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基于SYBR GreenⅡ的BVDV NS3基因实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用
1
作者 李阳 张世勋 +4 位作者 赫鸣睿 刘珊珊 岳山 刘宇 朱战波 《黑龙江八一农垦大学学报》 2025年第2期23-31,共9页
为了建立基于SYBR GreenⅡ的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)NS3基因实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测方法,设计并筛选了BVDV NS3基因的qRT-PCR引物,建立了BVDV NS3 qRT-PCR检测方法,并利用CFX96和猪警-2000 qRT-PCR仪检测了临床牛血清样本。结果显... 为了建立基于SYBR GreenⅡ的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)NS3基因实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测方法,设计并筛选了BVDV NS3基因的qRT-PCR引物,建立了BVDV NS3 qRT-PCR检测方法,并利用CFX96和猪警-2000 qRT-PCR仪检测了临床牛血清样本。结果显示,筛选出1对特异性好的引物,CFX96和猪警-2000 qRT-PCR的标准品最小检出值分别为1×10^(1)copies·μL^(-1)和1×10^(2) copies·μL^(-1),特异性和重复性均良好,且临床血清样本的检测结果准确、一致。研究为BVDV检测提供了技术手段。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 NS3基因 实时荧光定量pcr SYBR GreenⅡ
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实时荧光定量PCR法检测左旋多巴中大肠埃希菌宿主细胞DNA残留量
2
作者 许冰瑜 刘妍 +2 位作者 郭心瑶 严方 孙桂斌 《中国药科大学学报》 北大核心 2025年第2期176-182,共7页
采用实时荧光定量PCR技术,建立特异性强、灵敏度高的左旋多巴中大肠埃希菌(Escherichiacoli)宿主细胞DNA残留量的检测方法,并进行验证和初步应用。以大肠埃希菌中的相对保守的E.coli MB6菌株16S核糖体RNA基因序列作为目的基因设计多对引... 采用实时荧光定量PCR技术,建立特异性强、灵敏度高的左旋多巴中大肠埃希菌(Escherichiacoli)宿主细胞DNA残留量的检测方法,并进行验证和初步应用。以大肠埃希菌中的相对保守的E.coli MB6菌株16S核糖体RNA基因序列作为目的基因设计多对引物,通过PCR进行特异性扩增获得目的片段。将目的片段重组至pLENTI-BSD-CON载体构建重组质粒命名为pLENTI-BSD-CON-E.coli-16S,以其为标准品,结合磁珠法提取纯化DNA,建立定量PCR检测方法(SYBR-Green法)。对建立的方法进行线性与范围、准确度、精密度、专属性、定量限及耐用性的方法学验证,应用于左旋多巴原料药的检测,并与试剂盒检测方法(Taqman探针法)进行比较。建立的定量PCR检测方法(SYBR-Green法)正向引物序列:5'-TTCGATGCAACGCGAAGAAC-3';反向引物序列:5'-GTGTAGCCCTGGTCGTAAGG-3'。以重组质粒作为标准品,DNA质量浓度在10fg/μL~3 ng/μL范围内线性关系良好(R^(2)≥0.98),定量限为10 fg/μL,加标溶液回收率在59.7%~80.7%范围内,RSD均小于30%。应用该法对3批左旋多巴原料药进行检测,DNA残留量均在限度以下。结果表明,建立的检测方法可用于定量检测左旋多巴等由大肠埃希菌作为宿主细胞生产的生物制品的DNA残留量,并且其灵敏度优于试剂盒检测方法。 展开更多
关键词 大肠埃希菌 左旋多巴 构建质粒 实时荧光定量pcr 外源性DNA残留 帕金森病
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基于Taqman-MGB多重实时荧光PCR快速鉴定抗除草剂转基因大豆品系
3
