hTERT启动子调控的HSV-tk基因逆转录病毒载体的构建及SKOV3转染细胞的生物学特性观察 被引量：3

1

作者 郭玉忠 姜国忠 +3 位作者 李克虹 史惠蓉 王建民 薛乐勋 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2004年第4期566-569,共4页

目的 :观察转染有人端粒酶逆转录酶基因 (humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)启动子调控的单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶 (herpessimplexvirusthymidinekinase ,HSV tk)基因的人卵巢癌细胞的部分生物学特性。方法 :构建hTERT启动... 目的 :观察转染有人端粒酶逆转录酶基因 (humantelomerasereversetranscriptase,hTERT)启动子调控的单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶 (herpessimplexvirusthymidinekinase ,HSV tk)基因的人卵巢癌细胞的部分生物学特性。方法 :构建hTERT启动子调控的HSV tk基因重组逆转录病毒载体 ,筛选携带该载体的包装细胞 ,测定包装细胞产生的逆转录病毒滴度 ,并用病毒颗粒感染人卵巢癌SKOV3细胞 (SKOV3/tk细胞 )并经RT PCR方法鉴定。然后倒置显微镜下观察SKOV3/tk细胞形态 ,MTT法研究细胞生长特性 ,并观察转染细胞裸鼠体内的成瘤能力。结果 :包装细胞产生的病毒滴度可达 2× 1 0 3 cfu·ml-1 。SKOV3/tk细胞扩增出 770bp的tk基因片段 ,形态与SKOV3细胞无明显差异 ;倍增时间 72h ,无明显变化 ;裸鼠体内的成瘤能力较SKOV3细胞下降。结论 :hTERT调控的HSV tk基因逆转录病毒载体构建成功 ; 展开更多

关键词 HTERT启动子 HSV-TK基因 卵巢癌细胞 逆转录病毒载体

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转基因微藻作为新型生物反应器的研究进展

2

作者 刘红涛 鲁照明 +3 位作者 侯桂琴 李慎柯 王建民 薛乐勋 《海洋通报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期75-83,共9页

转基因微藻作为生物反应器生产生物活性物质已成为基因工程研究的热点之一。目前以转基因微藻作为生物反应器的技术并不十分成熟,然而许多科研人员及生物医药公司将微藻作为新型生物反应器生产有用的外源蛋白。本文对微藻生物反应器构... 转基因微藻作为生物反应器生产生物活性物质已成为基因工程研究的热点之一。目前以转基因微藻作为生物反应器的技术并不十分成熟,然而许多科研人员及生物医药公司将微藻作为新型生物反应器生产有用的外源蛋白。本文对微藻生物反应器构建中的有效核转化方法的建立、转基因微藻中所用的启动子、筛选标记、稳定表达等问题进行了综述,同时介绍了目前转化成功的以及未来可能转化成功的有潜在应用价值的微藻。 展开更多

关键词 转基因微藻 生物反应器 转化 筛选标记 启动子

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肝细胞癌中差异表达的表达序列标签的生物信息学分析

3

作者 陈香宇 段芳龄 +3 位作者 李建生 朱武凌 韩泽广 薛乐勋 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2004年第2期238-241,共4页

目的:采用生物信息学方法分析、预测在原发性肝细胞癌(HCC)中差异表达的表达序列标签(EST)的结构与功能,指导实验研究。方法:应用Blastn、SequencherTM、ORF Finder和DNASIS等软件分析肝细胞癌中差异表达的EST的全长、开放读码框、电子... 目的:采用生物信息学方法分析、预测在原发性肝细胞癌(HCC)中差异表达的表达序列标签(EST)的结构与功能,指导实验研究。方法:应用Blastn、SequencherTM、ORF Finder和DNASIS等软件分析肝细胞癌中差异表达的EST的全长、开放读码框、电子表达谱、染色体定位和编码蛋白质的功能。结果:获得2条新的cDNA全长序列;2条EST分别定位于2p13～15、3p14;高表达EST主要表达于肿瘤组织,低表达EST主要表达于正常组织;高表达基因编码蛋白质参与细胞信号转导、前mRNA加工和细胞骨架组装,低表达基因编码蛋白质与机体T淋巴细胞介导的免疫反应有关。结论:生物信息学技术有助于高效、快速地克隆、鉴定新基因。 展开更多

