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Rb荧光素酶报告基因检测系统构建及检测能力评估 被引量：3
1
作者 王博 杨泽健 +6 位作者 张妙 田碧霞 宋少苒 孙伟 高小倩 周灿 刘培军 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期463-467,共5页
目的构建Rb荧光素酶报告基因检测系统并检测Rb基因的活化和抑制水平,为多种肿瘤的靶向治疗药物筛选提供实验基础。方法通过双酶切将人工合成的Rb反应原件基因序列连接到报告基因载体pGL6-TA的多克隆位点区,并转化E.coli DH5α感受态细... 目的构建Rb荧光素酶报告基因检测系统并检测Rb基因的活化和抑制水平,为多种肿瘤的靶向治疗药物筛选提供实验基础。方法通过双酶切将人工合成的Rb反应原件基因序列连接到报告基因载体pGL6-TA的多克隆位点区,并转化E.coli DH5α感受态细胞构建载体pGL6-Rb-Luc。将基因测序序列正确的pGL6-Rb-Luc质粒和对照pGL6-TA质粒分别转染人肾上皮细胞系HEK293,通过抗性基因筛选,可获得稳定表达Rb荧光素酶报告基因的HEK293-Rb-Luc单克隆细胞株和对照细胞株,再分别通过血清刺激和CDK4/6抑制剂Palbociclib来检测报告基因检测系统HEK293-Rb-Luc的激活作用以及抑制作用。结果分析载体的测序结果并进行比对,确定构建的载体pGL6-Rb-Luc中Rb反应元件基因序列已正确插入载体多克隆位点区。HEK293-Rb-Luc细胞株经无血清培养同步后,恢复血清培养6、12、24 h细胞中荧光素酶的活性均显著升高(P<0.001),对照细胞未发生显著变化。相比于0 nmol/L Palbociclib组,25、50、75、100 nmol/L的CDK4/6抑制剂Palbociclib使Rb活性的抑制率分别达6.90%、40.23%、50.57%、52.07%(P<0.05)。结论已成功构建并筛选出Rb荧光素酶报告基因检测系统HEK293-Rb-Luc且能够有效地检测Rb的活化水平。 展开更多
关键词 报告基因 荧光素酶 RB 活性检测
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重组人细胞角蛋白9 cDNA的原核表达及纯化
2
作者 王博 周艳 +5 位作者 侯卫坤 蔡永松 张英 王林玉 韩燕 孟列素 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2017年第4期502-506,共5页
目的克隆人细胞角蛋白CK9的cDNA,通过原核表达系统表达融合蛋白并进行纯化和鉴定。方法从人角质形成细胞系(HaCaT)中提取RNA,以RT-PCR反转录cDNA,使用特异性引物PCR扩增出人CK9编码区全长并克隆到pET-28a载体上,再用IPTG诱导融合蛋白his... 目的克隆人细胞角蛋白CK9的cDNA,通过原核表达系统表达融合蛋白并进行纯化和鉴定。方法从人角质形成细胞系(HaCaT)中提取RNA,以RT-PCR反转录cDNA,使用特异性引物PCR扩增出人CK9编码区全长并克隆到pET-28a载体上,再用IPTG诱导融合蛋白his-CK9的表达。表达的融合蛋白通过Ni 2+亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果测序鉴定构建表达载体中CK9的cDNA序列正确;融合蛋白his-CK9可在大肠杆菌中诱导表达;纯化的融合蛋白his-CK9纯度较高;纯化的融合蛋白his-CK9可与商品化CK9抗体特异性结合。结论成功构建原核表达载体pET-28a-CK9,并成功诱导及纯化融合蛋白his-CK9。 展开更多
关键词 原核表达系统 细胞角蛋白9 融合蛋白 细胞骨架
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人KIBRA基因真核表达载体的构建及生物信息学分析
3
作者 王博 宋少苒 +6 位作者 田碧霞 杨泽健 张妙 高小倩 孙伟 蒋依娜 刘培军 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2021年第2期323-327,332,共6页
目的构建人的肾脏脑蛋白(human kidney and brain protein, KIBRA)编码区全长的真核表达载体,为在乳腺癌细胞水平研究KIBRA生物学功能提供模型。方法提取人乳腺癌细胞系MCF7总RNA,反转录后再通过PCR扩增KIBRA(NM001161661.2)编码区全长... 目的构建人的肾脏脑蛋白(human kidney and brain protein, KIBRA)编码区全长的真核表达载体,为在乳腺癌细胞水平研究KIBRA生物学功能提供模型。方法提取人乳腺癌细胞系MCF7总RNA,反转录后再通过PCR扩增KIBRA(NM001161661.2)编码区全长,并克隆至真核表达载体pCMV-Blank上,鉴定正确后命名为pCMV-KIBRA。将其转染MCF7细胞,48 h后实时定量PCR和Western blotting检测KIBRA的表达。结合生物信息学软件分析KIBRA的一级、二级、三级结构和转录后修饰位点。结果菌液PCR、双酶切和测序结果均表明载体pCMV-KIBRA中插入的KIBRA序列正确。载体转染MCF7细胞可使KIBRA的mRNA和蛋白水平显著增高。生物信息学分析KIBRA由1 119个氨基酸组成,存在52个磷酸化位点、1个乙酰化位点和5个泛素化位点,且二级结构主要为α-螺旋和无规则卷曲。结论成功构建人KIBRA编码区全长的真核表达载体,并在乳腺癌细胞系MCF7中过表达,为在乳腺癌中研究KIBRA的生物学功能奠定了基础。 展开更多