作者 王凤军 王美蓉 +1 位作者 郑如福 陈锦辉 《中国粮油学报》 北大核心 2025年第1期211-219,共9页
通过NCBI比对DAS-68416-4、DAS-44406-6、DAS-81419-2、SOYA 305423转基因大豆的序列同源性,在种属特异性区域设计多重引物和特异性荧光探针,同时提取基因组DNA,对退火温度和引物探针浓度进行优化,确定最佳反应程序,建立同时检测4种转... 通过NCBI比对DAS-68416-4、DAS-44406-6、DAS-81419-2、SOYA 305423转基因大豆的序列同源性,在种属特异性区域设计多重引物和特异性荧光探针,同时提取基因组DNA,对退火温度和引物探针浓度进行优化,确定最佳反应程序,建立同时检测4种转基因大豆的多重实时荧光PCR方法。并对建立的实时荧光PCR反应进行特异性,重复性、灵敏性和适用性等方法学进行验证。结果表明DAS-68416-4、DAS-44406-6、DAS-81419-2、DP305423靶标序列的线性回归方程分别为y=-3.1524x+36.958,y=-3.1689x+38.828,y=-3.469x+37.933和y=-3.4839x+39.644;相关系数R 2分别为0.994、0.997、0.995和0.992;扩增效率分别为107%、106%、94.2%和93.7%,检出限可达9个拷贝,方法特异性强,重现性好,灵敏度高,是一种快速、经济、实用的检测方法,可对转基因大豆品系及其转化体成分进行大批量快速鉴定。 展开更多
关键词 转基因大豆 品系鉴定 多重 实时荧光pcr
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基于实时荧光PCR的鱼肉制品中帝王鲑、银鲑、粉鲑源成分的快速检测及定量研究
4
作者 李杰 赵玉强 +3 位作者 刘艳飞 沙玉彪 刘应炜 钱云开 《食品与发酵工业》 北大核心 2025年第4期319-326,共8页
建立一种利用实时荧光PCR技术快速检测帝王鲑、银鲑和粉鲑源性成分的方法。根据帝王鲑和银鲑的线粒体cytb基因序列以及粉鲑的COI基因序列设计Taq Man引物和探针组合,通过优化扩增反应体系进行实时荧光PCR扩增,达到快速检测帝王鲑、银鲑... 建立一种利用实时荧光PCR技术快速检测帝王鲑、银鲑和粉鲑源性成分的方法。根据帝王鲑和银鲑的线粒体cytb基因序列以及粉鲑的COI基因序列设计Taq Man引物和探针组合,通过优化扩增反应体系进行实时荧光PCR扩增,达到快速检测帝王鲑、银鲑和粉鲑源性成分的目的。该方法特异性良好,耗时短,反应只需1 h;帝王鲑的基因组DNA灵敏度可达到10-1 ng;在与罗非鱼粉混合的鱼肉制品中可检测,质量分数灵敏度达到0.1%,质量分数误差≤±5.0%;银鲑的基因组DNA灵敏度可达到1 ng;在与罗非鱼粉混合的鱼肉制品中可检测,质量分数灵敏度达到1%,质量分数误差≤±7.7%;粉鲑的基因组DNA灵敏度可达到1 ng;在与罗非鱼粉混合的鱼肉制品中可检测,质量分数灵敏度达到1%,质量分数误差≤±2.8%。该方法检测特异性强、所需时间短、灵敏度高、质量分数误差小,可满足帝王鲑、银鲑和粉鲑真伪鉴别和定量分析的要求。 展开更多
关键词 三文鱼 帝王鲑 银鲑 粉鲑 实时荧光pcr 检测 真伪鉴别
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实时荧光定量PCR快速检测药品中大肠埃希菌
5
作者 李杰 张华 +3 位作者 林鹏 王家芳 肖艳霞 钱云开 《食品与药品》 2025年第2期126-131,共6页
目的 建立一种药品中大肠埃希菌的实时荧光定量PCR快速检测方法。方法 根据大肠埃希菌malB基因序列,设计通用引物和探针,优化扩增反应体系,进行实时荧光定量PCR扩增,当出现C_t值时,说明供试品中检出大肠埃希菌。结果 大肠埃希菌基因组DN... 目的 建立一种药品中大肠埃希菌的实时荧光定量PCR快速检测方法。方法 根据大肠埃希菌malB基因序列,设计通用引物和探针,优化扩增反应体系,进行实时荧光定量PCR扩增,当出现C_t值时,说明供试品中检出大肠埃希菌。结果 大肠埃希菌基因组DNA检测限可达10^(-3 )ng,药品中大肠埃希菌检测限达3 cfu/g(ml),仅需24 h即可完成检测,采用该方法检测20批药品,结果与药典方法一致。结论 方法检测特异性强、所需时间短、灵敏度高,可作为《中国药典》大肠埃希菌检查法的补充方法。 展开更多
关键词 中国药典 药品 大肠埃希菌 实时荧光定量pcr 检测
