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茂源链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶在大肠杆菌中的高效表达
1
作者 袁方 李国莹 +1 位作者 顾秋亚 余晓斌 《食品与发酵工业》 北大核心 2025年第5期61-69,共9页
谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase,TGase)可以促进蛋白质分子内或分子间的交联,在食品、制药、纺织等行业中均有着广泛的应用。为了高效生产具有优良特性的TGase,该研究以茂源链霉菌(Streptomyces mobaraensis)来源的TGase为研究对象,... 谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase,TGase)可以促进蛋白质分子内或分子间的交联,在食品、制药、纺织等行业中均有着广泛的应用。为了高效生产具有优良特性的TGase,该研究以茂源链霉菌(Streptomyces mobaraensis)来源的TGase为研究对象,比较了两个不同来源的TGase的性质,将具有较优酶学性质的TGase基因tgLD分别采用6种不同质粒在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行异源表达。其中,重组菌E.coli BL21(DE3)(pET32a-tgLD)实现了成熟TGase的异源表达,添加0.2 mmol/L IPTG、25℃诱导8 h,重组TGLD的酶活力为0.45 U/mL。为进一步提高TGLD的表达量,构建了可以特异性激活pro-TGase的2种表达载体。其中,重组菌E.coli BL21(DE3)(pCOLDⅡ-pro-EK-tgLD),添加0.2 mmol/L IPTG、15℃诱导24 h,体外活化后获得具有活性的TGLD酶,其酶活力达25.23 U/mL。该研究实现了具有优良性质的活性TGLD在E.coli中的高效表达。 展开更多
关键词 谷氨酰胺转氨酶 茂源链霉菌 大肠杆菌 高效表达
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Ophiostoma piceae胆固醇酯酶在毕赤酵母中的高效表达
2
作者 郭子妍 毛文刚 +3 位作者 林红 高文欣 王月峰 舒正玉 《食品与发酵工业》 北大核心 2025年第16期36-42,共7页
微生物源甾醇酯酶资源的匮乏,制约了甾醇绿色加工技术的普及推广。Ophiostoma piceae胆固醇酯酶(Ophistoma picae steryl esterase,OPE)是到目前为止,第一个报道的真正微生物源胆固醇酯酶。实现OPE的工业化生产,将有效解决该技术瓶颈。... 微生物源甾醇酯酶资源的匮乏,制约了甾醇绿色加工技术的普及推广。Ophiostoma piceae胆固醇酯酶(Ophistoma picae steryl esterase,OPE)是到目前为止,第一个报道的真正微生物源胆固醇酯酶。实现OPE的工业化生产,将有效解决该技术瓶颈。为提高其在毕赤酵母中的表达水平,该研究分别考察了基因拷贝数、分泌信号类型和共表达二硫键异构酶对ope基因在P.pastoris中高效表达的影响。结果表明,上述3种因素均可在一定程度上提高重组OPE产量,其中共表达二硫键异构酶的作用最为显著。筛选到的最高表达量的重组P.pastoris菌株,其胞外OPE产量为(27.4±0.8)U/mL,较优化前提高了161.18倍。高效表达ope基因的重组P.pastoris菌株的构建与筛选,将为后续重组OPE的应用奠定基础。 展开更多
关键词 Ophiostoma piceae胆固醇酯酶 毕赤酵母 基因多拷贝重组 信号肽 蛋白质二硫键异构酶 异源高效表达
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牛凝乳酶在黑曲霉中的高效表达
3
作者 刘佳悦 刘天奇 +3 位作者 张会 樊俊博 马境辰 李杰 《东北农业大学学报》 北大核心 2025年第5期45-53,73,共10页
