对照质粒，细胞转染后荧光激发显微镜下观察转染效率，Real-timePcR检测靶基因Hesl表达水平变化；CCK．8法计算NICD质粒转染后胰腺癌细胞增殖的影响；caspase3试剂盒检测NICD转染后凋亡通路关键酶caspase3活性的变化。结果荧光激发显示NICD转染效率在60％～80％之间；NICD转染可促进靶基因Hesl表达，提示激活Notchl信号通路。NICD转染可显著促进胰腺癌细胞生长增殖；caspase3活性在NICD转染后明显下降，差异均具有统计学意义。结论应用NICD质粒转染激活Notchl信号通路活性可通过抑制凋亡而促进胰腺癌细胞生长增殖。 展开更多

关键词 胰腺癌 notch信号通路 notch胞内段 增殖 凋亡

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Notch1胞内段在鼻咽癌组织及鼻咽癌细胞株中的表达研究 被引量：6

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作者 张芳婷 万汇涓 +4 位作者 李明华 刘晓翌 尹美珺 叶静 于洁 《中国全科医学》 CAS CSCD 北大核心 2012年第24期2782-2784,共3页

目的探讨Notch1胞内段(NIC)在非角化性鼻咽癌组织和细胞株中的表达。方法采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫组化染色方法对鼻咽癌标本及不同分化程度鼻咽癌细胞株进行检测。结果 RT-PCR检测显示不同鼻咽癌细胞株中NIC基因均有表达,... 目的探讨Notch1胞内段(NIC)在非角化性鼻咽癌组织和细胞株中的表达。方法采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)及免疫组化染色方法对鼻咽癌标本及不同分化程度鼻咽癌细胞株进行检测。结果 RT-PCR检测显示不同鼻咽癌细胞株中NIC基因均有表达,但分化程度高的CNE1细胞株表达最明显;同期进行的免疫组化染色结果与之相似;对鼻咽癌标本的免疫组化染色结果显示:鼻咽癌组织中NIC的表达高于鼻咽慢性黏膜炎症组织(P=0.005),而且NIC的表达强度与细胞分化程度密切相关(P<0.05),与患者性别、年龄无相关性(P>0.05)。另外,在未分化型鼻咽癌中,癌巢内几乎无阳性表达,淋巴细胞阳性表达多;而在分化型鼻咽癌中癌细胞阳性表达明显,可见于胞膜、胞质及胞核。结论 Notch信号系统参与鼻咽癌的发生,其中Notch1的表达与鼻咽癌的分化程度相关。 展开更多

关键词 非角化性鼻咽癌 notch1胞内段 免疫组化染色 反转录聚合酶链反应

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苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的结构与功能研究进展 被引量：4

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作者 邵宗泽 刘子铎 喻子牛 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2000年第5期476-480,共5页

苏云金芽胞杆菌 (Bacillusthuringiensis)杀虫晶体蛋白的毒性肽由三个典型的结构域组成 .结构域Ⅰ位于肽链的N端 ,为一组由 6～ 7个两亲的α螺旋围绕着一个疏水的α螺旋形成的α螺旋束 ,参与了细胞膜的穿孔 ;结构域Ⅱ位于肽链的中间 ,... 苏云金芽胞杆菌 (Bacillusthuringiensis)杀虫晶体蛋白的毒性肽由三个典型的结构域组成 .结构域Ⅰ位于肽链的N端 ,为一组由 6～ 7个两亲的α螺旋围绕着一个疏水的α螺旋形成的α螺旋束 ,参与了细胞膜的穿孔 ;结构域Ⅱ位于肽链的中间 ,为三组以“希腊钥匙” (Greekkey)拓扑结构连接在一起的反平行的 β折叠片层 ,其顶端的突环参与了毒素与受体蛋白的结合 ;位于C端的结构域Ⅲ是由两组反平行的 β折叠片层组成的夹心结构 ,以 β果酱卷 (jellyroll)拓扑结构排列 。 展开更多

关键词 苏云金芽胞杆菌 杀虫晶体蛋白 结构域 功能

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大鼠Notch1胞质段的克隆及其表达 被引量：2

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作者 金卫林 廖柏松 鞠躬 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2001年第3期362-366,共5页