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实时荧光定量PCR快速检测食品中沙门氏菌的研究
6
作者 刘占生 张莉 王嫘 《中国食品工业》 2025年第5期97-99,共3页
目的:构建快速检测食品中沙门氏菌的实时荧光定量PCR法。方法:以沙门氏菌核酸DNA提取物为模板开展荧光检测实验,建立快速检测手段,用于阳性培养液及食品中沙门氏菌检测分析。结果:该方案能在30批食品样本中成功扩增出沙门氏菌特异性片段... 目的:构建快速检测食品中沙门氏菌的实时荧光定量PCR法。方法:以沙门氏菌核酸DNA提取物为模板开展荧光检测实验,建立快速检测手段,用于阳性培养液及食品中沙门氏菌检测分析。结果:该方案能在30批食品样本中成功扩增出沙门氏菌特异性片段,最低检出浓度15CFU/mL,检测时长<24h。结论:本研究提出的实时荧光定量PCR法具有高效、快速、灵敏、精准的特点,可广泛应用于食品中沙门氏菌的快速筛查与检测,为食品安全监控提供强有力的技术支持。 展开更多
关键词 实时荧光定量pcr 沙门氏菌 快速检测
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姜荷花苞片实时荧光定量PCR内参基因筛选
7
作者 谭健俊 黄李珊 +2 位作者 周熠玮 徐晔春 叶远俊 《广东农业科学》 2025年第2期108-116,共9页
[目的]筛选适用于姜荷花苞片组织qRT-PCR分析的内参基因,为苞片颜色相关基因功能研究奠定理论基础。[方法]以9个不同颜色的姜荷花品种为试材,根据姜荷花基因组数据选择常用的内参基因,包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、18S核糖体RNA(18S... [目的]筛选适用于姜荷花苞片组织qRT-PCR分析的内参基因,为苞片颜色相关基因功能研究奠定理论基础。[方法]以9个不同颜色的姜荷花品种为试材,根据姜荷花基因组数据选择常用的内参基因,包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、18S核糖体RNA(18S rRNA)、蛋白磷酸酶2A(PP2A)、泛素蛋白(UBQ)、苹果酸脱氢酶(MDH)、肌动蛋白(Actin)、微管蛋白(TUB)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)8个看家基因,使用ΔCt、geNorm、NormFinder和BestKeeper 4种分析方法评估基因表达的稳定性,通过RefFinder程序综合评价以筛选出姜荷花苞片组织的最佳内参基因。[结果]8个内参基因均扩增出单一主峰,引物标准曲线相关系数R^(2)≥0.98,扩增效率为99.5%~125.0%,PCR产物经1%琼脂糖电泳检测显示条带清晰单一,表明引物设计特异性好。4种不同的算法分析获得的结果排名有差异,其中MDH在ΔCt、geNorm和NormFinder分析中为表达最稳定的内参基因,18S rRNA在BestKeeper分析中为表达最稳定的内参基因。利用RefFinder程序综合评价得出候选内参基因稳定性综合排名,排序依次为MDH>Actin>TUB>18S rRNA>PP2A>GAPDH>UBQ>PAL,表明不同品种姜荷花苞片最佳内参基因是MDH,其次为Actin和TUB,PAL稳定性最差、不适合作为姜荷花苞片组织的内参基因。[结论]MDH可作为不同品种姜荷花苞片组织的稳定内参基因,为后续深入开展姜荷花苞片颜色合成相关基因的表达模式分析提供参考。 展开更多
关键词 实时荧光定量pcr 姜荷花 内参基因 苞片颜色 MDH 基因表达模式
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水泡性口炎病毒血清型特异LUX实时荧光RT-PCR检测方法的建立 被引量：8
8
作者 陈茹 刘中勇 +5 位作者 曾碧健 曹永长 陈俊伟 赵吟 林志雄 毕英佐 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第4期522-528,共7页
