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基于Cre/Loxp系统的Csf1r-Cre^(ERT2)R26R^(EYFP)报告基因小鼠的构建及效率检测
1
作者 朱向玲 吴旭铭 +5 位作者 王卉卉 周园园 王安琪 张慧茹 刘崇 涂佳杰 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2024年第7期1175-1180,共6页
目的构建报告基因小鼠,评价Csf1r-Cre^(ERT2)介导增强黄色荧光素蛋白EYFP标记组织CD45^(+)细胞CSF1R的效率。方法Csf1r-Cre^(ERT2)小鼠与R26R^(EYFP)小鼠繁育,他莫昔芬诱导、PCR筛选Csf1r-Cre^(ERT2)R26R^(EYFP)小鼠,流式细胞术和Wester... 目的构建报告基因小鼠,评价Csf1r-Cre^(ERT2)介导增强黄色荧光素蛋白EYFP标记组织CD45^(+)细胞CSF1R的效率。方法Csf1r-Cre^(ERT2)小鼠与R26R^(EYFP)小鼠繁育,他莫昔芬诱导、PCR筛选Csf1r-Cre^(ERT2)R26R^(EYFP)小鼠,流式细胞术和Western blot分析EYFP对不同组织以及不同组织CD45^(+)细胞中CSF1R的标记效率。结果获得Csf1r-Cre^(ERT2)R26R^(EYFP)报告基因小鼠。此外,Csf1r-Cre^(ERT2)小鼠介导EYFP可有效标记小鼠组织CSF1R以及不同部位中CD45^(+)细胞。与R26R^(EYFP)组比较,Csf1r-Cre^(ERT2)小鼠介导EYFP标记效率最高的是脑组织(P<0.001),最低的是胸腺组织(P<0.05),脾脏组织则差异无统计学意义。结论成年Csf1r-Cre^(ERT2)小鼠与R26R^(EYFP)小鼠是获得Csf1r-Cre^(ERT2)R26R^(EYFP)诱导型条件性荧光小鼠的有效途径。Csf1r-Cre^(ERT2)介导EYFP可对小鼠不同部位CSF1R以及CD45^(+)细胞中CSF1R进行有效示踪。 展开更多
关键词 Csf1r-cre^(ERT2) R26R^(EYFP) cre/loxp系统 CD45 流式细胞术
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基于Cre/loxP系统的糖皮质激素受体基因条件性打靶嵌合鼠的获得 被引量：2
2
作者 何志颖 姚玉成 +2 位作者 李建秀 王新民 胡以平 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期290-293,共4页
目的:应用Cre/loxP系统建立诱导型糖皮质激素受体(GR)基因剔除小鼠模型,为在体内直接进行GR基因的研究提供条件。方法:针对GR基因第2外显子构建诱导型目标载体,将打靶载体电穿孔转染胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES),经Southern杂交... 目的:应用Cre/loxP系统建立诱导型糖皮质激素受体(GR)基因剔除小鼠模型,为在体内直接进行GR基因的研究提供条件。方法:针对GR基因第2外显子构建诱导型目标载体,将打靶载体电穿孔转染胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES),经Southern杂交筛选发生正确同源重组的ES细胞,囊胚注射法制备嵌合体并进行生殖系检测及纯化建系。结果:成功构建了针对GR基因第2外显子的诱导型目标载体,转染ES细胞获得了工程化的ES细胞,经囊胚注射获得了由工程化的ES细胞和体细胞共同发育而来的嵌合体小鼠。结论:基于Cre/loxP系统的GR基因条件性打靶嵌合鼠的获得,为得到理想的诱导型GR基因剔除小鼠模型奠定了基础。 展开更多
关键词 受估 糖皮质激素 嵌和体 cre/loxp系统 胚胎干细胞
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SV40TAg基因和Cre/loxP系统诱导正常人黑素细胞可逆性永生化的初探 被引量：2
3