Notch 1信号途径参与决定细胞命运 ,其水解后产生的活性片段———胞质段 (Notch 1intracellularcytoplasmicdomain ,NICD)能被转运进核 ,激活下游靶基因的表达 .Notch 1参与细胞的增殖、分化、程序性死亡、发育过程中的形态发生和器官... Notch 1信号途径参与决定细胞命运 ,其水解后产生的活性片段———胞质段 (Notch 1intracellularcytoplasmicdomain ,NICD)能被转运进核 ,激活下游靶基因的表达 .Notch 1参与细胞的增殖、分化、程序性死亡、发育过程中的形态发生和器官形成等许多重要过程 .为了获得重组的NICD ,以大鼠脑cDNA文库为模板 ,用PCR方法扩增出编码NICD的基因片段 ,克隆至谷胱甘肽 S 转移酶 (GST)融合表达载体pGEX KG中 ,并在大肠杆菌中获得较高水平的表达 .表达的融合蛋白GST NICD分子质量约为 12 0ku左右 ,以包涵体和可溶性两种形式存在 ,易于亲合层析纯化 .为制备抗体和进一步的功能研究奠定了基础 . 展开更多

关键词 notch1 胞质段 克隆 表达 神经元 重组蛋白

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人胰岛素样生长因子1受体β结构域蛋白的原核表达及活性检测 被引量：1

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作者 郭靖 冯滢滢 +5 位作者 王涛 张柯 李玲 冀全博 徐小洁 叶棋浓 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第9期1211-1215,共5页

目的构建人胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)β亚基胞外结构域(ED)和胞内激酶(PKD)结构域的原核表达载体,获得纯化的GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD融合蛋白,并检测其活性。方法用PCR方法从乳腺cDNA文库中扩增IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PK... 目的构建人胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)β亚基胞外结构域(ED)和胞内激酶(PKD)结构域的原核表达载体,获得纯化的GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD融合蛋白,并检测其活性。方法用PCR方法从乳腺cDNA文库中扩增IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD基因编码序列,将其正确插入pGEX-KG载体。重组质粒转化大肠杆菌Rossate表达后,用GST-Sepharose 4B珠子纯化融合蛋白,并用Western blot法检测融合蛋白表达,最后用GST pull-down技术检测纯化蛋白与已知蛋白表皮生长因子受体2驱动的细胞运动调节蛋白(MEMO)的相互作用。结果构建得到GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD基因的原核表达载体,双酶切鉴定得到与预期片段大小相符的外源基因插入片段,测序后与目的序列一致;在Rossate菌中诱导表达出与预期位置相符的目的蛋白,并经过Western blot检测,融合蛋白成功表达;纯化得到GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD两个融合蛋白,GST pull-down证明蛋白GST-IGF1Rβ-PKD可以和MEMO相互作用。结论成功克隆GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD基因,并获得活性良好的GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD蛋白。 展开更多

关键词 胰岛素样生长因子1受体(IGF1R) β亚基胞外结构域 β亚基胞内蛋白激酶结构域 原核表达 纯化 表皮生长因子受体2驱动的细胞运动调节蛋白(MEMO)

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Bt菌株中Cry1Ia和Cry2Ab结构域交换突变体的表达形式 被引量：1

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作者 高建华 牛鑫 +3 位作者 常亚男 任善崇 郑永松 霍利杰 《山西农业科学》 2015年第6期668-670,共3页

前期构建了一系列Cry1Ia和Cry2Ab蛋白的结构域交换突变体,并在Bt菌株中获得了可观的表达。对6种突变体的表达形式及分泌与否进行了分析和检测。结果显示,6种突变体在Bt中以包涵体的形式存在于菌液沉淀中;这些包涵体与正常Cry蛋白形成的... 前期构建了一系列Cry1Ia和Cry2Ab蛋白的结构域交换突变体,并在Bt菌株中获得了可观的表达。对6种突变体的表达形式及分泌与否进行了分析和检测。结果显示,6种突变体在Bt中以包涵体的形式存在于菌液沉淀中;这些包涵体与正常Cry蛋白形成的晶体不同,不能溶于Na2CO3缓冲液。蛋白印迹法检测结果显示,带有Cry1Ia分泌信号肽的突变体IAA,IIA和IAI蛋白未分泌到胞外,这可能是由于蛋白表达量过快,迅速聚集而形成包涵体,从而无法分泌到胞外。 展开更多

关键词 Cry蛋白 结构域交换突变体 胞外分泌 包涵体

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过表达Notch1的胞内段基因对人牙周膜干细胞增殖能力影响 被引量：6

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作者 龙晏 邱申彩 +4 位作者 李淑慧 舍玉秀 王娜 陈晓燕 吴佩玲 《口腔医学研究》 CAS 北大核心 2019年第1期28-32,共5页