为探究融合蛋白和密码子优化策略对凝乳酶表达的影响,试验采用对重组菌株进行蛋白、酶活力检测方法,总结出提高蛋白质产量的有效策略。结果表明:以黑曲霉高分泌蛋白GlaA、XynB、AmyA、EglA、FaeA、Amy15作为载体蛋白,重组牛凝乳酶活力... 为探究融合蛋白和密码子优化策略对凝乳酶表达的影响,试验采用对重组菌株进行蛋白、酶活力检测方法,总结出提高蛋白质产量的有效策略。结果表明:以黑曲霉高分泌蛋白GlaA、XynB、AmyA、EglA、FaeA、Amy15作为载体蛋白,重组牛凝乳酶活力分别达到5140.75、3725.94、2088.97、1202.41、444.19、307.69 SU·mL^(-1)。使用密码子优化策略,融合Amy15、XynB、GlaA载体蛋白的重组牛凝乳酶活力分别为514.51、4151.44、5072.21 SU·mL^(-1)。分析重组牛凝乳酶酶学性质,最适反应温度为70℃、最适pH为6.0,添加Fe3+可显著提高酶活力。试验构建出高效表达凝乳酶的黑曲霉重组菌株,为异源低表达蛋白在黑曲霉中的高效表达提供新思路。 展开更多
关键词 黑曲霉 牛凝乳酶 优化表达策略 高效分泌表达
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大肠杆菌多酚氧化酶的分子克隆及异源高效表达 被引量：1
4
作者 邓卉 余丹 +6 位作者 邹成义 范景胜 李斌 屈东 倪青松 郑钰嘉 陈瑾 《中国饲料》 北大核心 2024年第5期26-31,共6页
菜籽粕、棉籽粕等非粮饲料资源存在的酚类化合物芥子碱、棉酚等抗营养因子,严重影响了其饲喂价值。本课题组筛选出的一株大肠杆菌属芥子碱降解菌SDB2已被证实能通过分泌多酚氧化酶来降解芥子碱和棉酚,本试验旨在运用基因工程技术克隆SDB... 菜籽粕、棉籽粕等非粮饲料资源存在的酚类化合物芥子碱、棉酚等抗营养因子,严重影响了其饲喂价值。本课题组筛选出的一株大肠杆菌属芥子碱降解菌SDB2已被证实能通过分泌多酚氧化酶来降解芥子碱和棉酚,本试验旨在运用基因工程技术克隆SDB2多酚氧化酶基因,实现其高效表达,为SDB2多酚氧化酶在饲料工业上的规模化应用奠定基础。从大肠杆菌SDB2中克隆出多酚氧化酶基因,将其与质粒pET28a连接后转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中培养,通过PCR鉴定及质粒酶切验证方法构建重组菌株,同时对重组克隆基因进行生物信息学分析。采用“2×2”交叉试验设计,以温度和诱导剂IPTG浓度两个影响因素诱导SDB2多酚氧化酶基因在重组菌株中高效表达,经SDS-PAGE和WB双重验证后,确立最佳诱导条件,最终纯化出目标酶蛋白。结果表明:(1)成功克隆SDB2多酚氧化酶基因,构建出异源表达重组菌株。(2)克隆出的SDB2重组多酚氧化酶基因含目标核苷酸741个,总编码氨基酸263个(含标签氨基酸20个),氨基酸组成的蛋白相对分子质量为28499.0,理论等电点为6.94,据此预测出SDB2重组多酚氧化酶三维结构模型。(3)确立SDB2多酚氧化酶异源高效表达的最佳诱导条件为温度37℃,IPTG浓度1 mmol,该条件下表达出大量可溶性酶蛋白,有利于工业化生产。本试验条件下,大肠杆菌SDB2多酚氧化酶成功实现了分子克隆及异源高效表达,为我国非粮饲料资源实现高效利用提供了技术参考。 展开更多
关键词 大肠杆菌 多酚氧化酶 克隆 高效表达
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胱硫醚-β-合成酶的高效表达及酶学性质研究
5
作者 陈武 刘春华 +3 位作者 何鹏辉 蔡冬波 陈守文 王冬 《湖北农业科学》 2024年第11期203-207,共5页
以酿酒酵母的cbs基因序列为模板,依据大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)的密码子偏好性进行密码子优化,以pET28a(+)为骨架构建表达质粒pET28a-cbs,并利用Escherichia coli BL21(DE3)进行胱硫醚-β-合成酶(CBS)的表达,同时优化诱导表... 以酿酒酵母的cbs基因序列为模板,依据大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)的密码子偏好性进行密码子优化,以pET28a(+)为骨架构建表达质粒pET28a-cbs,并利用Escherichia coli BL21(DE3)进行胱硫醚-β-合成酶(CBS)的表达,同时优化诱导表达条件并分析CBS的酶学性质。结果表明,在诱导温度为16℃、IPTG浓度为0.1 mmol/L、诱导时间为18 h时,CBS浓度最高,为266.67 mg/L。CBS发挥催化作用过程中也受到多种环境因素的影响,在40~55℃时,CBS相对酶活性迅速下降,CBS不适宜长期保存于温度大于40℃的环境中;CBS适宜长期保存于pH为6.5~8.5的缓冲溶液中,不宜保存在过酸或过碱的缓冲溶液中;CBS在温度40℃、pH 8.0条件下,酶活性较高。 展开更多