关键词 生物信息学 表达序列标签 肝细胞癌

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PSMD7基因在人食管鳞癌组织中的表达及影响癌细胞增殖、凋亡的机制研究 被引量：2

4

作者 张进忠 石科 +2 位作者 郭丹 杨亮 闫秀明 《中国癌症杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第10期740-748,共9页

背景与目的:26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基7(26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 7,PSMD7)作为组成19S蛋白酶体盖子结构的核心成员是否参与肿瘤的发生、发展,以及具体的分子机制尚不清楚。本实验将研究PSMD7基因在人食管鳞癌... 背景与目的:26S蛋白酶体非ATP酶调节亚基7(26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 7,PSMD7)作为组成19S蛋白酶体盖子结构的核心成员是否参与肿瘤的发生、发展,以及具体的分子机制尚不清楚。本实验将研究PSMD7基因在人食管鳞癌组织中的表达,以及对癌细胞增殖及凋亡的影响。方法:采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测食管鳞癌及其癌旁正常组织标本中PSMD7的mRNA及蛋白表达情况。在人食管鳞癌细胞系TE-1中,用慢病毒介导的RNA干扰技术下调PSMD7的表达,观察细胞增殖及凋亡的变化,检测线粒体膜电位的变化、细胞质中Cyt C的表达以及凋亡相关因子的表达。结果:PSMD7基因的mRNA和蛋白在食管鳞癌组织中的表达显著高于癌旁正常组织(P<0.05),PSMD7蛋白的高表达与淋巴结转移阳性呈正相关(P<0.05)。抑制PSMD7蛋白的表达可使细胞的增殖能力降低(P<0.05),并促进细胞的凋亡(P<0.05),同时线粒体膜电位降低,促进Cyt C释放进入细胞质,激活caspase级联反应,说明抑制PSMD7的表达诱导细胞凋亡是通过线粒体信号通路进行的。结论:PSMD7在食管鳞癌中呈高表达,并通过线粒体依赖的方式促进TE-1细胞凋亡。 展开更多

关键词 PSMD7 食管鳞癌 增殖 凋亡 线粒体

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大鼠前脑啡肽原基因逆转录病毒表达载体及产毒细胞系的建立 被引量：7

5

作者 臧卫东 赵青赞 +2 位作者 王天云 柴玉荣 薛乐勋 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2006年第1期122-124,共3页

目的:构建大鼠前脑啡肽原基因(pENK)逆转录病毒载体,获得携带该基因的高滴度产毒细胞系。方法:应用RT-PCR方法获得大鼠pENK基因,HindⅢ、ClaⅠ双酶切后,同相应双酶切的pLNCX2载体大片段连接,构建成pENK基因逆转录病毒载体pLNCX2-pENK。... 目的:构建大鼠前脑啡肽原基因(pENK)逆转录病毒载体,获得携带该基因的高滴度产毒细胞系。方法:应用RT-PCR方法获得大鼠pENK基因,HindⅢ、ClaⅠ双酶切后,同相应双酶切的pLNCX2载体大片段连接,构建成pENK基因逆转录病毒载体pLNCX2-pENK。然后用脂质体法将该载体转染PT67细胞,G418筛选,并进行滴度测定。结果与结论:成功地构建了pLNCX2-pENK载体,获得8×108CFU/L的产毒细胞系。成功建立了携带pENK的高滴度逆转录病毒产毒细胞系。 展开更多

关键词 镇痛 脑啡肽 逆转录病毒载体 包装细胞系

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siRNA阻断NF-κB信号通路对食管鳞癌细胞增殖、耐药的影响 被引量：8

6

作者 田芳 田卫红 +2 位作者 许培荣 刘红涛 薛乐勋 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2007年第1期41-44,共4页