采用LUX荧光核酸扩增技术原理,以水泡性口炎病毒(VSV)NJ、IND型NS基因为模板分别设计并合成单标记LUX荧光引物,建立血清型特异的VSV荧光RT-PCR检测方法。试验表明,两种型特异的LUX荧光RT-PCR能分别特异地鉴定VSV血清型,对口蹄疫、猪水... 采用LUX荧光核酸扩增技术原理,以水泡性口炎病毒(VSV)NJ、IND型NS基因为模板分别设计并合成单标记LUX荧光引物,建立血清型特异的VSV荧光RT-PCR检测方法。试验表明,两种型特异的LUX荧光RT-PCR能分别特异地鉴定VSV血清型,对口蹄疫、猪水泡病等病毒以及对照细胞、健康动物组织RNA样品的检测结果均为阴性。对比检测试验表明,LUX荧光RT-PCR的检测敏感性比常规RT-PCR提高达10倍以上,对VSV细胞增殖病毒液的检测灵敏度可达1 TCID50。对人工感染豚鼠样品以及临床样品的检测试验证实,该LUX荧光RT-PCR可有效检测到人工感染动物组织以及进口牛临床样品中的水泡性口炎病毒,并能鉴定感染病毒血清型。所报道的检测方法,包括样品核酸提取、LUX荧光RT-PCR以及熔解曲线分析,可在3 h内完成。 展开更多
关键词 水泡性口炎病毒 实时荧光rt—pcr LUX荧光引物
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百合无症病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立 被引量：3
9
作者 余澍琼 陈先锋 +3 位作者 张吉红 于翠 张慧丽 闻伟刚 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2014年第1期127-130,共4页
百合无症病毒(Lily symptomless virus,LSV)是侵染百合科植物的主要病毒之一。根据该病毒不同分离株外壳蛋白基因(coat protein,CP)的保守序列,设计特异性引物与荧光探针,建立了LSV的实时荧光RTPCR检测方法。利用该方法检测LSV的2个阳... 百合无症病毒(Lily symptomless virus,LSV)是侵染百合科植物的主要病毒之一。根据该病毒不同分离株外壳蛋白基因(coat protein,CP)的保守序列,设计特异性引物与荧光探针,建立了LSV的实时荧光RTPCR检测方法。利用该方法检测LSV的2个阳性样品,均能够得到典型扩增曲线,而在百合斑驳病毒、烟草环斑病毒、番茄环斑病毒等其他病毒阳性样品中没有典型的扩增曲线,表明了该方法的特异性。与普通RTPCR法相比,此方法灵敏度提高10倍。应用该方法,2012年6月至今,宁波出入境检验检疫局从荷兰进境的67批百合种球样品中检出53批百合无症病毒阳性,检出率为93%。 展开更多
关键词 百合无症病毒 实时荧光rt—pcr 百合科
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甘蔗黄叶病毒实时荧光RT-PCR检测体系研究 被引量：3
10
作者 王洪星 龚殿 +2 位作者 张雨良 王健华 刘志昕 《中国糖料》 2013年第1期1-4,共4页
甘蔗黄叶综合症(yellow leaf syndrome,YLS后称甘蔗黄叶病)是由甘蔗黄叶病毒(sugarcane yellow leaf virus,ScYLV)引起的一种重要的甘蔗病害,为更快、更准确地检测ScYLV,合成了一对特异性引物s-pf和s-pr,建立了运用SYBR Green I荧光染... 甘蔗黄叶综合症(yellow leaf syndrome,YLS后称甘蔗黄叶病)是由甘蔗黄叶病毒(sugarcane yellow leaf virus,ScYLV)引起的一种重要的甘蔗病害,为更快、更准确地检测ScYLV,合成了一对特异性引物s-pf和s-pr,建立了运用SYBR Green I荧光染料法检测ScYLV的实时荧光RT-PCR体系,并对该体系的特异性、灵敏性和适用性进行了测试。结果表明:该检测体系能特异地检出ScYLV,对测试的高粱花叶病毒不能检出,灵敏度比常规PCR高100倍,适用性广。实时荧光RT-PCR检测整个过程完全闭管,无需PCR后处理且SYBR Green I荧光染料成本较低,适用于检测甘蔗体内含量较低的ScYLV病毒。 展开更多
关键词 甘蔗黄叶病毒 实时荧光rt—pcr 检测
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马铃薯病毒病实时荧光定量PCR检测技术
11
作者 杨茹薇 刘易 +2 位作者 古丽米拉·热合木土拉 孙慧 江应红 《新疆农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期2484-2490,共7页