关键词 胱硫醚-β-合成酶(CBS) 高效表达 酶学性质 诱导表达
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β-葡萄糖苷酶催化活性改造及在毕赤酵母中的高效表达 被引量：1
6
作者 吴涛旭 阳鹏辉 +1 位作者 李阳阳 刘松 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2024年第14期126-133,共8页
β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)能催化底物非还原末端的β-D-葡萄糖苷键水解释放葡萄糖和相应配基,是纤维素糖化过程中的关键酶之一。篮状菌(Talaromyces leycettanus JCM12802)来源的β-葡萄糖苷酶bgl3A热稳定性较好,但催化活性还亟待提... β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)能催化底物非还原末端的β-D-葡萄糖苷键水解释放葡萄糖和相应配基,是纤维素糖化过程中的关键酶之一。篮状菌(Talaromyces leycettanus JCM12802)来源的β-葡萄糖苷酶bgl3A热稳定性较好,但催化活性还亟待提高。该研究中,通过Discovery Studio 2022柔性对接模块构建了bgl3A和底物pNPG的复合物结构;基于结合能预测模块对bgl3A催化活性位点6以内的氨基酸残基进行虚拟突变,计算突变前后酶对pNPG的结合能变化;对结合能变化小于-0.7 kcal/mol的20个突变体进行表达、纯化和酶学性质分析。与bgl3A相比,突变体bgl3A-N237Y的比酶活和k_(cat)/K_(m)分别提升了22%和25%。将bgl3A-N237Y在毕赤酵母中表达,通过信号肽替换和共表达分子伴侣使其摇瓶发酵酶活力达106.6 U/mL,较优化前提高75%。研究得到高活性bgl3A突变体及其生产菌将有助于提高其工业化应用效果。 展开更多
关键词 Β-葡萄糖苷酶 催化活性 底物结合能 毕赤酵母 高效表达
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耐热嗜酸β-甘露聚糖酶TaMan5A在毕赤酵母中高效表达及酶学性质研究 被引量：1
7
作者 王家强 郑锋振 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期52-58,共7页
甘露聚糖酶是一类将甘露聚糖降解为短链甘露寡糖及甘露糖的水解酶。为了开发耐酸耐高温的工程酶,从棘孢木霉(Trichodema asperellum)ND-1中克隆甘露聚糖酶基因TaMan5A并在毕赤酵母(Komagataella phaffii)X-33中成功表达。结果显示,该酶... 甘露聚糖酶是一类将甘露聚糖降解为短链甘露寡糖及甘露糖的水解酶。为了开发耐酸耐高温的工程酶,从棘孢木霉(Trichodema asperellum)ND-1中克隆甘露聚糖酶基因TaMan5A并在毕赤酵母(Komagataella phaffii)X-33中成功表达。结果显示,该酶的蛋白质分子质量约为67 kDa。最适pH值和温度分别为4.0和65℃,在pH 2.0~6.0具有较强的稳定性,孵育1 h后仍具有80%的活性,且在20~65℃时,残留酶活力均能达到90%以上。1 mmol/L Co^(2+)、脲和5 mmol/L SDS、Zn^(2+)、Fe^(2+)、Mn^(2+)、Ni^(2+)对TaMan5A的活力都有不同程度的激活作用。由于玉米秸秆富含纤维素与半纤维素,因此进一步确定了TaMan5A水解秸秆的最佳组合条件(玉米秸秆用量0.5 g,TaMan5A用量0.5 g,pH 4.0,水解2 d),并得到玉米秸秆用量和TaMan5A用量对玉米秸秆降解效率影响最大。该研究首次从棘孢木霉ND-1中克隆出TaMan5A基因,实验结果表明,TaMan5A是一种嗜酸、耐高温、热稳定性强的酶,具有较大的应用前景,值得进一步研究。 展开更多