关键词 KIBRA 真核表达 基因克隆
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人参皂苷20(S)-Rg3通过抑制DNMT3A介导的启动子甲基化促进卵巢癌细胞中抑癌基因VHL的表达 被引量：6
4
作者 王莉洁 韩曦 +5 位作者 郑霞 周园园 侯惠莲 陈葳 李旭 赵乐 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期100-106,共7页
目的明确人参皂苷20(S)-Rg3促进卵巢癌细胞抑癌基因von Hippel-Lindau(VHL)表达的机制。方法Real-time PCR和Western blotting检测20(S)-Rg3处理前后卵巢癌细胞SKOV3中的VHL、DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的mRNA和蛋白水平。Real... 目的明确人参皂苷20(S)-Rg3促进卵巢癌细胞抑癌基因von Hippel-Lindau(VHL)表达的机制。方法Real-time PCR和Western blotting检测20(S)-Rg3处理前后卵巢癌细胞SKOV3中的VHL、DNA甲基转移酶DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的mRNA和蛋白水平。Real-time PCR检测甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理卵巢癌细胞SKOV3前后VHL的mRNA水平变化。甲基化特异性PCR(MSP)检测20(S)-Rg3单纯处理组和20(S)-Rg3处理且过表达DNMT3A组的VHL基因启动子区的甲基化水平,并检测VHL的mRNA和蛋白表达水平。免疫组化检测课题组前期获得的20(S)-Rg3处理组及对照组的裸鼠皮下移植瘤组织中VHL和DNMT3A的蛋白表达。结果20(S)-Rg3处理后,卵巢癌细胞SKOV3中VHL的mRNA水平升高到阴性对照细胞的2倍以上,蛋白水平亦上调(P<0.05);DNMT3A的mRNA水平和蛋白水平均下降(P<0.05),DNMT3B的mRNA水平略有升高但蛋白水平无明显变化(P>0.05),DNMT1的mRNA和蛋白水平均无变化(P>0.05)。2μmol/L和5μmol/L的5-Aza-CdR处理后,SKOV3细胞的VHL mRNA水平升高到阴性对照细胞的3倍以上(P<0.05)。20(S)-Rg3使VHL基因启动子区的甲基化水平降低(P<0.05),在20(S)-Rg3处理的同时过表达DNMT3A,则VHL基因启动子甲基化水平再次升高,同时VHLmRNA和蛋白水平均降低(P<0.05)。免疫组织显示,相对于对照组,20(S)-Rg处理组的裸鼠皮下移植瘤组织中VHL的表达上调、DNMT3A的表达下调。结论20(S)-Rg3通过抑制DNMT3A介导的启动子甲基化而促进卵巢癌细胞中VHL的表达。 展开更多
关键词 卵巢癌 人参皂苷 VHL 甲基化
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微小RNA-145对卵巢癌细胞迁移和侵袭的影响 被引量：5
5
作者 李洁 周园园 +1 位作者 赵乐 李旭 《中国医学科学院学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第5期581-588,共8页
目的评估微小RNA-145(miR-145)对卵巢癌细胞迁移和侵袭的影响。方法选取上皮性卵巢癌细胞株SKOV3及3AO,过表达miR-145后,qRT-PCR检测转染前后细胞株miR-145的表达,Transwell小室实验检测转染前后细胞迁移及侵袭能力。采用生物信息学方... 目的评估微小RNA-145(miR-145)对卵巢癌细胞迁移和侵袭的影响。方法选取上皮性卵巢癌细胞株SKOV3及3AO,过表达miR-145后,qRT-PCR检测转染前后细胞株miR-145的表达,Transwell小室实验检测转染前后细胞迁移及侵袭能力。采用生物信息学方法特异预测出miR-145靶基因zeb-2后,通过双荧光素酶报告实验进行验证,再敲低zeb-2后检测细胞移动能力。结果过表达miR-145后,SKOV3(t=10.752,P=0.000;t=5.617,P=0.005)及3AO细胞(t=10.111,P=0.001;t=21.746,P=0.000)的迁移及增殖能力均明显下降。