作者 王鹰 邓军 +2 位作者 郝飞 杨希川 钟白玉 《临床皮肤科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第10期627-630,共4页
目的:研究Cre/loxP系统和SV40TAg基因在体外对人正常黑素细胞的可逆性永生化诱导作用。方法:将Cre-ERT2反转录病毒导入包装细胞PA317,获得的病毒上清感染SV40TAg基因诱导转化的永生化黑素细胞,三苯氧胺(tamoxifen)诱导Cre重组酶表达,分... 目的:研究Cre/loxP系统和SV40TAg基因在体外对人正常黑素细胞的可逆性永生化诱导作用。方法:将Cre-ERT2反转录病毒导入包装细胞PA317,获得的病毒上清感染SV40TAg基因诱导转化的永生化黑素细胞,三苯氧胺(tamoxifen)诱导Cre重组酶表达,分别在第6天和第10天用PCR、反转录(RT)-PCR和免疫组化方法检测SV40TAg基因在感染病毒上清的永生化黑素细胞内的表达,并采用左旋多巴(L-Dopa)染色、透射电镜、软琼脂克隆试验等检测细胞的生物学性状和功能。结果:Cre重组酶反转录病毒上清感染永生化黑素细胞经嘌呤霉素筛选和三苯氧胺诱导Cre重组酶表达,第6天时可检测到感染细胞中有SV40TAg基因的表达,第10天后则在细胞中检测不到SV40TAg基因表达;L-Dopa染色、透射电镜等鉴定结果表明,感染细胞具有与原代黑素细胞相同的生物学性状和功能。结论:联合应用Cre/loxP系统和SV40TAg基因可以成功地诱导具有良好生物学安全性的人源性可逆性永生化黑素细胞。 展开更多
关键词 cre/loxp系统 SV40T抗原 黑素细胞 永生化 可逆性
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应用Cre/loxp系统构建含有BAC序列的重组伪狂犬病毒 被引量：3
4
作者 王涛 童武 +8 位作者 叶超 于之清 梁超 李国新 高飞 单同领 于海 郑浩 童光志 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2017年第2期22-28,共7页
近年来我国出现伪狂犬病毒变异株,导致猪伪狂犬病重新爆发流行。为研究伪狂犬病毒变异株毒力增强与抗原变异的分子机制,需要建立该病毒的感染性克隆操作系统。本研究通过构建转移载体pTEGGF,利用同源重组将含有增强型绿色荧光蛋白(enhan... 近年来我国出现伪狂犬病毒变异株,导致猪伪狂犬病重新爆发流行。为研究伪狂犬病毒变异株毒力增强与抗原变异的分子机制,需要建立该病毒的感染性克隆操作系统。本研究通过构建转移载体pTEGGF,利用同源重组将含有增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)表达框及两翼各一个loxp位点,插入到伪狂犬病毒变异株PRV JS-2012 gG编码区下游,获得重组病毒rJS2012-gG/EGFP。将表达Cre重组酶的质粒pcDNA3.1-Cre转染BHK-21细胞,再感染rJS2012-gG/EGFP,筛选获得含有单一loxp位点的重组病毒rJS2012-gG/loxp。将rJS2012-gG/loxp基因组、含有EGFP标记基因的BAC载体p Belo BAC11-EGFP和pcDNA3.1-cre共转染BHK-21,获得含有BAC序列插入的重组病毒rJS2012-BAC。一步生长曲线与空斑试验显示,重组病毒rJS2012-BAC在体外生长略慢于亲本病毒。本研究成功构建了含有BAC载体的重组伪狂犬病毒,为进一步建立伪狂犬病毒变异株的感染性克隆操作系统,开展变异株的分子病原学研究打下良好基础。 展开更多
关键词 伪狂犬病毒变异株 细菌人工染色体 cre/loxp系统
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利用信息肽诱导和Cre/LoxP系统构建猪链球菌基因缺失株 被引量：4
5
作者 刘冉 陈福广 +7 位作者 陈平 黄萌萌 朱金鲁 谢芳 孟庆文 刘思国 刘建华 张跃灵 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期125-130,共6页