关键词 棘孢木霉ND-1 毕赤酵母 高效表达 Β-甘露聚糖酶 酶学性质
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一个承载分子的设计与肽抗生素hPAB-β的高效表达 被引量：11
8
作者 饶贤才 金晓琳 +3 位作者 胡晓梅 朱军民 陈自瑾 胡福泉 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第4期389-392,共4页
目的　通过设计一个承载蛋白分子高效表达肽抗生素hPAB β ,为大量制备hPAB β奠定基础。 方法　根据肽抗生素的特性 ,确立 4条设计原则 ,并据此设计一 489bp的承载蛋白编码序列 ,用化学合成法获得该序列并将之克隆到pQE 3 2中构建成表... 目的　通过设计一个承载蛋白分子高效表达肽抗生素hPAB β ,为大量制备hPAB β奠定基础。 方法　根据肽抗生素的特性 ,确立 4条设计原则 ,并据此设计一 489bp的承载蛋白编码序列 ,用化学合成法获得该序列并将之克隆到pQE 3 2中构建成表达载体 ,进一步将肽抗生素hPAB β基因插入上述表达载体 ,肽抗生素基因位于承载蛋白编码序列 3’ 端 ,两者构成融合基因。将含融合基因的表达载体转化大肠杆菌JM10 9,筛选阳性重组子 ,并用阳性重组子表达融合蛋白。结果　设计的承载蛋白为 163个氨基酸 ,分子量 17668.80 ,等电点 5 .62 1。用承载分子与肽抗生素hPAB β构建的融合蛋白表达载体转化细菌后 ,筛选到 4个阳性重组子 ,均能高效表达肽抗生素融合蛋白 ,融合蛋白的产量占细菌总蛋白的 40 %～ 45 %。结论　设计的承载蛋白分子能够实现肽抗生素的高效表达。 展开更多
关键词 承载蛋白 肽抗生素 高效表达 hPAB-β
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玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因高效表达载体构建及其导入小麦的研究 被引量：18
9
作者 李艳 许为钢 +4 位作者 胡琳 张磊 齐学礼 张庆琛 王根松 《麦类作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期741-746,共6页
为获得具有C4光合特征的高光效转基因小麦材料,利用从玉米中克隆的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因(pepc,GenBank接受号为FJ415327)构建高效双元表达载体,通过基因枪介导法将其导入小麦品种(系)中,利用Real-time PCR方法分析外源基因... 为获得具有C4光合特征的高光效转基因小麦材料,利用从玉米中克隆的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因(pepc,GenBank接受号为FJ415327)构建高效双元表达载体,通过基因枪介导法将其导入小麦品种(系)中,利用Real-time PCR方法分析外源基因在转基因植株中的拷贝数。PCR和双酶切鉴定表明,玉米PEPCcDNA序列已插入双元表达载体pCAMBIA3301中,命名为p3301-pepc;对获得的抗性再生植株进行PCR扩增,其中有342株扩增出目的条带;在选取的15株转基因植株中7株拷贝数为1,3株拷贝数为2,2株拷贝数为3,拷贝数为5、8和17的分别为1株。初步证明玉米pepc基因已整合到小麦基因组中,且外源基因在转基因植株中既有单拷贝插入,也有多拷贝插入,这为进一步研究该基因在小麦基因组中的功能表达提供了试验材料。 展开更多
关键词 小麦 玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC) 高效表达载体 转基因 拷贝数
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抗菌肽LL-37在毕赤酵母SMD1168中的高效表达及活性鉴定 被引量：15
10
作者 刘德辉 何俊 +1 位作者 林云熊 黄毓茂 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期98-101,120,共5页
