构建携带抑癌基因PTEN(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)的重组腺病毒表达载体,为研究PTEN的功能和作用机制奠定基础。采用RT-PCR法从大鼠海马神经元扩增目的基因PTEN,克隆人含绿色荧光蛋白(Green fluorescen...构建携带抑癌基因PTEN(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)的重组腺病毒表达载体,为研究PTEN的功能和作用机制奠定基础。采用RT-PCR法从大鼠海马神经元扩增目的基因PTEN,克隆人含绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein),GFP基因的pAdTrack-CMV穿梭质粒,在含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183大肠杆菌内进行同源重组;获得重组腺病毒质粒,经PacI线性化后,转染AD293细胞。结果表明,感染腺病毒载体的AD293细胞表达GFP基因,随着时间逐渐增强,并且出现明显的细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE),经PCR对传代的Ad-PTEN分析证实得到目的基因。成功构建了携带PTEN基因的腺病毒表达载体,为研究PTEN的功能和作用机制奠定了基础。展开更多
目的:构建Hsp90α(Heat shock protein 90 alpha)siRN(A Small interfencing RNA)表达载体,为后续的功能研究提供平台。方法:根据Hsp90α基因cDNA序列,设计有小发夹结构的3条寡核苷酸序列到空载体Psuper EGFP1中,转化TOP10菌株,提取质粒...目的:构建Hsp90α(Heat shock protein 90 alpha)siRN(A Small interfencing RNA)表达载体,为后续的功能研究提供平台。方法:根据Hsp90α基因cDNA序列,设计有小发夹结构的3条寡核苷酸序列到空载体Psuper EGFP1中,转化TOP10菌株,提取质粒,进行酶切鉴定和测序分析。将三条序列和对照序列的质粒分别转染HUK293细胞,提取总RNA,用RT-PCR检测Hsp90αmRNA的量。结果:经酶切鉴定、电泳证明,含作用序列的重组质粒pSuper-Hsp90α1,pSuper-Hsp90α2,及pSu-per-Hsp90α3构建是成功的,重组质粒pSuper-Hsp90α1,pSuper-Hsp90α2测序分析完全正确。用RT-PCR初步证明三条均有干扰效果,pSuper-Hsp90α1最明显。结论:用于Hsp90αRNAi的重组质粒可于体外成功构建,初步确定pSuper-Hsp90α1为最佳作用靶点。展开更多
文摘目的:构建Hsp90α(Heat shock protein 90 alpha)siRN(A Small interfencing RNA)表达载体,为后续的功能研究提供平台。方法:根据Hsp90α基因cDNA序列,设计有小发夹结构的3条寡核苷酸序列到空载体Psuper EGFP1中,转化TOP10菌株,提取质粒,进行酶切鉴定和测序分析。将三条序列和对照序列的质粒分别转染HUK293细胞,提取总RNA,用RT-PCR检测Hsp90αmRNA的量。结果:经酶切鉴定、电泳证明,含作用序列的重组质粒pSuper-Hsp90α1,pSuper-Hsp90α2,及pSu-per-Hsp90α3构建是成功的,重组质粒pSuper-Hsp90α1,pSuper-Hsp90α2测序分析完全正确。用RT-PCR初步证明三条均有干扰效果,pSuper-Hsp90α1最明显。结论:用于Hsp90αRNAi的重组质粒可于体外成功构建,初步确定pSuper-Hsp90α1为最佳作用靶点。