【目的】鉴定马铃薯主要病毒病病原,为马铃薯病毒病的科学防治提供科学依据。【方法】根据Gen-Bank数据库注册序列设计马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、马铃薯S病毒(Potato virus S,PVS)、马铃薯卷叶病毒(Potato leaf roll virus,PLRV... 【目的】鉴定马铃薯主要病毒病病原,为马铃薯病毒病的科学防治提供科学依据。【方法】根据Gen-Bank数据库注册序列设计马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、马铃薯S病毒(Potato virus S,PVS)、马铃薯卷叶病毒(Potato leaf roll virus,PLRV)的检测引物,完成引物浓度及系统优化。【结果】建立3种马铃薯病毒病的实时荧光定量PCR检测技术体系(real-time fluorescent quantitative RT-PCR,RT-qPCR),其标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数为99.42%以上,扩增效率均为84.48%以上,可快速、准确检测出3种马铃薯病毒。【结论】实时荧光定量PCR检测技术是一种高灵敏度、特异性强的检测方法,可实时监测马铃薯生产中病毒病的感染情况。 展开更多
关键词 马铃薯 病毒病 实时荧光定量pcr
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鸡传染性喉气管炎病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用
12
作者 张玉霞 董雯雯 +2 位作者 袁小远 孟凯 徐怀英 《山东农业科学》 北大核心 2024年第6期128-132,共5页
鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)以往多感染蛋鸡,近年来在蛋种鸡、商品肉鸡中连续多发,表明该病毒感染谱有扩大风险,因此有必要加强对ILTV的监测。为建立高效、灵敏的ILTV检测方法,本研究以ILTV的TK基... 鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)以往多感染蛋鸡,近年来在蛋种鸡、商品肉鸡中连续多发,表明该病毒感染谱有扩大风险,因此有必要加强对ILTV的监测。为建立高效、灵敏的ILTV检测方法,本研究以ILTV的TK基因为靶基因设计引物,扩增并构建pMD18-T-TK质粒标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法和标准曲线,对其特异性、敏感性和重复性进行验证,并对临床疑似病例进行检测。结果发现,该检测方法特异性良好,与其他常见症状相似病原无交叉反应;最低检测浓度为1.55拷贝/μL,灵敏度是普通PCR方法的10倍;重复性好,批内、批间变异系数在0.79%~1.83%之间。表明本研究建立的ILTV实时荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高,可为ILTV的临床诊断和流行病学研究等提供有效的检测方法。 展开更多
关键词 鸡喉气管炎病毒 TK基因 实时荧光定量pcr 特异性 敏感性 重复性
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低温弱光胁迫下茄子幼苗实时荧光定量PCR内参基因的筛选与评价
13
作者 林珲 裘波音 +1 位作者 朱海生 温庆放 《福建农业科技》 CAS 2024年第8期1-15,共15页
为了探索茄子Solanum melongena L.的基因表达模式,利用qRT-PCR方法分析了茄子ACT、EF1α、TUA、TUB、GAPDH、eIF、UBQ、UBI3、PP2A、CYP、RPL28、L25、SAND、TBP、DNAJ、APRT、EXP、CAC、HSP20和CysPro 20个候选内参基因mRNA的表达差... 为了探索茄子Solanum melongena L.的基因表达模式,利用qRT-PCR方法分析了茄子ACT、EF1α、TUA、TUB、GAPDH、eIF、UBQ、UBI3、PP2A、CYP、RPL28、L25、SAND、TBP、DNAJ、APRT、EXP、CAC、HSP20和CysPro 20个候选内参基因mRNA的表达差异情况,并运用GeNorm、NormFinder和BestKeeper 3种计算方法评价茄子20个候选内参基因在低温、弱光、低温弱光叶片样品中的表达稳定性。结果表明:茄子20个候选内参基因荧光定量引物扩增效率(E)数值在96.8%~117.6%,相关系数(R^(2))介于0.9688~0.9999,扩增效率良好,扩增反应具有高度的专一性,引物能特异性扩增,特异性好,均为单峰,样品间扩增曲线重复性强,可用于qRT-PCR扩增。茄子20个候选内参基因C_(T)值表达丰度分析,发现茄子20个候选内参基因平均CT值在19.76~31.20。3种计算方法的综合评价分析结果显示,TBP基因在所有样本中为最稳定的内参基因。研究可为茄子低温、弱光和低温弱光胁迫下基因特异性表达研究提供了合适的内参基因。 展开更多