为获得高效表达的抗菌肽LL-37,根据人源抗菌肽LL-37的氨基酸序列,选择毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子的偏嗜性,通过SOEing法改造合成LL-37基因片段,克隆到pGAPZαA质粒中,获得分泌型重组酵母表达载体pGAPZαA-LL-37。pGAPZαA-LL-37... 为获得高效表达的抗菌肽LL-37,根据人源抗菌肽LL-37的氨基酸序列,选择毕赤酵母(Pichia pastoris)密码子的偏嗜性,通过SOEing法改造合成LL-37基因片段,克隆到pGAPZαA质粒中,获得分泌型重组酵母表达载体pGAPZαA-LL-37。pGAPZαA-LL-37通过限制性内切酶AvrII酶切线性化后,经电穿孔法转入毕赤酵母细胞SMD1168。经Zeocin抗性筛选,得到高拷贝转化子,PCR检测表明LL-37基因与毕赤酵母染色体稳定结合。在GAP启动子调控下,LL-37蛋白获得分泌表达,其上清表达量约为237mg/L。表达产物耐热性强,在100℃条件下30min内仍保持一定的抗菌活性。表达产物对大肠杆菌DH5α、大肠杆菌D31和猪链球菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为1.56μg/mL、3.12μg/mL和6.25μg/mL。 展开更多
关键词 抗菌肽LL-37 基因设计 高效表达 活性鉴定
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中国人γ－干扰素cDNA在大肠杆菌中的高效表达 被引量：7
11
作者 瞿成奎 魏汉东 +2 位作者 鱼咏涛 贺福初 吴祖泽 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 1995年第5期433-436,共4页
应用ＲＴ－ＰＣＲ技术从中国人淋巴细胞ｍＲＮＡ反转录产物中克隆了ＩＦＮ－γｃＤＮＡ，序列分析证实了分子进化规律对ＩＦＮ－γｃＤＮＡ序列存在多态性的推论．在此基础上应用ＤＮＡ重组技术，将去信号肽中国人ＩＦＮ－γｃＤＮＡ克... 应用ＲＴ－ＰＣＲ技术从中国人淋巴细胞ｍＲＮＡ反转录产物中克隆了ＩＦＮ－γｃＤＮＡ，序列分析证实了分子进化规律对ＩＦＮ－γｃＤＮＡ序列存在多态性的推论．在此基础上应用ＤＮＡ重组技术，将去信号肽中国人ＩＦＮ－γｃＤＮＡ克隆到原核表达质粒ｐＢＶ２２０Ｐ＿ＲＰ＿Ｌ启动子下游，转化大肠杆菌ＤＨ５α，通过温度诱导表达，成功地在大肠杆菌中稳定、高效地表达了中国人ＩＦＮ－γｃＤＮＡ，其表达水平占全菌可溶性总蛋白的４４．４％，初步复性后生物学活性测定结果表明γ－ＩＦＮ表达量为０．４５×１０￣７～２．３４×１０￣７单位／Ｌ． 展开更多
关键词 中国人 Γ-干扰素 高效表达 CDNA 大肠杆菌
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甲酸脱氢酶基因在大肠杆菌Rosetta中的高效表达 被引量：13
12
作者 徐娴 贾红华 +1 位作者 何冰芳 韦萍 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期5-8,共4页
甲酸脱氢酶是氧化还原酶辅酶NAD(P)^+和NAD(P)H再生循环体系中的关键酶。实验中,用PCR方法扩增了假丝酵母Candida boidinii中甲酸脱氢酶基因(fdh),分别构建了诱导型表达载体pUC-dh和pET- fdh,以E.coli Rosetta为表达宿主,获得了能够高... 甲酸脱氢酶是氧化还原酶辅酶NAD(P)^+和NAD(P)H再生循环体系中的关键酶。实验中,用PCR方法扩增了假丝酵母Candida boidinii中甲酸脱氢酶基因(fdh),分别构建了诱导型表达载体pUC-dh和pET- fdh,以E.coli Rosetta为表达宿主,获得了能够高效表达甲酸脱氢酶的重组菌。经诱导后重组菌Rosetta/pET- fdh的FDH比酶活为0.399U/mg(蛋白),Rosetta/pUC-fdh的FDH比酶活为0.163U/mg(蛋白)。经SDS- PAGE分析,Rosetta/pET-fdh和Rosetta/pUC-fdh表达的FDH蛋白分别占菌体可溶性总蛋白的17%和10%,实现了fdh基因在Rosetta中的高效表达。研究中所构建的重组菌为氧化还原反应中的辅酶再生奠定了良好的基础。 展开更多
关键词 辅酶再生 甲酸脱氢酶 甲酸脱氢酶基因 高效表达
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小肽多拷贝基因表达载体的构建及其高效表达(英文) 被引量：8