目的:通过RNA干扰(RNAi)阻断食管鳞癌细胞中NF-κB信号通路,研究其与肿瘤细胞增殖、耐药的关系。方法:使用NF-κB p65 siRNA分别转染人食管鳞癌Eca109和EC9706细胞72h,以未转染的Eca109和EC9706细胞为对照,采用Western blot检测p65蛋白... 目的:通过RNA干扰(RNAi)阻断食管鳞癌细胞中NF-κB信号通路,研究其与肿瘤细胞增殖、耐药的关系。方法:使用NF-κB p65 siRNA分别转染人食管鳞癌Eca109和EC9706细胞72h,以未转染的Eca109和EC9706细胞为对照,采用Western blot检测p65蛋白的表达;MTT法检测转染NF-κBp65siRNA24h、48h、72h后Eca109和EC9706细胞的增殖情况及转染同时联合应用不同质量浓度5-Fu(0mg/L,16.35mg/L,32.7mg/L,327mg/L,3270mg/L,6540mg/L)对Eca109和EC9706细胞增殖的影响。结果:①NF-κB亚单位p65在Eca109和EC9706细胞质中高表达,p65siRNA可有效阻断p65蛋白表达。②MTT实验表明,转染组细胞存活率较未转染组明显下降(P<0.05);与化疗药5-Fu联用,转染组和未转染组细胞的增殖活性随着5-Fu浓度的增加有下降趋势,但在同一浓度,转染p65siRNA的细胞与未转染组相比,细胞增殖活性明显下降(P<0.05)。结论:应用RNAi技术可有效干扰p65的表达,抑制食管鳞癌细胞的增殖,增强对化疗药5-Fu的敏感性。因此,可将阻断NF-κB信号通路作为基因治疗的靶点。 展开更多

关键词 食管肿瘤 NF-KAPPAB RNA干扰 SIRNA

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食管鳞癌细胞中NF-κB与IκBα的mRNA、蛋白表达 被引量：7

7

作者 田芳 侯卫红 +4 位作者 许培荣 王建民 陈华艳 薛乐勋 陈奎生 《中国肿瘤临床》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期198-201,共4页

目的:核转录因子NF-kappaB(NF-κB)是一种重要的转录因子,参与调控多种与炎症、抗凋亡、肿瘤形成和转化有关的基因表达。本研究通过检测食管鳞癌细胞中NF-κB与IκBαmRNA、蛋白的表达及NF-κB的DNA结合活性,分析NF-κB在食管鳞癌细胞... 目的:核转录因子NF-kappaB(NF-κB)是一种重要的转录因子,参与调控多种与炎症、抗凋亡、肿瘤形成和转化有关的基因表达。本研究通过检测食管鳞癌细胞中NF-κB与IκBαmRNA、蛋白的表达及NF-κB的DNA结合活性,分析NF-κB在食管鳞癌细胞中的激活状态及其在食管鳞癌细胞的生存及转化中的作用。方法:采用West-ernblotting法检测两株食管鳞癌细胞胞质中NF-κB亚单位p50和p65、阻遏物IκBα及其磷酸化IκBα的蛋白表达,检测细胞核中p50和p65的蛋白表达并采用EMSA法检测其与DNA的结合活性。使用RT-PCR法检测p50、p65、IκBαmRNA的表达。结果:NF-κB的亚单位p50、p65、IκBα及磷酸化IκBα在食管鳞癌细胞质中均表达,p50、p65蛋白在细胞核中也表达并具有较高的DNA结合活性。RT-PCR结果表明,p50、p65、IκBα的mRNA在细胞中也存在过表达。结论:本研究发现NF-κB在两株食管鳞癌细胞系中被激活,基因的过表达及IκBα的磷酸化在维持NF-κB的活化中起着重要的作用。 展开更多

关键词 食管鳞癌 NF—κB IΚBΑ

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EC9706和Eca109细胞中雷帕霉素靶蛋白信号通路激活状态观察 被引量：11

8

作者 侯桂琴 范天黎 +4 位作者 鲁照明 刘兰琦 许培荣 薛乐勋 王建人 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2007年第2期223-225,共3页