为建立一种高效的猪链球菌(Streptococcus suis)基因缺失方法,本研究利用信息肽诱导DNA片段转化和Cre/LoxP系统去除抗性基因这两种技术,通过在S.suis 05ZYH33的ssu05_1921基因上、下游片段和壮观霉素抗性基因(spc)片段之间引入LoxP位点... 为建立一种高效的猪链球菌(Streptococcus suis)基因缺失方法,本研究利用信息肽诱导DNA片段转化和Cre/LoxP系统去除抗性基因这两种技术,通过在S.suis 05ZYH33的ssu05_1921基因上、下游片段和壮观霉素抗性基因(spc)片段之间引入LoxP位点,采用信息肽GE9诱导构建的DNA片段转化S.suis并发生重组,经抗性筛选快速获得spc替代ssu05_1921基因的缺失株;进一步引入pSET6s/P_(tufA-cre)质粒表达Cre重组酶作用于LoxP位点,去除spc基因,产生无痕ssu05_1921基因缺失株,经测序和RT-PCR验证缺失正确。本研究建立的该方法简单、快捷、阳性率高,为构建S.suis基因缺失株、研究S.suis致病机制提供了新的选择。 展开更多
关键词 猪链球菌 信息肽诱导 cre/loxp系统 基因缺失
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利用Cre/loxP系统删除转Bt基因水稻中的选择标记基因 被引量：3
6
作者 尚玉花 李莉 +4 位作者 陆徐忠 张毅 倪大虎 宋丰顺 杨剑波 《生物学杂志》 CAS CSCD 2011年第2期5-8,共4页
来源于噬菌体P1的Cre/loxP位点特异性重组系统是目前在植物遗传转化中应用较多,较成熟的一个标记基因删除系统。在这个系统中,Cre酶可以特异性的识别和切割位于两个lox位点之间的标记基因,整个系统重组仅需Cre和lox识别位点即可完成而... 来源于噬菌体P1的Cre/loxP位点特异性重组系统是目前在植物遗传转化中应用较多,较成熟的一个标记基因删除系统。在这个系统中,Cre酶可以特异性的识别和切割位于两个lox位点之间的标记基因,整个系统重组仅需Cre和lox识别位点即可完成而无需其它辅因子的参加。利用农杆菌介导法成功地将cre基因导入供试材料"皖粳97",得到转hpt-cre基因水稻植株;将其与先期转基因育成的携带loxp-hpt-loxp-bt基因的"皖粳97"株系进行田间杂交,通过PCR分析,Cre/loxP重组系统定向删除了潮霉素抗性筛选标记基因。 展开更多
关键词 水稻 转基因 BT cre/loxp系统
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应用Cre/loxP系统在转化细胞水平上高效删除转基因水稻的标记基因 被引量：5
7
作者 赵艳 张晓丽 +1 位作者 郭龙彪 钱前 《中国水稻科学》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期580-586,共7页
研究了Cre/loxP系统在转化细胞水平上删除转基因水稻中抗性标记基因的可行性和效率。采用农杆菌介导法将Cre/loxP标记基因剪切系统载体pNCG导入水稻细胞,用G418筛选法获得水稻抗性愈伤组织后,在组织培养不同阶段的培养基中添加25μmol/... 研究了Cre/loxP系统在转化细胞水平上删除转基因水稻中抗性标记基因的可行性和效率。采用农杆菌介导法将Cre/loxP标记基因剪切系统载体pNCG导入水稻细胞,用G418筛选法获得水稻抗性愈伤组织后,在组织培养不同阶段的培养基中添加25μmol/L雌激素进行Cre基因的诱导表达和标记基因的剪切,PCR检测T0植株中标记基因nptⅡ、重组酶基因Cre和目标基因gusA的整合情况。将扩增结果为gusA(+)/nptⅡ(-)/Cre(-)的转基因植株统计为标记基因剪切成功的植株。结果表明,在抗性愈伤组织培养的预分化前、预分化和分化阶段添加雌激素诱导表达重组酶Cre均能成功切除标记基因序列,标记基因剪切成功率为6.82%～46.43%。在预分化前采用液体培养基添加雌激素诱导处理愈伤组织3d,T0植株中标记基因的剪切效率高达173.33%,主要原因是雌激素处理提高了愈伤组织绿苗分化率。直接在分化培养基中添加雌激素诱导处理,T0植株中标记基因剪切成功率达46.43%,剪切效率(144.44%)也较高。表明雌激素诱导的Cre/loxP系统能在水稻抗性愈伤组织水平上实现对标记基因序列高效快速删除。 展开更多