13
作者 胡学军 张志超 +2 位作者 包永明 杨青 安利佳 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第3期287-292,共6页
介绍一种快速、高效构建小肽多拷贝基因表达载体的策略 ,并构建了相应的表达载体pETE coT .用人工合成的编码 2 8个氨基酸残基的胸腺素α1基因为模型 ,采用限制酶EcoT14I识别序列CCAAGG为小肽基因两末端序列 ,利用其酶切后可产生非镜相... 介绍一种快速、高效构建小肽多拷贝基因表达载体的策略 ,并构建了相应的表达载体pETE coT .用人工合成的编码 2 8个氨基酸残基的胸腺素α1基因为模型 ,采用限制酶EcoT14I识别序列CCAAGG为小肽基因两末端序列 ,利用其酶切后可产生非镜相对称粘性末端 ,一次连接反应就构建出一系列不同基因拷贝数的表达载体 ;在小肽基因两端分别引进编码FactorXa和羟胺蛋白切割位点的序列 ,表达出的融合蛋白可被FactorXa和羟胺剪切出不残留任何外源氨基酸的小肽 .不同拷贝数的小肽融合蛋白在大肠杆菌BL2 1(DE3)中均获得高效表达 . 展开更多
关键词 小肽多拷贝基因 表达载体 高效表达 定向插入 EcoT14Ⅰ
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来源于芽孢杆菌（Bacillus circulans）的乳糖酶在毕赤酵母中的高效表达 被引量：7
14
作者 梁果义 伍宁丰 +3 位作者 张伟 杨娇艳 姚斌 范云六 《高技术通讯》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期55-60,共6页
根据毕赤酵母（Pichia pastoris）密码子选择偏好对来源于芽孢杆菌（Bacillus circulans）的乳糖酶基因lacO进行了分子改造。改造后的基因lacM按正确的阅读框架插入到毕赤酵母表达载体pPIC9上，构建得到重组毕赤酵母表达质粒。PCR检测、... 根据毕赤酵母（Pichia pastoris）密码子选择偏好对来源于芽孢杆菌（Bacillus circulans）的乳糖酶基因lacO进行了分子改造。改造后的基因lacM按正确的阅读框架插入到毕赤酵母表达载体pPIC9上，构建得到重组毕赤酵母表达质粒。PCR检测、SDS—PAGE电泳分析和酶活力测定的结果表明，lacM基因已重组到酵母染色体上，并能正常分泌表达。与来改造的基因lacO的毕赤酵母重组子相比，酶蛋白表达量明显增加，约为改造前的3倍以上。 展开更多
关键词 乳糖酶 基因改造 高效表达 毕赤酵母 芽孢杆菌
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鸡IL-18cDNA的克隆及在大肠杆菌中的高效表达 被引量：9
15
作者 胡敬东 崔治中 赵宏坤 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期264-268,共5页
运用RT PCR方法,从经脂多糖(LPS)诱导的鸡马立克氏病成淋巴细胞样细胞系 MDCC MSB1 总 RNA中扩增得到了鸡白细胞介素18(Chicken interleukin 18,ChIL 18)成熟蛋白基因的 cDNA,并将其克隆到 pMD18 T载体上。DNA序列测定表明,克隆得到的Ch... 运用RT PCR方法,从经脂多糖(LPS)诱导的鸡马立克氏病成淋巴细胞样细胞系 MDCC MSB1 总 RNA中扩增得到了鸡白细胞介素18(Chicken interleukin 18,ChIL 18)成熟蛋白基因的 cDNA,并将其克隆到 pMD18 T载体上。DNA序列测定表明,克隆得到的ChIL 18 cDNA与国外报道的完全一致,包括终止密码子在内其编码区的长度为510bp,编码169个氨基酸残基的蛋白质。将ChIL 18 成熟肽段编码区定向克隆到原核表达载体 pGEX 6P 1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下游,构建成原核表达质粒 pGEX ChIL18。该质粒的 BL21(DE3)LysS转化菌在 IPTG的诱导下可高效表达GST ChIL18基因融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白的32%。 展开更多