关键词 茄子 内参基因 实时荧光定量pcr 标准化 基因表达
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食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌实时荧光PCR检测的研究
14
作者 蔡彦秋 查杰 +1 位作者 沐阳 陈辉 《食品安全导刊》 2024年第20期44-47,共4页
目的:建立唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的核酸检测方法。方法:根据16S~23S rRNA基因片段序列,利用Oligo7设计TaqMan探针及引物,并验证实时荧光PCR检测方法的特异性和灵敏性。结果:用实时荧光PCR检测方法检测15株标准菌株,只有唐菖蒲伯克霍尔德... 目的:建立唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的核酸检测方法。方法:根据16S~23S rRNA基因片段序列,利用Oligo7设计TaqMan探针及引物,并验证实时荧光PCR检测方法的特异性和灵敏性。结果:用实时荧光PCR检测方法检测15株标准菌株,只有唐菖蒲伯克霍尔德氏菌呈阳性,验证了此方法具有良好的特异性。灵敏度实验中得出菌液灵敏度为5.8×10~2 CFU·mL^(-1),DNA灵敏度为7.2×10^(-4) ng·μL^(-1)。结论:建立的实时荧光PCR检测方法有良好的特异性和灵敏度,该方法可用于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的快速检测,具有较好的应用价值。 展开更多
关键词 唐菖蒲伯克霍尔德氏菌 实时荧光pcr 特异性 灵敏性
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小反刍兽疫病毒及山羊痘病毒N-ITR基因二联实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立 被引量：14
15
作者 赵文华 杨仕标 +1 位作者 高华峰 王金萍 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第3期65-71,共7页
为实现山羊2种疫病病原体——小反刍兽疫病毒(PPRV)和山羊痘病毒(GTPV)的同步快速检测,基于PPRV的N基因及GTPV的ITR基因,分别设计合成2套特异性引物及探针;探针分别用5′FAM-TAMRA3′及5′JOE-Eclipse3′标记物进行标记以实现同步检测... 为实现山羊2种疫病病原体——小反刍兽疫病毒(PPRV)和山羊痘病毒(GTPV)的同步快速检测,基于PPRV的N基因及GTPV的ITR基因,分别设计合成2套特异性引物及探针;探针分别用5′FAM-TAMRA3′及5′JOE-Eclipse3′标记物进行标记以实现同步检测。试验结果显示,所建立的N-ITR二联探针实时荧光定量RT-PCR方法可同步检测PPRV和GTPV,产生特异性荧光信号,而对禽痘病毒(FPV)、犬瘟热病毒(CDV)等相关病毒无荧光信号检出。以PPRV-N和GTPVITR的pMD18-T载体质粒为标准品,构建了二联标准曲线,N-ITR探针对PPRV和GTPV的检测敏感度可分别达102和103拷贝/μL。本研究初步建立了可同步快速特异性检测PPRV和GTPV的二联实时荧光定量RT-PCR方法。 展开更多
关键词 小反刍兽疫病毒 山羊痘病毒 二联实时荧光定量rt—pcr 探针
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荧光实时定量RT-PCR检测DD3mRNA方法的建立 被引量：3
16
作者 毛晓露 陶志华 +6 位作者 陈晓东 陈占国 林晓梅 王瑜敏 朱燕英 温秀姝 余凯远 《临床检验杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第5期335-337,共3页
