通过测定脑缺血再灌注时海马中半胱天冬酶-3酶原(procaspase-3)的表达变化,从细胞凋亡的角度探讨脑缺血再灌注损伤的分子生物学机制及procaspase-3的活化机制.将C57BL/6N小鼠随机分为假手术组(正常对照组)、缺血再灌注组(I/R组),后者夹...通过测定脑缺血再灌注时海马中半胱天冬酶-3酶原(procaspase-3)的表达变化,从细胞凋亡的角度探讨脑缺血再灌注损伤的分子生物学机制及procaspase-3的活化机制.将C57BL/6N小鼠随机分为假手术组(正常对照组)、缺血再灌注组(I/R组),后者夹闭双侧颈总动脉20 min后再通血流,建立前脑缺血再灌注模型,分别于再灌注6 h、12 h、24 h和48 h取海马.采用蛋白免疫印迹(Western blotting)方法检测海马中procaspase-3的表达变化.结果显示,12 h I/R及24 h I/R组海马中总procaspase-3水平与假手术组相比有明显升高,且差异有统计学意义(P<0.05);24 h I/R组海马中去磷酸化水平与假手术组相比有明显升高,且差异有统计学意义(P<0.05);而各组procaspase-3磷酸化水平与假手术组相比差异无统计学意义.结果提示,脑缺血再灌注损伤诱发procaspase-3表达增加;其中procaspase-3去磷酸化水平高明显,提示脑缺血再灌注损伤可能诱发procaspase-3去磷酸化,继而促进procaspase-3转化为活性形式.展开更多
目的可致肿瘤细胞死亡的人α乳清蛋白(human alpha-lactalbumin made lethal to tumor cells,HAMLET)是一种可导致多种癌细胞死亡的强效选择性肿瘤杀伤蛋白质-脂酸复合物。为了使HAMLET应用于肿瘤的治疗并对其杀伤机制进行探讨,我们需...目的可致肿瘤细胞死亡的人α乳清蛋白(human alpha-lactalbumin made lethal to tumor cells,HAMLET)是一种可导致多种癌细胞死亡的强效选择性肿瘤杀伤蛋白质-脂酸复合物。为了使HAMLET应用于肿瘤的治疗并对其杀伤机制进行探讨,我们需要建立和优化简便、快速、规模化制备与纯化HAMLET的方法。方法通过构建人α乳清蛋白分泌型细胞MCF-7的cDNA文库,PCR扩增出编码人α乳清蛋白成熟肽段的全长序列,然后克隆入pET30a(+)表达载体质粒,并转化BL21(DE3)宿主大肠杆菌。经过IPTG诱导,表达细菌的裂解,蛋白体外复性,Ni-NTA亲和层析柱纯化等步骤,获得了高纯度的重组人α乳清蛋白的C端His标签融合蛋白。纯化蛋白经EDTA脱钙后,与油酸(oleic acid,OA)在加热条件下制备HAMLET复合物。同时,对HAMLET的理化特性和生物学活性进行检测。结果通过与经典方法制备的牛α乳清蛋白和OA复合物(BAMLET)进行比较,发现我们制备的HAMLET在紫外吸收光谱、疏水性质特征及肿瘤杀伤活力方面与BAMLET活性相符,并且可引起HeLa肿瘤细胞的凋亡样程序性死亡。结论本研究自主制备的HAMLET成本经济、方法简便且具有较好的规模化放大前景,为日后临床应用奠定基础。展开更多
文摘通过测定脑缺血再灌注时海马中半胱天冬酶-3酶原(procaspase-3)的表达变化,从细胞凋亡的角度探讨脑缺血再灌注损伤的分子生物学机制及procaspase-3的活化机制.将C57BL/6N小鼠随机分为假手术组(正常对照组)、缺血再灌注组(I/R组),后者夹闭双侧颈总动脉20 min后再通血流,建立前脑缺血再灌注模型,分别于再灌注6 h、12 h、24 h和48 h取海马.采用蛋白免疫印迹(Western blotting)方法检测海马中procaspase-3的表达变化.结果显示,12 h I/R及24 h I/R组海马中总procaspase-3水平与假手术组相比有明显升高,且差异有统计学意义(P<0.05);24 h I/R组海马中去磷酸化水平与假手术组相比有明显升高,且差异有统计学意义(P<0.05);而各组procaspase-3磷酸化水平与假手术组相比差异无统计学意义.结果提示,脑缺血再灌注损伤诱发procaspase-3表达增加;其中procaspase-3去磷酸化水平高明显,提示脑缺血再灌注损伤可能诱发procaspase-3去磷酸化,继而促进procaspase-3转化为活性形式.
文摘目的可致肿瘤细胞死亡的人α乳清蛋白(human alpha-lactalbumin made lethal to tumor cells,HAMLET)是一种可导致多种癌细胞死亡的强效选择性肿瘤杀伤蛋白质-脂酸复合物。为了使HAMLET应用于肿瘤的治疗并对其杀伤机制进行探讨,我们需要建立和优化简便、快速、规模化制备与纯化HAMLET的方法。方法通过构建人α乳清蛋白分泌型细胞MCF-7的cDNA文库,PCR扩增出编码人α乳清蛋白成熟肽段的全长序列,然后克隆入pET30a(+)表达载体质粒,并转化BL21(DE3)宿主大肠杆菌。经过IPTG诱导,表达细菌的裂解,蛋白体外复性,Ni-NTA亲和层析柱纯化等步骤,获得了高纯度的重组人α乳清蛋白的C端His标签融合蛋白。纯化蛋白经EDTA脱钙后,与油酸(oleic acid,OA)在加热条件下制备HAMLET复合物。同时,对HAMLET的理化特性和生物学活性进行检测。结果通过与经典方法制备的牛α乳清蛋白和OA复合物(BAMLET)进行比较,发现我们制备的HAMLET在紫外吸收光谱、疏水性质特征及肿瘤杀伤活力方面与BAMLET活性相符,并且可引起HeLa肿瘤细胞的凋亡样程序性死亡。结论本研究自主制备的HAMLET成本经济、方法简便且具有较好的规模化放大前景,为日后临床应用奠定基础。