关键词 IL-18 克隆 DNA GST 诱导 编码区 白细胞介素18 高效表达 原核表达质粒 IPTG
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侧孢短芽孢杆菌碱性蛋白酶基因BLG4在枯草芽孢杆菌WB600中的高效表达 被引量：11
16
作者 郭菁 田宝玉 +3 位作者 蔡婉玲 黄薇 江贤章 黄建忠 《福建农林大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2011年第2期165-171,共7页
侧孢短芽孢杆菌G4菌株在侵染线虫的过程中可以分泌蛋白酶,降解线虫体壁,从而帮助细菌侵入宿主体内.在本文中,侧孢短芽孢杆菌的胞外蛋白酶BLG4基因经克隆后插入到改造后的枯草芽孢杆菌表达载体pWT22中,构建重组表达质粒pWT22-BLG4.构建... 侧孢短芽孢杆菌G4菌株在侵染线虫的过程中可以分泌蛋白酶,降解线虫体壁,从而帮助细菌侵入宿主体内.在本文中,侧孢短芽孢杆菌的胞外蛋白酶BLG4基因经克隆后插入到改造后的枯草芽孢杆菌表达载体pWT22中,构建重组表达质粒pWT22-BLG4.构建成功的重组质粒通过化学转化法转入枯草芽孢杆菌蛋白酶缺失菌株WB600中,转化子pWT22-BLG4/WB600在IPTG(1.0 mmol.L-1)的诱导下,发酵液上清中的蛋白酶活可达到620 U.mL-1,高于出发菌株G4的BLG4酶活(240 U.mL-1).经SDS-PAGE分析,重组子pWT22-BLG4/WB600产生了一条分子质量约为30 ku的条带,该条带的大小与侧孢短芽孢杆菌G4上清发酵液中BLG4条带的大小一致.而未经IPTG诱导的重组子pWT22-BLG4和经IPTG诱导的WB600则未出现该条带.结果证明侧孢短芽孢杆菌G4的碱性蛋白酶基因BLG4已在枯草芽孢杆菌WB600中获得了成功表达.重组蛋白酶具有与侧孢短芽孢杆菌G4产生的BLG4蛋白酶同样的酶学性质.同时,重组蛋白酶具有明显的杀线虫和体壁降解能力,表明其在线虫生物防治中将有广泛的应用前景. 展开更多
关键词 侧孢短芽孢杆菌 侵染性蛋白酶 枯草芽孢杆菌 高效表达 酶学特性 线虫
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人硫氧还蛋白在大肠杆菌中的高效表达、纯化及对内毒素血症小鼠的保护作用 被引量：5
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作者 曹丽 黄大无 +4 位作者 范慧 狄春辉 王应 陈建民 马大龙 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期733-736,共4页
为了对人硫氧还蛋白hTRX功能及其在休克治疗前景进行评价 ,将PCR扩增的hTRX基因连入pKPL 4载体 ,转化大肠杆菌pop2 136 .通过两步离子交换柱分离得到纯化的蛋白 ,进一步观察其稳定性及在体外对NFS 6 0和MCF 7细胞的促增殖活性 .结果发现... 为了对人硫氧还蛋白hTRX功能及其在休克治疗前景进行评价 ,将PCR扩增的hTRX基因连入pKPL 4载体 ,转化大肠杆菌pop2 136 .通过两步离子交换柱分离得到纯化的蛋白 ,进一步观察其稳定性及在体外对NFS 6 0和MCF 7细胞的促增殖活性 .结果发现 ,TRX蛋白可明显促进去细胞因子诱导的NFS 6 0细胞增殖和撤血清后MCF 7细胞的增殖 ,并发现外源性TRX可明显对小鼠内毒素血症起保护作用 . 展开更多
关键词 人硫氧还蛋白 大肠杆菌 高效表达 纯化 内毒素血症 小鼠 保护作用
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枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因的克隆及高效表达 被引量：12
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作者 徐娴 谢承佳 何冰芳 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第5期75-78,共4页