目的:观察低分化的食管鳞癌细胞EC9706和高分化的食管鳞癌细胞Eca109中雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号转导通路的激活状态。方法:采用细胞免疫组织化学方法检测EC9706和Eca109细胞中mTOR及其下游靶分子p70S6K的表达和定位,并采用RT-PCR和West... 目的:观察低分化的食管鳞癌细胞EC9706和高分化的食管鳞癌细胞Eca109中雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号转导通路的激活状态。方法:采用细胞免疫组织化学方法检测EC9706和Eca109细胞中mTOR及其下游靶分子p70S6K的表达和定位,并采用RT-PCR和Westernblot方法分别从mRNA及蛋白水平检测此通路的活性。结果:在2种细胞中mTOR均有表达,且在EC9706细胞中的表达水平高于Eca109(P<0.05);EC9706细胞中mTOR下游靶点的磷酸化水平高于Eca109细胞(P<0.05)。结论:在2种食管鳞癌细胞中,mTOR信号通路均特异性激活;但激活状态与细胞的分化程度有关,细胞分化程度低者通路的激活水平较高。 展开更多

关键词 食管癌 雷帕霉素靶蛋白 p70S6激酶 EC9706细胞 ECA109细胞

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杜氏盐藻核基质结合区结合蛋白的细胞定位 被引量：2

9

作者 王鹏举 王天云 +2 位作者 冯英才 刘红涛 薛乐勋 《广西植物》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期55-58,共4页

为研究核基质结合区结合蛋白的功能及调控机制,PCR扩增杜氏盐藻MBP的cDNA全长序列及N端和C端序列,与绿色荧光蛋白基因融合构建真核表达载体,脂质体转染CHO细胞,Western blotting和荧光显微镜检测基因表达情况和细胞定位。结果显示:MBP及... 为研究核基质结合区结合蛋白的功能及调控机制,PCR扩增杜氏盐藻MBP的cDNA全长序列及N端和C端序列,与绿色荧光蛋白基因融合构建真核表达载体,脂质体转染CHO细胞,Western blotting和荧光显微镜检测基因表达情况和细胞定位。结果显示:MBP及N端和C端融合蛋白成功在CHO细胞表达,MBP和C端部分定位于细胞核且聚集于核仁,N端部分分布整个细胞,说明MBP定位于细胞核且细胞定位信号位于C端,MBP可能与rRNA前体结合发挥作用。 展开更多

关键词 杜氏盐藻 核基质附着区 核基质结合区结合蛋白 真核表达载体 细胞定位

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HeLa细胞系中核转录因子-κB与Bcl-2的表达 被引量：2

10

作者 田卫红 田芳 +2 位作者 许培荣 刘红涛 薛乐勋 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2009年第1期74-77,共4页

目的:分析宫颈鳞癌HeLa229细胞中核转录因子(NF-κB)的激活状态及其与抗凋亡基因Bcl-2表达的相关性。方法:采用免疫细胞化学法和Western Blot法检测宫颈鳞癌HeLa229细胞中NF-κB亚单位p50和p65及其下游调控基因Bcl-2的蛋白表达,RT-PCR... 目的:分析宫颈鳞癌HeLa229细胞中核转录因子(NF-κB)的激活状态及其与抗凋亡基因Bcl-2表达的相关性。方法:采用免疫细胞化学法和Western Blot法检测宫颈鳞癌HeLa229细胞中NF-κB亚单位p50和p65及其下游调控基因Bcl-2的蛋白表达,RT-PCR法检测宫颈鳞癌HeLa229细胞中p50和p65 mRNA的表达。EMSA法检测HeLa229细胞核中NF-κB与DNA的结合活性。结果:宫颈鳞癌HeLa229细胞质中NF-κB的亚单位p50和p65均有表达,p50/p65在细胞核中具有较高的DNA结合活性。RT-PCR结果表明,p50和p65的mRNA在细胞质中也存在表达,并且在HeLa229细胞中也检测到Bcl-2蛋白的表达。结论:在宫颈鳞癌HeLa229细胞中存在有NF-κB及其下游基因Bcl-2的表达,提示激活的NF-κB信号通路可能在宫颈鳞癌发生发展及抗凋亡中起重要作用。 展开更多

关键词 HeLa229细胞株 核转录因子-ΚB BCL-2

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蛛网膜下腔注入牛嗜铬细胞后大鼠脑脊液活性成分的变化 被引量：1

11

作者 史帅涛 臧卫东 +3 位作者 李鸣 马钊 薛乐勋 杜百廉 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2004年第4期595-597,共3页