关键词 水稻 雌激素诱导 cre/loxp重组酶系统 转化细胞 标记基因删除
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Cre/LoxP系统在转基因小鼠上的应用策略 被引量：8
8
作者 朱焕章 史景泉 public.cta.cq.cn 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2000年第3期235-238,共4页
Cre/LoxP位点特异重组酶系统已发展为在体内外进行遗传操作的一个新的有力工具 .该系统在转基因小鼠上的应用 ,可使转基因的表达或靶基因的缺失 /突变的位点特异DNA重组不仅发生在小鼠发育的某一阶段或特定的组织器官 ,而且 ,若与控制Cr... Cre/LoxP位点特异重组酶系统已发展为在体内外进行遗传操作的一个新的有力工具 .该系统在转基因小鼠上的应用 ,可使转基因的表达或靶基因的缺失 /突变的位点特异DNA重组不仅发生在小鼠发育的某一阶段或特定的组织器官 ,而且 ,若与控制Cre表达或功能的诱导系统结合 ,则可以时空方式体现 . 展开更多
关键词 基因打靶 cre/loxp重组系统 转基因小鼠 调控
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一种利用Cre/loxP系统进行标记基因删除与靶基因置换的细胞模型研究(英文) 被引量：2
9
作者 崔文涛 任立明 +3 位作者 侯健 张颖 陈永福 安晓荣 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2008年第6期650-660,共11页
Cre/lox系统可以介导DNA的定点插入和定点删除,可利用其实现转基因动物中'友好位点'的重复利用及标记基因的有效删除.为直观地评估该系统介导的以上两种重组反应的效果,通过标记基因并利用大鼠乳腺癌细胞系SHZ-88进行了模型研究... Cre/lox系统可以介导DNA的定点插入和定点删除,可利用其实现转基因动物中'友好位点'的重复利用及标记基因的有效删除.为直观地评估该系统介导的以上两种重组反应的效果,通过标记基因并利用大鼠乳腺癌细胞系SHZ-88进行了模型研究.首先构建了两个载体:a.整合载体pTE-lox2272-DsRed-loxP-GFP-loxP,含有红色荧光标记基因DsRed和绿色荧光标记基因GFP;b.置换载体pT-lox2272-neo-loxP,含有筛选标记基因neo,用以置换DsRed基因.然后,用整合载体转染SHZ-88细胞,并随机挑取了3个同时表达DsRed和GFP的稳定整合细胞克隆.随后用置换载体和Cre表达载体PBS185对以上每个克隆分别进行了3次共转染,通过G418筛选并扩增培养后,总共获得1070个克隆.通过分析标记基因DsRed和GFP在这些克隆中的表达情况:Cre介导的删除效率为91.1%,定点置换效率为29.3%.最后对部分克隆进行了PCR和DNA印迹鉴定,分子鉴定结果与发光的表型状况一致.这一方法为Cre/lox系统在转基因家畜生产中的进一步应用提供了实验依据. 展开更多
关键词 lox2272 loxp cre 标记基因删除 靶基因置换
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Cre/LoxP系统联合SV40 LTag诱导可复性永生化大鼠皮肤成纤维细胞系的建立 被引量：2
10
作者 李晓航 张佳林 +5 位作者 康铁利 李乐 程颖 石蕊 赵宁 刘永锋 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期979-982,共4页