扩增了枯草芽孢杆菌中的葡萄糖脱氢酶基因(gdh),构建了诱导型表达载体pET-gdh,导入E.coliBL21(DE3)后获得了高效表达葡萄糖脱氢酶基因的重组菌BL21/pET-gdh。经过诱导时间、诱导温度参数的优化,IPTG诱导后重组菌BL21/pET-gdh的葡萄糖脱... 扩增了枯草芽孢杆菌中的葡萄糖脱氢酶基因(gdh),构建了诱导型表达载体pET-gdh,导入E.coliBL21(DE3)后获得了高效表达葡萄糖脱氢酶基因的重组菌BL21/pET-gdh。经过诱导时间、诱导温度参数的优化,IPTG诱导后重组菌BL21/pET-gdh的葡萄糖脱氢酶比酶活高达9.65 U/mg蛋白,SDS-PAGE电泳分析表明,重组蛋白质表达量占全菌胞内可溶性蛋白的53%,实现了葡萄糖脱氢酶基因的高效表达,为氧化还原酶催化系统提供高效率的NADP+与NADPH循环奠定了基础。 展开更多
关键词 葡萄糖脱氢酶 葡萄糖脱氢酶基因 高效表达 辅酶再生
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stat5高效表达对奶牛乳腺上皮细胞泌乳能力的影响 被引量：4
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作者 刘晓飞 高学军 +1 位作者 李庆章 佟慧丽 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期508-512,共5页
本研究旨在检验构建的stat5表达载体对奶牛乳腺上皮细胞泌乳能力的影响。构建真核表达载体pcD-NA3.1+-stat5-αS1,稳定转染到奶牛乳腺上皮细胞中。利用细胞活力分析仪、HPLC、Real-time PCR和WesternBlotting技术检测乳腺上皮细胞转染前... 本研究旨在检验构建的stat5表达载体对奶牛乳腺上皮细胞泌乳能力的影响。构建真核表达载体pcD-NA3.1+-stat5-αS1,稳定转染到奶牛乳腺上皮细胞中。利用细胞活力分析仪、HPLC、Real-time PCR和WesternBlotting技术检测乳腺上皮细胞转染前后stat5基因和蛋白的表达量、细胞活力及乳糖和酪蛋白分泌情况。结果表明,与空白细胞和空白载体组相比,非磷酸化STAT5蛋白和stat5基因的表达量增加(P<0.01),乳糖含量提高(P<0.05),细胞活力和增殖能力增强(P<0.01),酪蛋白和磷酸化STAT5(pSTAT5)表达增多(P<0.05)。结果提示,构建的载体pcDNA3.1+-stat5-αS1在乳腺上皮细胞中高效表达,显著提高乳腺上皮细胞的泌乳能力。 展开更多
关键词 STAT5 高效表达 稳定转染 奶牛 乳腺上皮细胞 泌乳
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枯草芽孢杆菌角蛋白酶kerC基因在毕赤酵母中的高效表达 被引量：4
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作者 韩学易 唐自钟 +1 位作者 王丽华 陈惠 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2013年第9期262-266,共5页
以角蛋白酶基因为研究对象,构建毕赤酵母(Pichia pastoris)稳定的高效表达系统。采用PCR方法从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B-3中克隆得到角蛋白酶基因kerC,将其构建在毕赤酵母表达载体pPICZαA上,得到重组质粒pPICZαA-kerC,转入... 以角蛋白酶基因为研究对象,构建毕赤酵母(Pichia pastoris)稳定的高效表达系统。采用PCR方法从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B-3中克隆得到角蛋白酶基因kerC,将其构建在毕赤酵母表达载体pPICZαA上,得到重组质粒pPICZαA-kerC,转入毕赤酵母X-33中,成功实现了角蛋白酶基因kerC在真核表达系统中的高效表达。重组菌株以体积分数1%的甲醇诱导培养108h后,酶活力可达32.31U/mL,提高了11.15倍。重组酶最适温度为60℃,最适pH值为7.5,反应体系中3mmol/L的Co2+、Fe2+和Ca2+能明显增强其酶活力。SDS-PAGE检测表明,重组酶分子质量约为31kD。 展开更多
关键词 枯草芽孢杆菌 角蛋白酶 kerC基因 毕赤酵母 高效表达
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