目的 :观察接受牛嗜铬细胞 (BCC)移植的大鼠脑脊液中儿茶酚胺及脑啡肽含量的变化。方法 :Sprague Dawley大鼠 80只 ,分为移植组和对照组 ,每组又分为 4个亚组。移植组大鼠蛛网膜下腔注入 2 0 μlBCC悬液 ,含细胞 4× 1 0 7个 ;对照... 目的 :观察接受牛嗜铬细胞 (BCC)移植的大鼠脑脊液中儿茶酚胺及脑啡肽含量的变化。方法 :Sprague Dawley大鼠 80只 ,分为移植组和对照组 ,每组又分为 4个亚组。移植组大鼠蛛网膜下腔注入 2 0 μlBCC悬液 ,含细胞 4× 1 0 7个 ;对照组大鼠注入等量的细胞培养液。各亚组分别在移植后第 2周末、4周末、6周末和 8周末收集脑脊液灌流液 ,检测亮氨酸脑啡肽和儿茶酚胺含量。结果 :移植组亮氨酸脑啡肽和儿茶酚胺含量明显高于对照组(P <0 .0 1 )。 2周组亮氨酸脑啡肽和儿茶酚胺的含量高于 8周组 (P <0 .0 5 )。结论 :注入大鼠脑脊液中的BCC ,能继续分泌亮氨酸脑啡肽和儿茶酚胺等活性物质 。 展开更多

关键词 嗜铬细胞 蛛网膜下腔 移植 儿茶酚胺 脑啡肽 大鼠

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拓扑替康对SKOV3细胞Survivin表达的调控 被引量：1

12

作者 史惠蓉 郭玉忠 +3 位作者 李克虹 陈志敏 荆建红 张钦宪 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2004年第4期558-560,共3页

目的 :观察不同浓度拓扑替康 (TPT)对人卵巢癌细胞系SKOV3中Survivin表达的影响。方法 :采用免疫组化和RT PCR方法 ,检测体外不同浓度TPT(0 .2 4 4 μg/L ,3.90 6 μg/L ,6 2 .5 μg/L ,1mg/L ,1 6mg/L ,1 2 8mg/L)作用于SKOV348h后Surv... 目的 :观察不同浓度拓扑替康 (TPT)对人卵巢癌细胞系SKOV3中Survivin表达的影响。方法 :采用免疫组化和RT PCR方法 ,检测体外不同浓度TPT(0 .2 4 4 μg/L ,3.90 6 μg/L ,6 2 .5 μg/L ,1mg/L ,1 6mg/L ,1 2 8mg/L)作用于SKOV348h后SurvivinmRNA及蛋白的表达。结果 :随TPT浓度的增加 ,SKOV3细胞中SurvivinmRNA及蛋白的表达明显减少 ,呈正性剂量效应关系 (P <0 .0 5 )。结论 :TPT能够抑制卵巢癌细胞SKOV3中SurvivinmRNA和蛋白的表达。 展开更多

关键词 SURVIVIN 拓扑替康 卵巢癌 SKOV3

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五种急性髓细胞白血病细胞株FAM样酪氨酸激酶3表达及其短状串联重复突变检测 被引量：1

13

作者 卢洁 盛光耀 +6 位作者 邹湘 方营旗 徐学聚 赵晓明 白松婷 许培荣 王建人 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2007年第2期282-285,共4页

目的:探讨不同急性髓细胞白血病细胞(AML)FAM样酪氨酸激酶3(FLT3)表达状况,筛选FLT3过表达细胞,并检测其编码FLT3近膜(JM)区的基因是否存在短状串联重复(ITD)突变。方法:选择THP-1、K562、HL-60、Dami、Meg-01细胞,以含内参GAPDH对照的... 目的:探讨不同急性髓细胞白血病细胞(AML)FAM样酪氨酸激酶3(FLT3)表达状况,筛选FLT3过表达细胞,并检测其编码FLT3近膜(JM)区的基因是否存在短状串联重复(ITD)突变。方法:选择THP-1、K562、HL-60、Dami、Meg-01细胞,以含内参GAPDH对照的半定量RT-PCR检测其FLT3mRNA的表达,以流式细胞仪检测细胞膜表面FLT3蛋白的表达;提基因组DNA,PCR扩增其JM区,对有FLT3过表达的细胞,PCR扩增产物连T-载体后测序。结果:5种AML细胞中仅有THP-1、HL-60存在FLT3基因的表达,其mRNA表达相对于GAPDH的含量分别是0.83±0.07、0.48±0.05,2者比较差异有统计学意义(t=7.047,P<0.01);细胞膜表面FLT3蛋白表达率分别是(43.55±4.44)%、(27.57±3.42)%,2者比较差异有统计学意义(t=8.029,P<0.001)。2种细胞经FLT3-JM区PCR产物测序均不存在ITD突变。结论:THP-1、HL-60是FLT3野生型过表达的AML细胞株。 展开更多