目的探索可复性永生化大鼠皮肤成纤维细胞的建立方法。方法采用胰酶消化法分离培养大鼠皮肤成纤维细胞;逆转录病毒载体(SSR69)转染成纤维细胞,筛选稳定表达SV40 LTag的永生化成纤维细胞;用表达Cre重组酶的腺病毒感染永生化成纤维细胞,... 目的探索可复性永生化大鼠皮肤成纤维细胞的建立方法。方法采用胰酶消化法分离培养大鼠皮肤成纤维细胞;逆转录病毒载体(SSR69)转染成纤维细胞,筛选稳定表达SV40 LTag的永生化成纤维细胞;用表达Cre重组酶的腺病毒感染永生化成纤维细胞,筛选获得回复后成纤维细胞。对原代、永生化及回复后成纤维细胞,倒置显微镜下观察细胞生长状态;采用细胞生长曲线法测定细胞增殖能力。免疫荧光染色检测Vimentin在原代及永生化成纤维细胞中的表达情况,平板克隆实验评价回复后成纤维细胞的致瘤性。结果提取了大鼠皮肤成纤维细胞,并筛选出表达SV40 LTag的永生化成纤维细胞,二者形态无明显差异,均贴壁生长,呈长梭形或多角形,但永生化成纤维细胞体外增殖能力明显高于原代成纤维细胞(P<0.05),在体外培养传代>25代。细胞免疫荧光提示两种细胞均在细胞质内表达Vimentin。回复后成纤维细胞不表达SV40 LTag,其体外增殖能力与原代细胞无明显差异(P>0.05),无致瘤性。结论应用Cre/LoxP系统联合SV40 LTag可以建立可复性永生化大鼠皮肤成纤维细胞系。 展开更多
关键词 永生化 猿猴病毒大T抗原基因 cre/loxp位点特异性重组酶系统
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利用Cre/loxP系统构建乳腺细胞特异性敲除SENP7基因的小鼠模型 被引量：1
11
作者 孙红 侯佳林 +2 位作者 蔡加琴 庄捷 魏晓霞 《中国临床药理学与治疗学》 CAS CSCD 2021年第4期376-381,共6页
目的:应用Cre-loxP系统构建乳腺细胞SENP7基因条件性敲除的小鼠模型并进行鉴定。方法:将SENP7 ^(flox/+)杂合子小鼠进行杂交,PCR法鉴定为SENP7 ^(flox/flox)纯合子小鼠,再与MMTV-Cre杂合子小鼠进行数代杂交,基因型鉴定并筛选获得MMTV-Cr... 目的:应用Cre-loxP系统构建乳腺细胞SENP7基因条件性敲除的小鼠模型并进行鉴定。方法:将SENP7 ^(flox/+)杂合子小鼠进行杂交,PCR法鉴定为SENP7 ^(flox/flox)纯合子小鼠,再与MMTV-Cre杂合子小鼠进行数代杂交,基因型鉴定并筛选获得MMTV-Cre×SENP7 ^(flox/flox)小鼠,即实验所需的SENP7基因特异性敲除小鼠。采用Real-Time PCR、Western blot和HE染色鉴定SENP7敲除效果,观察乳腺组织形态。结果:PCR基因扩增筛选出基因型为MMTV-Cre×SENP7 ^(flox/flox)小鼠。与MMTV-Cre×SENP7+/+小鼠相比,MMTV-Cre×SENP7 ^(flox/flox)小鼠乳腺SENP7基因的mRNA、蛋白表达水平显著降低,乳腺腺体数量明显减少。结论:本研究利用Cre-loxP技术成功构建了乳腺特异性敲除SENP7基因的纯合子小鼠,为进一步研究SENP7基因在乳腺肿瘤发生发展中的作用提供了优良的工具。 展开更多
关键词 SENP7 cre-loxp系统 MMTV-cre 乳腺
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Cre/LoxP系统介导的位点特异性重组技术 被引量：1
12
作者 陈双喜 许守明 《安徽农学通报》 2009年第15期27-28,107,共3页
Cre/LoxP系统是一种对转入基因进行定点操作的基因重组系统,在遗传操作中具有重要作用。该系统可以将外源基因定点整合到染色体上或将特定DNA片断删除。
关键词 cre/loxp 定点整合 特异性重组
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基于Cre/loxP系统的无筛选标记转耐低磷转录因子GmPTF1大豆种质创制与分析 被引量：3
13
作者 张小芳 董秋平 +4 位作者 乔潇 乔亚科 王冰冰 张锴 李桂兰 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期683-692,共10页
