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CBP棕榈酰化位点的突变对皮肤鳞状细胞癌A431细胞生物学行为的影响
被引量：
3
1
作者
高潇
王冰
+2 位作者
姚佳
朱玉贞
王静
《中国癌症杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2018年第12期906-914,共9页
背景与目的:Src羧基末端激酶结合蛋白(Csk-binding protein,CBP)是新近发现的通过棕榈酰化位点锚定脂筏,参与多种肿瘤的发生、发展过程的抑制性跨膜接头蛋白。本研究旨在观察棕榈酰化位点异常的CBP对皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖及凋亡...
背景与目的:Src羧基末端激酶结合蛋白(Csk-binding protein,CBP)是新近发现的通过棕榈酰化位点锚定脂筏,参与多种肿瘤的发生、发展过程的抑制性跨膜接头蛋白。本研究旨在观察棕榈酰化位点异常的CBP对皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖及凋亡的影响,并探讨其相关的分子机制。方法:构建CBP-增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)融合蛋白的慢病毒表达载体,采用反转录病毒转染的方法建立CBP棕榈酰化位点突变的A431细胞系以及CBP过表达的A431细胞系,实验分为4组:空白对照组(Parental组,未进行基因转染的A431细胞)、阴性对照组(Control,A431细胞转染仅含EGFP阴性对照病毒载体)、阳性(过表达)对照组(WT-CBP,A431细胞转染WT PAG1-EGFP病毒载体)、实验组(Mutant-CBP,A431细胞转染棕榈酰化位点突变的CBP-EGFP病毒载体)。采用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测转染率,并用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)和蛋白质印迹法(Westernblot)检测转染后细胞中CBP mRNA表达和蛋白水平,验证转染是否成功。采用流式细胞术检测CBP棕榈酰化位点突变对细胞凋亡的影响;细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)细胞增殖实验、划痕、transwell迁移及侵袭实验检测CBP棕榈酰化位点突变对A431细胞生长、迁移和侵袭能力的影响;用Western blot检测Csk和Fyn两种下游信号转导分子蛋白水平的变化。结果:建立了稳定的CBP棕榈酰化位点突变A431细胞系和CBP过表达A431细胞系。采用流式细胞术检测细胞凋亡情况,结果显示,与Control组和Parental组比较WT-CBP组A431细胞的凋亡明显增多,差异有统计学意义(P<0.001);但Mutant-CBP组A431细胞的凋亡与WT-CBP组相比明显减少,与Control组和Parental组比较差异无统计学意义(P>0.05)。划痕实验结果表明,与Control组和Parental组比较野生型CBP过表达组A431细胞愈合率明显降低(P<0.001),而CBP棕榈酰化位点突变A431细胞愈合率没有明显变化(P>0.05)。Transwell迁移和侵袭实验结果表明,与Control组和Parental组比较野生型CBP过表达组A431细胞的迁移、侵袭能力明显降低(P<0.001),过表达CBP棕榈酰化位点突变A431细胞的迁移和侵袭能力与WT-CBP组相比明显增高,而与Control组和Parental组相比差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot结果表明:WT-CBP组Csk和Fyn蛋白与Parental组和Control组相比表达明显增加(P<0.001),而Mutant-CBP组Csk和Fyn蛋白的相对表达水平与Parental组和Control组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:CBP上调可以抑制A431细胞的增殖,但棕榈酰化位点突变的CBP丧失了发挥抑制细胞增殖的功能。由此可见,棕榈酰化位点突变可影响CBP发挥其抑制细胞增殖的作用。
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关键词
接头蛋白
CBP
增殖
凋亡
皮肤鳞状细胞癌
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职称材料
咪喹莫特(imiquimod)联合树突状细胞降低荷黑素瘤小鼠调节性T细胞并增强抗肿瘤效果
2
作者
任书荣
王秋波
+3 位作者
张艳丽
路翠秀
李平
李玉美
《细胞与分子免疫学杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2017年第2期145-150,共6页
目的观察联合应用Toll样受体7(TLR7)激动剂咪喹莫特(imiquimod)和负载肿瘤相关抗原的树突状细胞(DC)疫苗对荷黑素瘤小鼠的治疗作用并探讨相关机制。方法培养表达卵白蛋白的B16黑素瘤(B16-OVA)细胞,注射入C57BL/6小鼠皮下制备荷瘤小鼠模...