关键词 急性髓细胞白血病 FAM样酪氨酸激酶3 基因突变

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拓扑替康和更昔洛韦单独或联合应用对SKOV3/tk细胞生长的影响

14

作者 郭玉忠 史惠蓉 +3 位作者 姜国忠 李克虹 王建民 薛乐勋 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2004年第4期569-571,共3页

目的 :探讨更昔洛韦 (GCV)与拓扑替康 (TPT)单独或联合应用对携带有hTERT启动子调控的HSV tk基因的SKOV3细胞生长的影响。方法 :将hTERT启动子调控的HSV tk基因重组逆转录病毒载体成功转染人卵巢癌SKOV3细胞 (SKOV3/tk细胞 ) ,用MTT法观... 目的 :探讨更昔洛韦 (GCV)与拓扑替康 (TPT)单独或联合应用对携带有hTERT启动子调控的HSV tk基因的SKOV3细胞生长的影响。方法 :将hTERT启动子调控的HSV tk基因重组逆转录病毒载体成功转染人卵巢癌SKOV3细胞 (SKOV3/tk细胞 ) ,用MTT法观察SKOV3/tk细胞对GCV、TPT的敏感性 ;观察合用GCV和TPT对SKOV3/tk细胞的杀伤作用。结果GCV及TPT对SKOV3/tk细胞的最低有效浓度分别为 1 0mg/L和 1 0 μg/L ,1 0 0mg/LGCV与TPT合用时TPT对SKOV3/tk细胞的最低有效浓度为 5 μg/L。 结论 :GCV合用TPT较TPT单用更能抑制携带有HSV 展开更多

关键词 HTERT启动子 HSV-TK基因 卵巢癌细胞 拓扑替康 更昔洛韦

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Tet-on调控TAp63γ基因表达EC9706细胞系的建立及对细胞增殖的影响

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作者 范天黎 侯桂琴 +4 位作者 许培荣 袁保梅 杨静 刘兰琦 杨观瑞 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2007年第2期286-289,共4页

目的:利用Tet-on基因表达调控系统建立由强力霉素(Dox)诱导TAp63γ基因表达的EC9706细胞系,为进一步研究TAp63γ基因的功能奠定基础。方法:将调控质粒pTet-on转入EC9706细胞,经G418筛选后的细胞再次转染反应质粒pTRE-TAp63γ-HA,再用潮... 目的:利用Tet-on基因表达调控系统建立由强力霉素(Dox)诱导TAp63γ基因表达的EC9706细胞系,为进一步研究TAp63γ基因的功能奠定基础。方法:将调控质粒pTet-on转入EC9706细胞,经G418筛选后的细胞再次转染反应质粒pTRE-TAp63γ-HA,再用潮霉素筛选出阳性细胞克隆,RT-PCR法选择对Dox敏感的细胞克隆。最后用不同浓度Dox诱导,Westernblot法确定Dox的最佳诱导浓度。采用此浓度的Dox分别诱导EC9706、EC9706/Tet/pTRE、EC9706/Tet/pTRE-TAp63γ3组细胞,细胞增殖分析试剂盒(CCK-8试剂盒)检测细胞生长抑制率。结果:Dox浓度为3mg/L时可诱导TAp63γ基因高表达,EC9706/Tet/pTRE-TAp63γ细胞的生长抑制率均高于EC9706和EC9706/Tet/pTRE细胞(P<0.05或0.01)。结论:成功构建了Tet-on调控TAp63γ基因表达的EC9706细胞系,为进一步研究食管鳞癌细胞内P63蛋白的生物学行为提供了一个理想的研究平台。TAp63γ基因表达可使EC9706细胞增殖受到抑制。 展开更多

