利用反向遗传学技术拯救重组H1N1 pdm09亚型流感病毒

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作者 黎燕 周克茹 +1 位作者 季旻珺 王桂芹 《南京医科大学学报(自然科学版)》 北大核心 2025年第3期319-326,共8页

目的:利用反向遗传学技术拯救重组H1N1 pdm09病毒,评价其在MDCK细胞和鸡胚内的生长特性以及对BALB/c小鼠的致病性。方法:RT-PCR技术扩增A/Puerto Rico/8/1934(简称PR8)病毒基因片段,并克隆至pHW2000双向表达载体上。全球共享流感数据倡... 目的:利用反向遗传学技术拯救重组H1N1 pdm09病毒,评价其在MDCK细胞和鸡胚内的生长特性以及对BALB/c小鼠的致病性。方法:RT-PCR技术扩增A/Puerto Rico/8/1934(简称PR8)病毒基因片段,并克隆至pHW2000双向表达载体上。全球共享流感数据倡议组织(global initiative of sharing all influenza data,GISAID)数据库中下载A/Wisconsin/588/2019(H1N1)的血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)序列,将其HA非编码区替换为A/California/07/2009(H1N1)的HA非编码区。全基因合成A/Wisconsin/588/2019的HA和NA片段,分别克隆至pHW2000双向表达载体上。将PR8病毒6个内部基因重组质粒与A/Wisconsin/588/2019的HA和NA重组质粒共转染293T细胞与MDCK细胞,拯救重组病毒。对重组病毒进行血凝效价测定和RT-PCR鉴定以判断是否拯救成功。将重组病毒接种MDCK细胞和9~10日龄鸡胚,评价其生长特性并绘制生长曲线。将重组病毒以滴鼻方式感染BALB/c小鼠,记录小鼠体重变化和生存率以评价其致病性。结果:成功拯救出重组A/Wisconsin/588/2019病毒,血凝效价为1∶8,测序鉴定其HA和NA序列与预期一致,重组病毒接种MDCK细胞后72 h,大部分细胞完全脱落,病毒滴度为10^(5.38)TCID_(50)/mL,复制高峰期为接种后60 h,接种鸡胚后的血凝效价最高可达1∶2^(8)。重组病毒(病毒稀释比为1∶1)滴鼻BALB/c小鼠后第8天,小鼠全部死亡,对小鼠的半数致死剂量为10^(-1.38)/50μL。结论:成功拯救一株重组H1N1pdm09病毒,该病毒在MDCK细胞上生长良好且具有良好的鸡胚适应性,对小鼠具有致病性和致死性,为反向遗传学技术快速拯救流感病毒提供新思路。 展开更多

关键词 季节性流感 H1N1 反向遗传学技术

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反向遗传学技术应用于猪繁殖与呼吸综合征病毒研究的进展 被引量：3

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作者 郑海红 孙竹筠 +2 位作者 张可煜 高飞 韦祖樟 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第10期1072-1076,共5页

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinere productive and respiratory syndrome virus, PRRSV)属于动脉炎病毒科(Arteriviridae)、动脉炎病毒属(Arterivirus)成员。根据血清学和遗传特性的差异,可将PRRSV分为欧洲型(1型)和美洲型(2型)[1]。... 猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinere productive and respiratory syndrome virus, PRRSV)属于动脉炎病毒科(Arteriviridae)、动脉炎病毒属(Arterivirus)成员。根据血清学和遗传特性的差异,可将PRRSV分为欧洲型(1型)和美洲型(2型)[1]。随着反向遗传操作系统的建立,使对RNA病毒基因组在其cDNA分子水平上进行体外人工操作成为可能,如对基因进行点突变、缺失、插入、颠换、转位和互补等改造。近年来,科学家通过对PRRSV基因组的反向遗传操作[2-6],在研究PRRSV的基因复制、亚基因组转录与表达调控机理、PRRSV与宿主间的相互作用关系以及PRRSV用于异源基因表达载体来开发抗病毒疫苗等研究,取得了一些显著成果。本文就应用反向遗传学技术来研究PRRSV的进展报告做一综述。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 反向遗传操作系统 动脉炎病毒属 遗传特性 反向遗传学技术 美洲型 RNA病毒 基因复制

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反向遗传学技术及在RNA病毒研究中的应用 被引量：6

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作者 张英 李莉 +2 位作者 李旭 韩松 鲁会军 《动物医学进展》 CSCD 2008年第3期60-63,共4页