目的观察联合应用Toll样受体7(TLR7)激动剂咪喹莫特(imiquimod)和负载肿瘤相关抗原的树突状细胞(DC)疫苗对荷黑素瘤小鼠的治疗作用并探讨相关机制。方法培养表达卵白蛋白的B16黑素瘤(B16-OVA)细胞,注射入C57BL/6小鼠皮下制备荷瘤小鼠模型。含重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rm GM-CSF)和重组小鼠白细胞介素4(rm IL-4)的培养液扩增培养骨髓来源的DC,加入OVA过夜孵育制备负载OVA的DC疫苗(OVA-DC)。荷瘤小鼠分别采用PBS、咪喹莫特局部涂抹、OVA-DC皮内注射、咪喹莫特联合OVA-DC进行治疗,数字游标卡尺测量小鼠皮下肿瘤的生长情况。流式细胞术检测荷瘤小鼠外周血CD4^+FOXP3^+调节性T细胞(Treg)的比例。采用上述方案免疫小鼠后,用CCK-8法检测小鼠脾脏淋巴细胞对B16-OVA细胞的杀伤效应。结果与单纯咪喹莫特、OVA-DC治疗组及PBS对照组相比,咪喹莫特联合OVA-DC治疗组荷瘤小鼠黑素瘤体积较小,荷瘤小鼠CD4^+细胞中FOXP3^+Treg比例明显降低。咪喹莫特联合OVA-DC免疫小鼠脾脏淋巴细胞杀伤B16-OVA肿瘤细胞能力较其他组明显增强。结论咪喹莫特联合负载抗原的DC疫苗可诱导荷瘤机体CD4^+FOXP3^+Treg比例降低并增强抗肿瘤效果。
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关键词
Toll样受体7(TLR7)
咪喹莫特(imiquimod)
树突状细胞
肿瘤免疫治疗
调节性T细胞
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职称材料
题名
CBP棕榈酰化位点的突变对皮肤鳞状细胞癌A431细胞生物学行为的影响
被引量：
3
1
作者
高潇
王冰
姚佳
朱玉贞
王静
机构
青岛大学医学部基础医学院免疫学系
出处
《中国癌症杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2018年第12期906-914,共9页
基金
青岛市科技计划基础研究项目(KJZD-13-3-2-JCH)
文摘
背景与目的:Src羧基末端激酶结合蛋白(Csk-binding protein,CBP)是新近发现的通过棕榈酰化位点锚定脂筏,参与多种肿瘤的发生、发展过程的抑制性跨膜接头蛋白。本研究旨在观察棕榈酰化位点异常的CBP对皮肤鳞状细胞癌A431细胞增殖及凋亡的影响,并探讨其相关的分子机制。方法:构建CBP-增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)融合蛋白的慢病毒表达载体,采用反转录病毒转染的方法建立CBP棕榈酰化位点突变的A431细胞系以及CBP过表达的A431细胞系,实验分为4组:空白对照组(Parental组,未进行基因转染的A431细胞)、阴性对照组(Control,A431细胞转染仅含EGFP阴性对照病毒载体)、阳性(过表达)对照组(WT-CBP,A431细胞转染WT PAG1-EGFP病毒载体)、实验组(Mutant-CBP,A431细胞转染棕榈酰化位点突变的CBP-EGFP病毒载体)。采用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测转染率,并用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)和蛋白质印迹法(Westernblot)检测转染后细胞中CBP mRNA表达和蛋白水平,验证转染是否成功。采用流式细胞术检测CBP棕榈酰化位点突变对细胞凋亡的影响;细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)细胞增殖实验、划痕、transwell迁移及侵袭实验检测CBP棕榈酰化位点突变对A431细胞生长、迁移和侵袭能力的影响;用Western blot检测Csk和Fyn两种下游信号转导分子蛋白水平的变化。结果:建立了稳定的CBP棕榈酰化位点突变A431细胞系和CBP过表达A431细胞系。采用流式细胞术检测细胞凋亡情况,结果显示,与Control组和Parental组比较WT-CBP组A431细胞的凋亡明显增多,差异有统计学意义(P<0.001);但Mutant-CBP组A431细胞的凋亡与WT-CBP组相比明显减少,与Control组和Parental组比较差异无统计学意义(P>0.05)。划痕实验结果表明,与Control组和Parental组比较野生型CBP过表达组A431细胞愈合率明显降低(P<0.001),而CBP棕榈酰化位点突变A431细胞愈合率没有明显变化(P>0.05)。