目的:探讨过表达Notch1的胞内段(Notch1intracellular domain,NICD)基因对人牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)增殖能力的影响。方法:构建含NICD基因过表达的逆转录病毒颗粒,并将其转染至牙周膜干细胞,构建过表达N... 目的:探讨过表达Notch1的胞内段(Notch1intracellular domain,NICD)基因对人牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)增殖能力的影响。方法:构建含NICD基因过表达的逆转录病毒颗粒,并将其转染至牙周膜干细胞,构建过表达NICD的细胞株PDLSCs/NICD,转染48h后观察细胞一般状态。PDLSCs/NICD为实验组,以PDLSCs/wt为正常细胞组和PDLSCs/vector空病毒转染组作为对照,通过实时定量聚合酶链锁反应(quantitative Real-time-Polymerase chain reaction,qRT-PCR)和Western blot检测NICD mRNA及其蛋白的表达;细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)法检测细胞的增殖情况;Transwell实验检测细胞的迁移能力。结果:Western blot和qRT-PCR结果显示,与PDLSCs/wt组和PDLSCs/vector组比较,PDLSCs/NICD组的NICD蛋白表达水平及其mRNA表达水平均明显升高(P<0.05);CCK-8结果提示,与PDLSCs/vector组比较,PDLSCs/NICD组细胞增殖速度加快,Transwell实验结果显示,PDLSCs/NICD组的细胞迁移(40.20±1.74)明显高于PDLSCs/vector组(21.20±1.18)。结论:NICD基因过表达的人PDLSCs在一定程度上增殖及迁移能力加强。 展开更多

关键词 牙周膜干细胞 notch1的胞内段 转染 增殖 迁移

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白血病细胞中共表达P2X7受体和Notch1胞内区 被引量：2

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作者 冯丽 杨骁 +5 位作者 廖金凤 陈莎燕 冯文利 林永敏 任倩 郑国光 《中国实验血液学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期544-549,共6页

本研究旨在构建野生型及N187D突变型P2X7与ICN1基因的共表达载体,并在白血病细胞中表达,为进一步探讨P2X7在白血病发展中的作用奠定基础。采用Overlap PCR法,通过2A连接,构建野生型或N187DP2X7与ICN1的共表达载体;经DNA序列分析验证后,... 本研究旨在构建野生型及N187D突变型P2X7与ICN1基因的共表达载体,并在白血病细胞中表达,为进一步探讨P2X7在白血病发展中的作用奠定基础。采用Overlap PCR法,通过2A连接,构建野生型或N187DP2X7与ICN1的共表达载体;经DNA序列分析验证后,包装病毒、感染K562细胞并经细胞分选获得稳定感染细胞系。采用RT-PCR、Western blot、胞浆游离钙离子浓度测定等方法,验证外源基因的表达及P2X7受体的功能。结果表明,序列分析显示载体构建正确;包装病毒对K562细胞感染效率40%-70%,流式分选获得稳定表达细胞株;RT-PCR结果显示,P2X7受体和/或ICN1基因可在对应的稳定表达细胞株中高效表达;Western blot也证明,P2X7受体可在感染编码P2X7受体基因病毒的K562细胞中高效表达;胞浆游离钙离子浓度检测显示,在BzATP刺激下,表达野生及N187D突变型P2X7的K562细胞胞浆游离钙离子浓度持续升高。结论:本研究在白血病细胞中成功共同高表达P2X7受体与ICN1,为进一步探讨野生型和N187D突变型P2X7受体在白血病发展中的作用奠定基础。 展开更多

关键词 白血病细胞 P2X7受体 notch1 胞内区

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重组腺病毒过表达Notch1受体胞内结合域(NICD1)外源性激活Notch信号通路 被引量：1

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作者 廖军义 杜婷婷 +2 位作者 黄伟 何通川 徐伟 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2019年第3期320-325,共6页

目的:构建Notch1受体胞内结合域(Notch1 intracellular domain,NICD1)的重组腺病毒AdNICD1,探讨外源性过表达AdNICD1对Notch信号通路激活的影响。方法:利用高保真PCR(high fidelity PCR,Hi-Fi PCR)扩增NICD1编码区,并通过Gibson Assembl... 目的:构建Notch1受体胞内结合域(Notch1 intracellular domain,NICD1)的重组腺病毒AdNICD1,探讨外源性过表达AdNICD1对Notch信号通路激活的影响。方法:利用高保真PCR(high fidelity PCR,Hi-Fi PCR)扩增NICD1编码区,并通过Gibson Assembly方法将其克隆至腺病毒载体中,经过菌落PCR、测序鉴定后,在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,再次通过质粒PCR鉴定,然后运用PacⅠ酶切线性化后用重组腺病毒载体转染过表达pTP基因的人胚肾293细胞(human embryo kidney 293 cell line,HEK293)中进行包装,收取病毒后使用过表达pTP基因的HEK293细胞扩增重组腺病毒AdNICD1。运用AdNICD1感染脂肪来源的间充质干细胞(immortalized multipotent adipose-derived mesenchymal stem cells,iMAD),检测病毒感染效率;通过Q-PCR检测NICD1和Notch下游基因表达情况;利用Westernblot检测NICD1在蛋白水平的表达情况。结果:成功构建过表达NICD1的重组腺病毒并有效感染iMAD;利用AdNICD1可明显增加NICD1在基因和蛋白水平的表达,并激活Notch信号下游基因的表达。结论:成功构建过表达NICD1的重组腺病毒,并有效激活Notch信号通路。 展开更多