RNA病毒的反向遗传学技术是指由病毒的cDNA克隆获取RNA病毒的一项技术,该技术通过人为加入DNA基因片段,实现了在DNA水平上对RNA病毒基因组的人工操作。反向遗传系统可以对RNA病毒直接进行遗传操作,为RNA病毒的分子生物学研究提供了一种... RNA病毒的反向遗传学技术是指由病毒的cDNA克隆获取RNA病毒的一项技术,该技术通过人为加入DNA基因片段,实现了在DNA水平上对RNA病毒基因组的人工操作。反向遗传系统可以对RNA病毒直接进行遗传操作,为RNA病毒的分子生物学研究提供了一种强大的工具。自20世纪70年代后期第一例RNA病毒感染性克隆构建成功以来,RNA病毒的分子生物学研究取得了长足的进展,这在很大程度上归功于各种RNA病毒反向遗传系统的建立。文章介绍了反向遗传学技术的基本特点、技术方法及其在正、负链RNA病毒的基因功能、致病机制及新型病毒载体等方面的研究及应用情况。 展开更多

关键词 反向遗传学技术 正链RNA病毒 负链RNA病毒 感染性克隆

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反向遗传学技术的应用 被引量：2

4

作者 杨彬 王雪峰 王凤龙 《中国畜牧兽医》 CAS 2008年第12期62-64,共3页

反向遗传学是直接从遗传物质入手研究生命现象与规律,其相应的操作技术已在生命科学研究的各个领域显示出了广泛的应用前景。作者对反向遗传学技术的应用进行了评述。

关键词 反向遗传学技术 病毒基因组 疫苗

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流感病毒反向遗传学技术研究进展

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作者 刘大飞 刘春国 +1 位作者 刘明 刘大程 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2008年第8期867-874,共8页

流感病毒亚型众多,且极易发生变异,给防控带来很大困难,所以当务之急应加强其在致病机理、传播机制等方面的研究和加快新型流感疫苗的开发.近年来,反向遗传学技术的发展为流感病毒基因功能研究和疫苗制备方面开辟了新思路.

关键词 流感病毒 反向遗传学技术 功能研究 标记疫苗

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反向遗传学技术在疫苗研究的进展

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作者 薄洪 舒跃龙 《生物产业技术》 2010年第2期43-47,共5页

本文通过反向遗传学技术的基本原理，发展历史和反向遗传学技术在疫苗研究方面的进展与应用，重点介绍了反向遗传学技术在流感病毒疫苗方面的应用。

关键词 反向遗传学技术 疫苗 流感病毒

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反向遗传学技术在PRRSV基础与应用领域中的研究进展 被引量：3

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作者 祝徐航 胡灵子 +2 位作者 牟泓晔 宋厚辉 王晓杜 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第8期895-901,共7页

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductiveand respiratory syndrome virus,PRRSV)是一种球形、带囊膜的病毒。其基因组为单股正链、不分节段的RNA,大小约为15 kb[1-3],包含10个开放阅读框。PRRSV主要造成妊娠母猪流产、死胎和仔猪... 猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductiveand respiratory syndrome virus,PRRSV)是一种球形、带囊膜的病毒。其基因组为单股正链、不分节段的RNA,大小约为15 kb[1-3],包含10个开放阅读框。PRRSV主要造成妊娠母猪流产、死胎和仔猪呼吸道疾病,高致病性PRRSV(HP-PRRSV)甚至能引起各日龄的猪发病。根据病毒基因组和GP5的抗原性差异,可将PRRSV分为PRRSV-I和PRRSV-II,我国常见的是以NADC30-like、 HP-PRRSV为代表的PRRSV-II[4]。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 妊娠母猪流产 高致病性PRRSV 抗原性差异 猪呼吸道疾病 病毒基因组 GP5 反向遗传学技术

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反向遗传学技术可快捷改善口蹄疫疫苗株的酸稳定性 被引量：1

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作者 Yuan Hong Li Ping-hua Bao Hui-fang 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第2期216-216,共1页

口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起猪、牛、羊等多种偶蹄动物感染的一种急性、热性、高度接触性传染病,被OIE列为必报疫病之首,我国将其规定为一类动物传染病。目前,疫苗接种与扑杀结合的综合措施是防治和根除FMD的最经济有效的技术... 口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起猪、牛、羊等多种偶蹄动物感染的一种急性、热性、高度接触性传染病,被OIE列为必报疫病之首,我国将其规定为一类动物传染病。目前,疫苗接种与扑杀结合的综合措施是防治和根除FMD的最经济有效的技术手段。FMDV病毒没有囊膜包裹,对物理化学物质的刺激非常敏感。 展开更多

关键词 口蹄疫疫苗 接触性传染病 动物传染病 疫苗接种 偶蹄动物 反向遗传学技术 酸稳定性 OIE

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负股RNA病毒反向遗传学操作及其应用 被引量：2

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作者 刘惠莉 陆承平 李震 《国外畜牧学（猪与禽）》 2004年第5期48-50,共3页

关键词 负股RNA病毒 反向遗传学操作技术 辅助病毒法 完全质粒操作系统

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反向遗传学在植物研究中的应用

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作者 闫晓丹 《中国果菜》 2010年第3期54-55,共2页