目的建立荧光实时定量RT—PCR（FQ—RT—PCR）检测前列腺癌（PCa）特异基因DD3mRNA的方法。方法在DD3基因的外显子1和3之间设计一对引物和一条TaqMan—MGB探针，优化反应体系，建立DD3mRNA的FQ—RT—PCR方法，并进行方法学评价。将PCR... 目的建立荧光实时定量RT—PCR（FQ—RT—PCR）检测前列腺癌（PCa）特异基因DD3mRNA的方法。方法在DD3基因的外显子1和3之间设计一对引物和一条TaqMan—MGB探针，优化反应体系，建立DD3mRNA的FQ—RT—PCR方法，并进行方法学评价。将PCR扩增产物经凝胶电泳纯化后与pBluescript Ⅱ SK载体连接，再将重组质粒转化感受态细胞进行克隆；提取重组质粒在紫外分光光度计上定量，作为定量检测的标准品。结果重组质粒经PCR扩增及序列测定，表明pBluescriptⅡSK—DD3cDNA克隆成功。PCR扩增产物经测序分析证实为DD3 mRNA特异性片段。本法灵敏度为6拷贝／反应，线性范围为6～6×10^8拷贝／反应，相关系数为0．9985，批内、批间变异系数分别为1.0％～2.0％和1、3％～6、6％。结论成功建立了FQ—RT—PCR检测DD3mRNA的方法。为DD3 mRNA作为前列腺癌的诊断指标提供了方法学依据，也为其他肿瘤基因的检测提供了方法学启示。 展开更多
关键词 DD3基因 MRNA 实时荧光定量rt—pcr 前列腺癌
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鸭IFN-γ mRNA实时荧光定量RT-PCR方法的建立 被引量：7
17
作者 谢秀兰 汤承 +1 位作者 杨发龙 岳华 《动物医学进展》 CSCD 2008年第5期17-20,共4页
为建立检测鸭IFN-γ mRNA表达的实时荧光定量RT—PCR方法，根据GenBank中鸭IFN-γ基因序列，在保守区域设计并合成一对引物，采用SYBR Green Ⅰ染料，建立检测鸭IFN-γ mRNA的实时荧光定量RT-PCR方法（real-time RT-PCR）。试验以PCR产... 为建立检测鸭IFN-γ mRNA表达的实时荧光定量RT—PCR方法，根据GenBank中鸭IFN-γ基因序列，在保守区域设计并合成一对引物，采用SYBR Green Ⅰ染料，建立检测鸭IFN-γ mRNA的实时荧光定量RT-PCR方法（real-time RT-PCR）。试验以PCR产物为标准品，建立标准曲线，随后进行熔解曲线分析和稳定性研究。结果Ct值线性范围为12．0～33．0，相关系数为0．997；熔解曲线显示产物为单特异峰，Tm为82．5±0℃；组内变异系数（CV％）为4．26％；纽间试验无显著差异（P〉0．05）。建立的检测鸭IFN-γ mRNA的Real—time RT—PCR方法具有检测范围广、扩增效率高、特异性好、重复性和稳定性良好等特点。 展开更多
关键词 鸭 Γ干扰素 实时荧光定量rt—pcr SYBR Green Ⅰ
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牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立 被引量：22
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作者 范晴 谢芝勋 +5 位作者 刘加波 庞耀珊 邓显文 谢志勤 谢丽基 彭宜 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2010年第10期10-14,共5页
根据GenBank公布的牛病毒性腹泻病毒（BVDV）5′端非编码区核苷酸序列,设计引物和TaqMan荧光探针,建立了BVDV的实时荧光定量PCR检测方法。建立的方法只能检测到BVDV,而与CSFV、BRV、MT及IBRV没有交叉反应,具有高度的特异性,在1010~102... 根据GenBank公布的牛病毒性腹泻病毒（BVDV）5′端非编码区核苷酸序列,设计引物和TaqMan荧光探针,建立了BVDV的实时荧光定量PCR检测方法。建立的方法只能检测到BVDV,而与CSFV、BRV、MT及IBRV没有交叉反应,具有高度的特异性,在1010~102模板范围内具有良好的线性关系,所制作的标准曲线相关系数为0.991,最低可检测到100个拷贝的阳性质粒。所建立的BVDV实时荧光定量PCR检测方法具有快速、特异、灵敏等特点。 展开更多