关键词 Tet—on 基因表达系统 TAp63γ基因 食管癌 EC9706细胞

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单纯疱疹病毒胸苷激酶基因真核表达载体的构建及其在食管癌细胞中的表达 被引量：3

16

作者 李杰 郭玉忠 +1 位作者 谢华 薛乐勋 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2004年第1期47-50,共4页

目的 :构建含单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSV -tk)基因的真核表达载体 (pcDNA3-tk) ,并观察能否在食管癌细胞株中表达。方法 :将HSV -tk的cDNA亚克隆于真核表达载体pcDNA3上 ,构建pcDNA3-tk。后者经脂质体介导转染食管癌细胞株Eca - 1 0 9,... 目的 :构建含单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSV -tk)基因的真核表达载体 (pcDNA3-tk) ,并观察能否在食管癌细胞株中表达。方法 :将HSV -tk的cDNA亚克隆于真核表达载体pcDNA3上 ,构建pcDNA3-tk。后者经脂质体介导转染食管癌细胞株Eca - 1 0 9,通过高剂量的G4 1 8选择培养 ,筛选出抗性克隆。经RT -PCR检测确定HSV -tk基因是否能在转染细胞内转录。结果 :成功地构建了真核表达载体pcDNA3-tk ,并且在pcDNA3-tk转染的食管癌细胞内发现tk基因的mRNA。结论 :含HSV 展开更多

关键词 食管肿瘤 基因治疗 TK基因 单纯疱疹病毒胸苷激酶 真核表达载体

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杜氏盐藻叶绿体转化载体pDS16S-CAT的构建 被引量：8

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作者 潘卫东 袁保梅 +4 位作者 谢华 牛向丽 许培荣 薛乐勋 王建民 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2004年第1期25-28,共4页

目的 :利用同源重组方法 ,将外源基因氯霉素乙酰转移酶 (CAT)转入杜氏盐藻叶绿体中。方法 :以杜氏盐藻叶绿体 1 6SrRNA序列为同源片段 ,构建盐藻叶绿体表达载体 ,并利用基因枪法转化盐藻 ,使CAT基因得到表达。结果 :转化后的盐藻可以在... 目的 :利用同源重组方法 ,将外源基因氯霉素乙酰转移酶 (CAT)转入杜氏盐藻叶绿体中。方法 :以杜氏盐藻叶绿体 1 6SrRNA序列为同源片段 ,构建盐藻叶绿体表达载体 ,并利用基因枪法转化盐藻 ,使CAT基因得到表达。结果 :转化后的盐藻可以在含有氯霉素的培养基中生存 3～ 4周 ,表明CAT基因已转入盐藻叶绿体中并表达。结论 :盐藻叶绿体转化是可行的 ,为获得稳定转化的盐藻 。 展开更多

关键词 盐藻 叶绿体 16S RRNA 转化载体

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用基因枪法将bar基因导入杜氏盐藻及转基因藻株的检测 被引量：8

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作者 吕玉民 谢华 +2 位作者 牛向丽 姜国忠 薛乐勋 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2004年第1期31-35,共5页

目的 :探讨基因枪转化方法不同轰击条件和启动子的选择对转化杜氏盐藻的影响。方法 :以抗除草剂(bar)基因作为报告基因 ,用基因枪法将其导入杜氏盐藻。通过草丁膦筛选培养获得转化藻株 ,对转化藻株进行分析。结果 :在氦气压力为 1 0 0L/... 目的 :探讨基因枪转化方法不同轰击条件和启动子的选择对转化杜氏盐藻的影响。方法 :以抗除草剂(bar)基因作为报告基因 ,用基因枪法将其导入杜氏盐藻。通过草丁膦筛选培养获得转化藻株 ,对转化藻株进行分析。结果 :在氦气压力为 1 0 0L/min条件下 ,微弹轰击 2次比微弹轰击 1次或 3次的效果都好 ;杜氏盐藻碳酸酐酶(CA1 )基因启动子可驱动bar基因在杜氏盐藻中瞬时表达 ,而双拷贝碳酸酐酶 (DCA1 )基因启动子可驱动bar基因在杜氏盐藻中稳定表达。结论 :在氦气压力为 1 0 0L/min条件下微弹轰击 2次 ,可能是基因枪法转化杜氏盐藻的较好转化条件。在转基因杜氏盐藻研究中 。 展开更多