筛选标记基因在转基因植物应用中存在一定潜在安全风险,在转基因植物改良中如何合理消除该基因非常必要。转录因子PTF1具有改善植物在低磷胁迫下吸收磷效率的作用。本研究用根癌农杆菌介导法将Cre/loxPGmPTF1导入大豆品种豫豆22,利用β... 筛选标记基因在转基因植物应用中存在一定潜在安全风险,在转基因植物改良中如何合理消除该基因非常必要。转录因子PTF1具有改善植物在低磷胁迫下吸收磷效率的作用。本研究用根癌农杆菌介导法将Cre/loxPGmPTF1导入大豆品种豫豆22,利用β-雌二醇诱导Cre/loxP系统删除筛选标记基因,获得了无筛选标记的转GmPTF1基因大豆。用PCR法扩增删除标记基因后的重组序列并测序显示,筛选标记基因在大豆基因组中已经被完全删除,重组序列中目的基因序列正确并保持了正确开放读码框;loxP位点重组出现一种新的拼接类型,重组后2个loxP序列全部缺失,新重组拼接位点长38 bp,与NCBI数据库的其他序列均无同源性,并且重组涉及2个loxP位点的外侧翼序列,造成Cre/loxP盒上游loxP和下游loxP外侧翼序列部分缺失。经过RT-PCR和Western杂交验证显示无筛选标记转基因大豆植株中GmPTF1能够正常转录和翻译,在根系、叶片及茎中的GmPTF1蛋白表达量均高于野生型对照,而在种子中与对照无显著差异。沙培试验表明,在低磷条件下无筛选标记转基因大豆苗期根系指标、生物干重、叶绿素含量和磷含量均显著高于野生型对照,而丙二醛含量低于对照。利用Cre/loxP重组系统可以有效删除转基因大豆中的筛选标记基因。 展开更多
关键词 cre/loxp GmPTF1 无筛选标记 转基因大豆
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利用CRISPR-Cas9和Cre/loxP系统删除34个非必需基因构建L-苏氨酸生产菌
14
作者 丁志祥 胡晓清 +1 位作者 柳亚迪 王小元 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第11期71-80,共10页
L-苏氨酸是一种被广泛应用于食品、饲料及医药等领域的必需氨基酸。大肠杆菌以葡萄糖为碳源合成L-苏氨酸的过程中,一些非必需基因的转录和翻译会消耗碳源。利用CRISPR-Cas9和位点特异性重组系统Cre/loxP,敲除了大肠杆菌MG1655基因组中p... L-苏氨酸是一种被广泛应用于食品、饲料及医药等领域的必需氨基酸。大肠杆菌以葡萄糖为碳源合成L-苏氨酸的过程中,一些非必需基因的转录和翻译会消耗碳源。利用CRISPR-Cas9和位点特异性重组系统Cre/loxP,敲除了大肠杆菌MG1655基因组中puuE和ynaI区间的34个非必需基因(共30.372 kb),获得了突变菌MG003,然后通过高表达L-苏氨酸合成途径中关键基因thrA*、thrB和thrC以及L-苏氨酸转运酶编码基因rhtA和rhtC提高L-苏氨酸产量。与对照菌MG1655/pFW01-thrA*BC相比,MG003/pFW01-thrA*BC生长加快,L-苏氨酸产量提高25.5%;MG003/pFW01-thrA*BC-rhtA的L-苏氨酸产量提高了43.3%;MG003/pFW01-thrA*BC-rhtC的L-苏氨酸产量提高了74.5%。研究结果表明,大肠杆菌基因组中34个非必需基因的删除有利于其提高L-苏氨酸合成能力。 展开更多
关键词 大肠杆菌 L-苏氨酸 CRISPR-Cas9 cre/loxp puuE ynaI
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Cre/Loxp系统介导转基因山羊乳腺上皮细胞标记基因的删除
15
作者 宋绍征 于康英 +5 位作者 陆睿 张婷 陈朝军 潘生强 成勇 周鸣鸣 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第12期105-111,共7页
为了消除核移植转基因动物中标记基因潜在的生物安全风险,应用Cre/Loxp系统删除人乳铁蛋白(hLF)转基因山羊乳腺上皮细胞的标记基因,并以此探索标记基因删除前后对功能基因乳腺特异性表达的影响。首先复苏hLF转基因山羊乳腺上皮细胞并纯... 为了消除核移植转基因动物中标记基因潜在的生物安全风险,应用Cre/Loxp系统删除人乳铁蛋白(hLF)转基因山羊乳腺上皮细胞的标记基因,并以此探索标记基因删除前后对功能基因乳腺特异性表达的影响。首先复苏hLF转基因山羊乳腺上皮细胞并纯化;然后电转染PBS185纯化质粒,培养10-14 d,胰蛋白酶消化细胞,通过自制口控式移卵针挑取单克隆细胞;最后PCR检测标记基因是否删除,催乳素诱导表达,ELISA和Western Blot检测功能蛋白hLF的表达情况。结果表明,共获得65株单克隆乳腺上皮细胞,挑取状态较好的18株用于PCR检测,有3株为删除标记基因的细胞株,删除效率达16.7%(3/18),且删除标记基因细胞株表达水平提高约8倍(2.85 g·L^-1/0.35 g·L^-1),蛋白条带大小与目标蛋白一致(80 kD)。结果表明Cre/Loxp系统能够有效的删除乳腺上皮细胞基因组上的标记基因,且删除后细胞株表达水平明显提高,成功建立一套转基因山羊乳腺上皮细胞标记基因删除的系统,为进一步扩大生产无标记基因的转基因山羊奠定基础。 展开更多