反向遗传学是直接从遗传物质入手来研究生命现象与规律的,其相应的操作技术已在生命科学研究的各个领域显示出了广泛的应用前景。本文就反向遗传学在植物研究中的应用进行了评述,并对其前景进行了阐述。

关键词 反向遗传学技术 反向遗传学

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嵌合IL-21的重组溶瘤流感病毒构建及其在肝癌中的溶瘤机制

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作者 曹蕊 曾桂能 +5 位作者 田昱莹 李聪 肖瑞雪 徐永茹 杨鹏辉 康毅敏 《陆军军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第24期2736-2744,共9页

目的拯救嵌合白细胞介素-21(interleukin-21,IL-21)的重组溶瘤流感病毒,评价其对肝细胞癌的抑制效果及安全性,并探索其联合程序性死亡受体1(programmed cell death-protein 1,PD-1)抗体增强抗肿瘤作用的机制。方法将IL-21基因片段插入... 目的拯救嵌合白细胞介素-21(interleukin-21,IL-21)的重组溶瘤流感病毒,评价其对肝细胞癌的抑制效果及安全性,并探索其联合程序性死亡受体1(programmed cell death-protein 1,PD-1)抗体增强抗肿瘤作用的机制。方法将IL-21基因片段插入流感病毒PR8的非结构蛋白(nonstructural protein,NS)序列,利用反向遗传学(reverse genetics,RG)技术,拯救重组溶瘤流感病毒rOV-IL-21-NS;采用半数组织培养感染剂量(50%tissue culture infectious dose,TCID50)和血凝实验测定病毒滴度和毒力;采用反转录定量聚合酶链反应(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)、凝胶电泳和测序分析验证外源基因是否成功插入NS序列;通过透射电镜观察病毒形态特征及大小,采用CCK-8检测其对肝癌细胞活力的影响;建立C57BL/6小鼠肝细胞癌皮下荷瘤模型,将45只8周龄雌性C57BL/6小鼠(体质量16~20 g)按简单随机分组法分为5组(每组9只):PBS组、PR8组、PD-1抗体组、rOV-IL-21-NS组和rOV-IL-21-NS联合PD-1抗体治疗组,以评价单药和联合疗法抗肿瘤效果;通过流式细胞术评价单药和联合疗法对肿瘤免疫微环境的调控作用。结果利用RG技术成功拯救重组溶瘤流感病毒rOV-IL-21-NS,经测序验证了IL-21成功插入目的序列,其可稳定传代,第6代病毒血凝效价达211,病毒滴度达106 TCID50/mL。rOV-IL-21-NS选择性降低肝癌细胞活力而对正常肝细胞无明显影响。相对于PBS组,rOV-IL-21-NS联合PD-1抗体显著抑制小鼠肿瘤的生长(P<0.001),增加脾脏组织中CD4+CD69+T及CD8+CD69+T细胞的比例(P<0.05)。结论嵌合IL-21的重组溶瘤流感病毒rOV-IL-21-NS可有效、安全地靶向杀伤肝癌细胞,协同PD-1抗体进一步增强T细胞活化,改善免疫微环境。 展开更多

关键词 溶瘤病毒 反向遗传学技术 联合治疗 白细胞介素-21 PD-1抗体 肝细胞癌

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鸡传染性支气管炎病毒研究进展 被引量：20

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作者 贺会利 魏小兵 +5 位作者 欧长波 徐敏 闫艺婷 刘明成 勾肖晶 刘兴友 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2014年第7期73-77,共5页

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)主要侵害鸡的呼吸系统和泌尿生殖系统,可以引起鸡的呼吸道症状、肾脏损害、产蛋量和蛋的品质下降。由于IBV基因组的RNA酶缺乏严密的校正功能,容易发生变异,使该病毒的基因型、血清型复杂,给该病的防控带来很... 鸡传染性支气管炎病毒(IBV)主要侵害鸡的呼吸系统和泌尿生殖系统,可以引起鸡的呼吸道症状、肾脏损害、产蛋量和蛋的品质下降。由于IBV基因组的RNA酶缺乏严密的校正功能,容易发生变异,使该病毒的基因型、血清型复杂,给该病的防控带来很大的困难,从而给养殖业造成了重大经济损失。从2003年起对IBV的分子生物学方面的研究也成了热点,寻找防控此病的有效措施。论文概述了近年来在IBV的基因组、结构蛋白、分子诊断及反向遗传学技术等方面的研究进展,为IBV的研究和防控提供参考。 展开更多

关键词 鸡传染性支气管炎病毒 基因组结构 结构蛋白 分子生物学诊断 反向遗传学技术

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TALEN构建与斑马鱼基因组定点突变的实验方法与流程 被引量：21