关键词 牛病毒性腹泻病毒 实时荧光定量pcr 检测
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猪肺炎支原体实时荧光定量PCR检测方法建立及应用 被引量：4
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作者 刘莹 李峰 +3 位作者 殷宗俊 王敬茹 李书光 郑先瑞 《动物医学进展》 北大核心 2024年第6期34-38,共5页
猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)是一种严重危害养猪业的重要传染性病原,以猪肺炎支原体编码乳酸脱氢酶的P 36基因保守序列为基础,设计一套特异性引物和探针,并通过优化筛选反应条件,建立了一种Mhp的实时荧光定量RT-PCR检测方... 猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)是一种严重危害养猪业的重要传染性病原,以猪肺炎支原体编码乳酸脱氢酶的P 36基因保守序列为基础,设计一套特异性引物和探针,并通过优化筛选反应条件,建立了一种Mhp的实时荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明,最适引物浓度为10μmol/L,探针浓度为5μmol/L,以浓度为1×10^(2)~1×10^(6)copies/μL的标准品构建标准曲线相关系数为0.998,扩增效率可达96%。该方法能特异地检测猪肺炎支原体,与其他动物支原体及猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病病毒等病原无交叉反应;灵敏度是常规PCR的10倍,可达到10拷贝;该方法重复性较好,组内和组间变异系数均小于2%。在对30份临床样本的检测中,建立的实时荧光定量PCR检出率为63%(19/30),而常规PCR的检出率仅有30%(9/30)。结果表明,成功建立了猪肺炎支原体实时荧光定量PCR检测方法,可用于猪肺炎支原体的病原学检测和流行病学调查。 展开更多
关键词 猪肺炎支原体 Taq Man探针 实时荧光定量pcr
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猪流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立 被引量：11
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作者 张太翔 凌宗帅 +5 位作者 岳志芹 徐彪 梁成珠 刘文鹏 张焕海 张艺兵 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2012年第6期181-184,共4页
本研究选取猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)的NP基因序列设计引物和探针,建立了检测SIV的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释的含有SIV目的扩增片段的质粒作为标准品,进行定量PCR反应以确定检测灵敏度。2.0×108至2.0... 本研究选取猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)的NP基因序列设计引物和探针,建立了检测SIV的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释的含有SIV目的扩增片段的质粒作为标准品,进行定量PCR反应以确定检测灵敏度。2.0×108至2.0×102拷贝/μL 7个数量级的范围内定量PCR有"S"型扩增曲线,检测灵敏度为20个拷贝/μL。根据病毒拷贝数与Ct值的关系绘制了标准曲线。该方法具有特异性,对猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、口蹄疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸都没有扩增反应。本研究建立的实时定量PCR方法,灵敏度高、特异性好,可以进行定量分析,在猪流感的快速检测上具有重要意义。 展开更多
关键词 猪流感病毒 实时荧光定量pcr TAQMAN探针
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