关键词 标记基因 cre/loxp HLF 乳腺上皮细胞 诱导
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Cre/loxP系统应用于毕赤酵母基因敲除的研究进展 被引量：1
16
作者 王未鲜 韩铭海 《安徽农业科学》 CAS 2023年第15期10-13,17,共5页
毕赤酵母是重组蛋白最常用的表达系统之一,蛋白高水平表达策略一直是领域内最重要的研究课题之一。在后基因组时代,高效而便捷的基因改造是一种有效提高毕赤酵母蛋白表达能力的手段,其中由Cre/loxP系统介导的基因改造技术受到了科研人... 毕赤酵母是重组蛋白最常用的表达系统之一,蛋白高水平表达策略一直是领域内最重要的研究课题之一。在后基因组时代,高效而便捷的基因改造是一种有效提高毕赤酵母蛋白表达能力的手段,其中由Cre/loxP系统介导的基因改造技术受到了科研人员的广泛关注。综述了Cre/loxP系统的基本原理、应用于毕赤酵母基因敲除的技术路线及其关键的技术问题。 展开更多
关键词 毕赤酵母 cre/loxp 基因敲除
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基于Cre/loxP系统构建酿酒酵母YVC1基因缺失菌株
17
作者 王晶晶 董晓宇 《生物学杂志》 2025年第5期60-66,共7页
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)液泡膜上的钙离子通道Yvc1是调控细胞内Ca2+浓度的重要途径之一,Ca2+作为第二信使,可以提高酿酒酵母生产乙醇能力。因此,构建YVC1基因缺失菌株,为后期钙通道功能研究奠定基础。通过PCR技术,验证酿酒... 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)液泡膜上的钙离子通道Yvc1是调控细胞内Ca2+浓度的重要途径之一,Ca2+作为第二信使,可以提高酿酒酵母生产乙醇能力。因此,构建YVC1基因缺失菌株,为后期钙通道功能研究奠定基础。通过PCR技术,验证酿酒酵母DL5168中YVC1基因的存在。通过齐-尼二氏染色法和基因组特异性PCR,鉴定DL5168菌株染色体倍性。基于Cre/loxP系统原理,构建YVC1基因敲除组件,并通过醋酸锂转化法将其转至DL5168菌株中,通过含有100μg/mL G418的YPD培养基筛选出阳性重组子。将pSH65质粒转入阳性重组子,用于切除抗性基因KanMX。结果表明,酿酒酵母DL5168基因组中具有液泡电导1基因YVC1。DL5168菌株为aα型二倍体。敲除组件pUG6-YVC1-loxP-KanMX成功与DL5168菌株发生同源重组,筛选到阳性重组子。pSH65质粒在半乳糖的诱导下产生Cre重组酶,成功切除重组子中的抗性基因KanMX,获得YVC1一条等位基因缺失菌株DL5168-yvc1Δ。相同方法敲除另一条同源染色体上的等位基因。最终研究成功获得YVC1基因双倍体缺失菌株DL5168-yvc1Δ/Δ。 展开更多
关键词 酿酒酵母 YVC1基因 cre/loxp系统 基因敲除 等位基因
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应用Cre-LoxP系统构建牛结节性皮肤病病毒缺失TK基因毒株 被引量：1
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作者 张玉哲 任善会 +10 位作者 姚威 龚真莉 张红强 柳民意 尤婷 王相伟 李积雲 殷相平 孙跃峰 陈豪泰 万学瑞 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期4517-4529,共13页
