文摘本研究拟建立检测CK19基因表达的数字PCR(digital PCR,dPCR)方法并测试其性能,以期利用该方法的超高敏感性和绝对定量优势进行循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTC)的定量分析。首先,根据CK19基因的mRNA序列进行引物探针设计,以看家基因ABL1作为内参,采用人乳腺癌MCF7细胞和健康人白细胞从13套引物探针之中筛选出了最佳的引物探针,测序结果证实扩增序列无误。其次,针对选定的引物探针进行反应条件的优化,以不同浓度的健康人白细胞cDNA为模板进行空白检测限(limit of blank,LOB)的分析,证实当ABL1基因拷贝数为20,000、15,000、10,000、5000、2500时,CK19的LOB分别为9.24、8.93、3.12、3.17和2.53拷贝。再次,采用MCF7细胞和健康人白细胞的cDNA模板进行不同浓度预混的检测限(limit of detection,LOD)分析,证实50%、10%、5%、1%、0.5%和0.1%的浓度配比下均可以有效检出CK19基因,线性R2值为0.9998。最终,临床样本的数字PCR检测结果发现晚期乳腺癌患者的CK19拷贝数高于健康人对照。上述结果说明本研究所建立的检测CK19基因的数字PCR方法具有敏感、特异和定量准确等优势,未来经过进一步验证之后有望用于乳腺癌的CTC定量分析,具有良好的应用前景。