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作者 沈延 黄鹏 张博 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2013年第4期533-544,共12页

类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)是最近发展起来的一类新型的人工核酸内切酶,它由特异性的TALE DNA结合结构域和非特异性的FokⅠ核酸内切酶切割结构域组成。TALEN能够根据用户需要... 类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)是最近发展起来的一类新型的人工核酸内切酶,它由特异性的TALE DNA结合结构域和非特异性的FokⅠ核酸内切酶切割结构域组成。TALEN能够根据用户需要切割特定的核苷酸靶序列,造成DNA双链断裂,从而诱导该靶序列产生indel突变,目前已成功地应用于多个物种或体外培养细胞的基因组定点突变。文章介绍TALEN靶点的选择与确认,采用"单元组装法"构建人工TALEN的原理与步骤,以及通过显微注射TALEN mRNA诱导并筛选斑马鱼突变体的实验流程与经验。这些方法理论上也适用于对其他物种进行基因打靶。 展开更多

关键词 类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN) 斑马鱼 基因组定点突变 基因打靶 反向遗传学技术

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A/California/07／2009亚型猪流感冷适应减毒疫苗株的拯救及免疫效果评价 被引量：2

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作者 段跃强 罗德炎 +5 位作者 邢丽 杨鹏辉 赵忠鹏 贾卫红 李培锋 王希良 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2010年第12期1289-1295,共7页

应用反向遗传学技术,选择冷适应、温度敏感、减毒的A/Ann Arbor/6/60 ca(H2N2)型流感病毒的6个内部基因为骨架,与A/California/07/2009株流感病毒2个抗原基因HA、NA分别克隆到polⅠ-polⅡ转录表达载体pAD3000中,构建8个转录表达载体重... 应用反向遗传学技术,选择冷适应、温度敏感、减毒的A/Ann Arbor/6/60 ca(H2N2)型流感病毒的6个内部基因为骨架,与A/California/07/2009株流感病毒2个抗原基因HA、NA分别克隆到polⅠ-polⅡ转录表达载体pAD3000中,构建8个转录表达载体重组质粒,共转染Vero细胞,获得重配A/California/07/2009ca株流感病毒.重配病毒的TCID50为7.5,病毒传4代后其血凝素(HA)滴度稳定在1∶256,半数感染剂量EID50为8,鸡胚传20代,经RT-PCR鉴定未发现重组病毒基因突变,电镜观察重配病毒符合流感病毒的主要特征;蔗糖纯化的病毒经肌肉注射(灭活)及滴鼻(减毒活病毒)两种途径免疫BALB/c小鼠,结果显示:滴鼻免疫和肌肉注射都可以产生较高效价的血凝抑制(HI)抗体,肌肉注射组产生的HI抗体略高(P=0.044),但肌肉注射组检测不到高效价IgA抗体;滴鼻免疫组鼻冲洗液中可以检测到高效价的IgA抗体,同型病毒感染后,IL-1β、TNFα、IFN-α等前炎因子分泌较早,且高于肌肉注射组(P<0.05),可见,喷鼻减毒疫苗比灭活全病毒疫苗能更好地激发黏膜免疫反应.通过对小鼠各个器官病毒载量的检测发现,4天后鼻腔、气管、脑、肺、脾脏没有病毒存在,证明减毒活疫苗株在小鼠上是安全的.以上数据可以初步断定,重组病毒有作疫苗候选株的可能,而且喷鼻疫苗具有降低免疫剂量、同时激活体内体液免疫和细胞免疫的功能. 展开更多

关键词 反向遗传学技术 A/California/07/2009亚型猪流感 8质粒拯救系统

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新城疫病毒载体疫苗研究进展

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作者 张国丽 徐少珠 +3 位作者 邝贞结 潘成稚 肖杰 齐冬梅 《广东畜牧兽医科技》 2023年第2期18-23,共6页

新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)作为载体已成功地应用于多种人类和动物疫病疫苗的研发中。大量研究表明,重组新城疫病毒(Recombinant NDV,rNDV)载体疫苗相较于传统疫苗无论在体液免疫、黏膜免疫,还是攻毒保护等方面均有较好... 新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)作为载体已成功地应用于多种人类和动物疫病疫苗的研发中。大量研究表明,重组新城疫病毒(Recombinant NDV,rNDV)载体疫苗相较于传统疫苗无论在体液免疫、黏膜免疫,还是攻毒保护等方面均有较好的表现。NDV载体已成为研制安全、高效、低毒、免疫原性更佳的载体疫苗的重要工具。该文综述了利用NDV作为疫苗载体的反向遗传学技术在家禽、哺乳动物和人用新型疫苗研制方面的进展,以期为更好地利用NDV载体研制更多的疫苗提供新的思路。 展开更多

关键词 反向遗传学技术 新城疫病毒载体 疫苗

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