利用同源重组技术及Cre-LoxP系统平台,构建牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus,LSDV)缺失TK基因毒株,为研制出安全、高效的LSDV基因工程疫苗提供备选毒株。以TK基因为靶基因,利用Cre-LoxP系统平台,红色荧光蛋白(RFP)为筛选标... 利用同源重组技术及Cre-LoxP系统平台,构建牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus,LSDV)缺失TK基因毒株,为研制出安全、高效的LSDV基因工程疫苗提供备选毒株。以TK基因为靶基因,利用Cre-LoxP系统平台,红色荧光蛋白(RFP)为筛选标记,采用重叠PCR方法扩增左、右同源臂以及RFP基因表达框并进行融合,将其克隆至pUC19T载体,构建基因缺失转移载体pUC19T-LSDV-ΔTK-RFP。将转移载体重组质粒转染至Vero细胞,并感染LSDV/CHA/FJ/2021毒株,构建LSDV-ΔTK-RFP重组病毒。采取蚀斑法、有限稀释法纯化LSDV-ΔTK-RFP。然后,利用Cre-LoxP系统,在MDBK-Cre细胞中从病毒基因组中切除RFP标签,采取蚀斑法和有限稀释法筛选并纯化LSDV-ΔTK毒株。利用PCR及测序方法对重组毒株进行鉴定,并测定其一步生长曲线。结果表明成功构建缺失TK基因的重组毒株(LSDV-ΔTK),重组毒株复制力略低于野生毒株。应用Cre-LoxP系统构建的缺失TK基因LSDV毒株,具有良好的遗传稳定性和复制生长特性,为后续LSDV基因工程疫苗的研制提供了候选毒株,同时拓展了Cre-LoxP系统的应用范围。 展开更多
关键词 牛结节性皮肤病病毒 TK基因 cre/loxp系统 重组毒株
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Cre/Loxp和四环素系统在基因可控表达中的应用 被引量：3
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作者 张一 黎晓敏 +2 位作者 吕凤林 梁存军 宋容 《中国实验动物学报》 CAS CSCD 2007年第1期76-80,共5页
本文介绍了目前最常见的四环素调控系统和Cre/LoxP系统的基本原理、应用情况、近年来的研究进展总结,比较了两种系统的优缺点,介绍了两种系统联合应用的成果,并且提出了Cre/Loxp系统在HPV11全基因组定向表达中的应用,并由此提出利用Cre/... 本文介绍了目前最常见的四环素调控系统和Cre/LoxP系统的基本原理、应用情况、近年来的研究进展总结,比较了两种系统的优缺点,介绍了两种系统联合应用的成果,并且提出了Cre/Loxp系统在HPV11全基因组定向表达中的应用,并由此提出利用Cre/Loxp系统解决多个基因定向表达问题的设想。 展开更多
关键词 可控表达 基因表达调控 四环素系统 cre/loxp系统
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Cre/loxP位点特异性重组系统及其在口腔医学领域中的应用 被引量：4
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作者 张文娟 于丹妮 《国际口腔医学杂志》 CAS 2011年第1期55-58,共4页
Cre/loxP位点特异性重组系统由Cre重组酶和loxP位点组成。Cre重组酶可识别loxP位点并催化2个loxP位点之间的DNA进行精确的位点特异性重组。该系统作用方式简单、重组效率高,可定时、定位地对基因进行修饰,已成为一种定向改变生物活体遗... Cre/loxP位点特异性重组系统由Cre重组酶和loxP位点组成。Cre重组酶可识别loxP位点并催化2个loxP位点之间的DNA进行精确的位点特异性重组。该系统作用方式简单、重组效率高,可定时、定位地对基因进行修饰,已成为一种定向改变生物活体遗传信息的重要的试验工具。本文主要就Cre/loxP系统的结构、重组机制、特点及其在口腔医学领域中的应用作一综述。 展开更多
关键词 位点特异性重组 cre/loxp系统 cre重组酶
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