关键词 杜氏盐藻 基因枪 DCA1 CA1 启动子

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2种PCR方法扩增盐藻肌动蛋白基因3’旁侧序列比较 被引量：6

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作者 姜国忠 谢华 +2 位作者 郭玉忠 范天黎 薛乐勋 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2004年第1期41-44,共4页

目的 :比较扩增盐藻肌动蛋白基因 3’旁侧序列的 2种PCR方法。方法 :用pvuⅡ、EcoRⅤ和StuⅠ 3种限制性内切酶消化盐藻基因组DNA后 ,供 2种PCR用 ,一种是连接介导法PCR(LMPCR) ,与用人工合成的适配子相连并用适配子引物和盐藻肌动蛋白... 目的 :比较扩增盐藻肌动蛋白基因 3’旁侧序列的 2种PCR方法。方法 :用pvuⅡ、EcoRⅤ和StuⅠ 3种限制性内切酶消化盐藻基因组DNA后 ,供 2种PCR用 ,一种是连接介导法PCR(LMPCR) ,与用人工合成的适配子相连并用适配子引物和盐藻肌动蛋白基因特异引物扩增未知序列 ;另一种是反向PCR(IPCR) ,酶切后的DNA自身环化做模板 ,用 2对基因特异引物反向扩增。结果 :2轮PCR后 ,LMPCR中得到大量的非特异扩增产物 ,测序结果发现许多产物是由适配子引物AP2单独扩增引起。而反向PCR在得到pvuⅡ和StuⅠ消化的自连文库中扩增得到 2 .5kb特异产物 ,经测序发现 ,片段两侧为基因特异引物 ,部分序列与已知序列相一致。Southern也进一步证实了IPCR扩增片段来源于盐藻基因组DNA。结论 :IPCR技术在克隆基因旁侧序列时优于LMPCR方法。 展开更多

关键词 反向PCR 连接介导法PCR 盐藻 肌动蛋白 旁侧序列cDNA 简并引物

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杜氏盐藻硝酸盐还原酶cDNA片段的克隆与分析 被引量：8

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作者 谢华 姜国忠 +4 位作者 吕玉民 牛向丽 许培荣 王建民 薛乐勋 《郑州大学学报（医学版）》 CAS 北大核心 2004年第1期6-8,共3页

目的 :获得杜氏盐藻硝酸盐还原酶cDNA片段。方法 :根据Dunaliellatertiolecta、衣藻、团藻等生物硝酸盐还原酶 (nitratereductase ,NR)高度保守序列EGWWFKP、WNVMGMM设计一对简并引物 ,以含硝酸盐培养基培养的的盐藻cDNA为模板 ,进行PC... 目的 :获得杜氏盐藻硝酸盐还原酶cDNA片段。方法 :根据Dunaliellatertiolecta、衣藻、团藻等生物硝酸盐还原酶 (nitratereductase ,NR)高度保守序列EGWWFKP、WNVMGMM设计一对简并引物 ,以含硝酸盐培养基培养的的盐藻cDNA为模板 ,进行PCR扩增 ,产物克隆至T载体后转化大肠杆菌JM1 0 9,经筛选后测序 ,将测序结果推导成氨基酸序列 ,并与Dunaliellatertiolecta、团藻、衣藻、小球藻等进行同源性分析。结果 :在盐藻中所获得的cDNA片段 ,核苷酸长度为 381bp ,编码 1 2 7个氨基酸。推导的氨基酸序列与下列物种的硝酸盐还原酶进行同源性比较 :Dunaliellatertiolecta为 88.2 %同源 ,团藻为 78% ,衣藻为 6 7% ,小球藻为 5 9%。结论 :所克隆的序列为盐藻硝酸盐还原酶cDNA片段。 展开更多

关键词 杜氏盐藻 硝酸盐还原酶 CDNA 简并引物

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