Transwell迁移和侵袭实验结果表明,与Control组和Parental组比较野生型CBP过表达组A431细胞的迁移、侵袭能力明显降低(P<0.001),过表达CBP棕榈酰化位点突变A431细胞的迁移和侵袭能力与WT-CBP组相比明显增高,而与Control组和Parental组相比差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot结果表明:WT-CBP组Csk和Fyn蛋白与Parental组和Control组相比表达明显增加(P<0.001),而Mutant-CBP组Csk和Fyn蛋白的相对表达水平与Parental组和Control组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:CBP上调可以抑制A431细胞的增殖,但棕榈酰化位点突变的CBP丧失了发挥抑制细胞增殖的功能。由此可见,棕榈酰化位点突变可影响CBP发挥其抑制细胞增殖的作用。
关键词
接头蛋白
CBP
增殖
凋亡
皮肤鳞状细胞癌
Keywords
Adapter protein
Csk-binding protein
Proliferation
Apoptosis
Cutaneous squamous cell carcinoma
分类号
R739.5 [医药卫生—肿瘤]
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职称材料
题名
咪喹莫特(imiquimod)联合树突状细胞降低荷黑素瘤小鼠调节性T细胞并增强抗肿瘤效果
2
作者
任书荣
王秋波
张艳丽
路翠秀
李平
李玉美
机构
青岛大学医学部基础医学院免疫学系
出处
《细胞与分子免疫学杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2017年第2期145-150,共6页
基金
山东省自然科学基金(ZR2014HM025)
山东省医药卫生科技发展计划项目(2014WS0445)
青岛大学大学生创新创业训练项目
文摘
目的观察联合应用Toll样受体7(TLR7)激动剂咪喹莫特(imiquimod)和负载肿瘤相关抗原的树突状细胞(DC)疫苗对荷黑素瘤小鼠的治疗作用并探讨相关机制。方法培养表达卵白蛋白的B16黑素瘤(B16-OVA)细胞,注射入C57BL/6小鼠皮下制备荷瘤小鼠模型。含重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rm GM-CSF)和重组小鼠白细胞介素4(rm IL-4)的培养液扩增培养骨髓来源的DC,加入OVA过夜孵育制备负载OVA的DC疫苗(OVA-DC)。荷瘤小鼠分别采用PBS、咪喹莫特局部涂抹、OVA-DC皮内注射、咪喹莫特联合OVA-DC进行治疗,数字游标卡尺测量小鼠皮下肿瘤的生长情况。流式细胞术检测荷瘤小鼠外周血CD4^+FOXP3^+调节性T细胞(Treg)的比例。采用上述方案免疫小鼠后,用CCK-8法检测小鼠脾脏淋巴细胞对B16-OVA细胞的杀伤效应。结果与单纯咪喹莫特、OVA-DC治疗组及PBS对照组相比,咪喹莫特联合OVA-DC治疗组荷瘤小鼠黑素瘤体积较小,荷瘤小鼠CD4^+细胞中FOXP3^+Treg比例明显降低。咪喹莫特联合OVA-DC免疫小鼠脾脏淋巴细胞杀伤B16-OVA肿瘤细胞能力较其他组明显增强。结论咪喹莫特联合负载抗原的DC疫苗可诱导荷瘤机体CD4^+FOXP3^+Treg比例降低并增强抗肿瘤效果。
关键词
Toll样受体7(TLR7)
咪喹莫特(imiquimod)
树突状细胞
肿瘤免疫治疗
调节性T细胞
Keywords
TLR7
imiquimod
dendritic cell
tumor immunotherapy
regulatory T cells（Tregs）
分类号
R392.12 [医药卫生—免疫学]
R739.5 [医药卫生—肿瘤]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
CBP棕榈酰化位点的突变对皮肤鳞状细胞癌A431细胞生物学行为的影响
高潇
王冰
姚佳
朱玉贞
王静
《中国癌症杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2018
3
在线阅读
下载PDF
职称材料
2
咪喹莫特(imiquimod)联合树突状细胞降低荷黑素瘤小鼠调节性T细胞并增强抗肿瘤效果
任书荣
王秋波
张艳丽
路翠秀
李平
李玉美
《细胞与分子免疫学杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2017
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