双荧光素酶报告实验结果显示,共转染miR-145 mimic和WT 3’UTR表达载体细胞的相对荧光素酶活性明显低于共转染mimic control和WT 3’UTR表达载体的细胞(SKOV3:t=4.572,P=0.010;3AO:t=3.528,P=0.024),共转染miR-145mimic和MUT 3’UTR表达载体细胞的相对荧光素酶活性与共转染mimic control和MUT 3’UTR表达载体细胞差异无统计学意义(SKOV3:t=0.227,P=0.831;3AO:t=0.040,P=0.970)。过表达miR-145 48 h后,实时定量PCR检测结果显示,与阴性对照相比,SKOV3(t=1.490,P=0.211)和3AO细胞(t=0.114,P=0.914)中zeb-2 mRNA表达差异无统计学意义。过表达miR-145 72 h后,Western blot检测结果显示,与阴性对照相比,SKOV3(t=3.769,P=0.020)及3AO细胞(t=4.452,P=0.011)中zeb-2蛋白的表达水平明显下降。转染zeb-2 siRNA 72 h后,Western blot检测结果显示,SKOV3(t=4.660,P=0.010)和3AO细胞(t=4.594,P=0.010)中的zeb-2蛋白表达水平明显下调;Transwell小室实验检测结果显示,SKOV3(t=18.655,P=0.000;t=18.026,P=0.000)及3AO(t=5.500,P=0.005;t=8.780,P=0.001)细胞的迁移和侵袭能力明显下降。结论miR-145可能是通过靶向抑制zeb-2来抑制卵巢癌细胞迁移和侵袭能力。 展开更多
关键词 卵巢癌 迁移 侵袭 MIR-145 zeb-2
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野生型p27和核定位信号缺失型p27真核表达载体的构建及表达
6
作者 焦鑫艳 张英 +6 位作者 盛秋 张妙 杨泽健 高小倩 赵谦 王博 刘培军 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2022年第4期516-521,共6页
目的构建人野生型p27(p27WT)和核定位信号缺失型p27(p27△NLS)的真核表达载体,并在HEK293T细胞中进行表达,为细胞中p27核浆定位的变化及其不同的生物学功能研究提供细胞基础。方法提取人乳腺癌细胞系MCF7总RNA,反转录cDNA后,分别进行p2... 目的构建人野生型p27(p27WT)和核定位信号缺失型p27(p27△NLS)的真核表达载体,并在HEK293T细胞中进行表达,为细胞中p27核浆定位的变化及其不同的生物学功能研究提供细胞基础。方法提取人乳腺癌细胞系MCF7总RNA,反转录cDNA后,分别进行p27全长和非NLS区片段的PCR扩增,获得p27WT全长(CDKN1B,NM_004064.5)和p27△NLS编码区序列,分别将其克隆至真核表达载体pCMV-Blank,经菌液PCR、双酶切和测序鉴定。电穿孔法转染HEK293T细胞,48 h时分别提取胞核蛋白和胞质蛋白,Western blotting检测p27在细胞质和细胞核中的蛋白表达。结果测序结果显示,真核表达载体pCMV-Blank中插入的p27WT序列和p27△NLS序列均与NM_004064.5序列相一致。pCMV-p27WT转染HEK293T细胞后,细胞总p27蛋白表达显著增加,核浆分离检测发现其在细胞质和细胞核中均表达;而pCMV-p27△NLS转染HEK293T细胞的总p27蛋白表达也显著增加,核浆分离检测发现其主要在细胞质中表达。结论成功构建人p27WT和p27△NLS的真核表达载体,并在HEK293T细胞中成功表达,为p27蛋白在肿瘤细胞周期中的功能研究提供了细胞基础。 展开更多
关键词 P27 CDKN1B 核定位信号序列 真核表达
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转移性儿童甲状腺癌的遗传学特征和预后 被引量：1
7
作者 曲以平 侯鹏 《中国癌症杂志》 CAS CSCD 北大核心 2022年第5期373-379,共7页
甲状腺癌的发病率随着年龄的增长而增加,虽然儿童甲状腺癌的发病率远低于成人,但在世界范围内甲状腺癌已经成为0~14岁儿童第5大常见癌症以及青少年最常见的癌症。不同于成人患者,目前普遍认为儿童甲状腺癌发病率的增加更有可能是基因或... 甲状腺癌的发病率随着年龄的增长而增加,虽然儿童甲状腺癌的发病率远低于成人,但在世界范围内甲状腺癌已经成为0~14岁儿童第5大常见癌症以及青少年最常见的癌症。不同于成人患者,目前普遍认为儿童甲状腺癌发病率的增加更有可能是基因或环境因素所致,并且儿童甲状腺癌在发病时往往更趋近于晚期,其复发率也远高于成人甲状腺癌,但是儿童甲状腺癌的分子病理学特征与肿瘤转移的关系仍有待进一步明确。本文将结合国内外研究进行综述,重点讨论转移性儿童甲状腺癌的遗传学特征,为研究者和临床医师针对儿童甲状腺癌的基础研究和肿瘤防治提供参考。 展开更多
关键词 儿童甲状腺癌 肿瘤转移 分子病理 预后
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