关键词 notch1受体胞内结合域 重组腺病毒 notch信号通路

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5-氮杂胞苷可通过抑制Notch1通路诱导食管癌细胞凋亡 被引量：5

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作者 徐瞳 胡丽娜 +2 位作者 郭显智 潘健健 余明华 《中国癌症杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第10期726-732,共7页

背景与目的:5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-azaC)作为一种DNA甲基转移酶抑制剂在临床上已用于多种恶性肿瘤的治疗,但有关5-azaC在食管癌中作用的研究相对较少。凋亡逃逸是肿瘤主要特点之一,也是抗肿瘤治疗研究的热点。Notch1信号通路是促... 背景与目的:5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-azaC)作为一种DNA甲基转移酶抑制剂在临床上已用于多种恶性肿瘤的治疗,但有关5-azaC在食管癌中作用的研究相对较少。凋亡逃逸是肿瘤主要特点之一,也是抗肿瘤治疗研究的热点。Notch1信号通路是促进食管癌发生、发展的重要通路之一,与细胞的增殖、侵袭及凋亡等密切相关。该研究旨在探讨5-azaC对食管癌细胞凋亡的作用及其对Notch1信号通路的影响,从而探索5-azaC作用可能涉及的机制。方法:采用50μmol/L浓度的5-azaC处理TE-1及OE33两种食管癌细胞系;采用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测5-azaC对细胞增殖的抑制效率;采用倒置显微镜观察细胞形态变化;采用流式细胞术、蛋白质印迹法(Western blot)检测两种细胞株在药物处理组与空白对照组的凋亡情况及抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-XL(B-cell lymphoma-extra large,BCL-XL)的表达;采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)及Western blot分别检测两种细胞系中Notch1 mRNA表达和蛋白水平的变化及其Notch细胞内区(Notch intracellular domain,NICD)蛋白水平的变化。结果:5-azaC可诱导食管癌细胞TE-1及OE33凋亡,并明显抑制两种细胞增殖;5-azaC作用于TE-1及OE33细胞时可使Notch1 mRNA表达升高,而NICD蛋白表达水平显著下降。结论:5-azaC对食管鳞癌细胞株TE-1及食管腺癌细胞株OE33均有较强的促凋亡作用,其作用机制可能是通过下调NICD蛋白从而抑制Notch1信号通路。 展开更多

关键词 5-氮杂胞苷 食管癌 notch1信号通路

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机械力调控PD-1介导的T细胞抑制

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作者 陈辉 张勇 +3 位作者 崔蕾 范娟 陈伟 娄继忠 《医用生物力学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第S01期401-402,共2页

目的PD-1与其配体PD-L1或PD-L2结合后,可以抑制TCR信号、阻止T细胞活化,是抗肿瘤免疫疗法中广泛应用的检查点分子。然而PD-1信号转导的分子机制目前还不清楚,本研究希望从生物力学角度出发研究PD-1与其配体之间的相互作用,进而明晰PD-1... 目的PD-1与其配体PD-L1或PD-L2结合后,可以抑制TCR信号、阻止T细胞活化,是抗肿瘤免疫疗法中广泛应用的检查点分子。然而PD-1信号转导的分子机制目前还不清楚,本研究希望从生物力学角度出发研究PD-1与其配体之间的相互作用,进而明晰PD-1抑制T细胞的分子机制,为基于PD-1的抗肿瘤免疫疗法开发提供指导。方法综合利用生物膜力探针、分子动力学模拟、超分辨成像技术以及传统的免疫学手段研究了PD-1与其配体在力加载条件下的相互作用以及机械力对PD-1信号的调控。结果PD-1与配体形成逆锁键,复合体结构除了在晶体结构中观察到的不受力的构象外,还存在一个力诱导以及力稳定的构象,而稳定这两种构象的相应残基的突变会削弱逆锁键并降低PD-1的抑制功能。基于DNA力探针的T细胞活化实验也证明机械力加载是导致PD-1信号活化以及T细胞抑制的重要因素。PD-L1的可溶性胞外结构域可以结合PD-1同时不提供外力,能与细胞表面表达的PD-L1竞争,从而削弱PD-1对T细胞活化的抑制作用,抑制小鼠肿瘤生长。结论PD-1与其配体相互作用介导的T细胞抑制受机械力调控,PD-L1可溶性胞外结构域由于能结合PD-1同时不提供外力刺激,因此是一种潜在的PD-1阻断剂。 展开更多

关键词 T细胞活化 小鼠肿瘤 生物力学 检查点 胞外结构域 阻断剂 抑制功能 超分辨成像

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