胰腺癌细胞ezrin基因转录调控区及其gRNA靶位点鉴定 被引量：2

1

作者 代基强 野庆松 +2 位作者 白圣凯 张青峰 高书颖 《医学研究生学报》 CAS 北大核心 2020年第2期133-138,共6页

目的ezrin基因在胰腺癌中过表达,其上游序列对于基因表达具有重要作用。文章拟敲除胰腺癌细胞ezrin基因转录调控区,鉴定其基因编辑gRNA靶位点。方法将携带ezrin基因上游片段的报告基因表达载体瞬时转染胰腺癌细胞Panc-1,采用双荧光素酶... 目的ezrin基因在胰腺癌中过表达,其上游序列对于基因表达具有重要作用。文章拟敲除胰腺癌细胞ezrin基因转录调控区,鉴定其基因编辑gRNA靶位点。方法将携带ezrin基因上游片段的报告基因表达载体瞬时转染胰腺癌细胞Panc-1,采用双荧光素酶报告基因检测系统,鉴定ezrin转录调控区。使用在线软件预测ezrin转录调控区上下游gRNA靶位点,构建基因编辑重组质粒pX459-sgRNA-L和pX458-sgRNA-R。将重组质粒共转染Panc-1细胞,针对gRNA靶位点进行基因组DNA的PCR扩增和亚克隆测序分析,鉴定ezrin转录调控区的靶向敲除。向转染重组质粒的Panc-1细胞中加入嘌呤霉素初步筛选,采用水溶性四氮唑盐法检测细胞增殖能力。结果荧光素酶报告基因检测结果显示,Panc-1细胞中ezrin基因-1297/-1186片段对SV40启动子和ezrin启动子具有转录增强作用。亚克隆测序结果显示,携带ezrin转录调控区gRNA靶位点序列的重组质粒共转染至Panc-1细胞,细胞基因组DNA出现片段缺失,位于gRNA-L和gRNA-R靶位点之间。细胞增殖实验结果显示,转染重组质粒的Panc-1细胞,其增殖能力显著受到抑制。胰腺癌Panc-1细胞ezrin基因-1297/-1186为转录调控区,其上游gRNA-L和下游gRNA-R序列可作为基因编辑靶点。结论实现了ezrin转录调控区的靶向敲除,Panc-1细胞增殖能力的抑制有可能与ezrin转录调控区的敲除有关。 展开更多

关键词 EZRIN基因 胰腺癌 基因编辑 靶向敲除

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翠雀的二萜生物碱类成分研究 被引量：2

2

作者 严园锋 蒋宏俊 尹田鹏 《化学研究与应用》 CAS 北大核心 2023年第6期1459-1463,共5页

采用硅胶柱色谱和制备型高效液相等方法对毛茛科植物翠雀(Delphinium grandiflorum L.)的化学成分进行分离纯化,并通过NMR等波谱学技术对所分离化合物进行结构鉴定。从翠雀全草中分离鉴定了8个C19-牛扁碱型二萜生物碱类化合物,即tatsien... 采用硅胶柱色谱和制备型高效液相等方法对毛茛科植物翠雀(Delphinium grandiflorum L.)的化学成分进行分离纯化,并通过NMR等波谱学技术对所分离化合物进行结构鉴定。从翠雀全草中分离鉴定了8个C19-牛扁碱型二萜生物碱类化合物,即tatsiensine(1)、deacetyltatsiensine(2)、siwanine A(3)、siwanine B(4)、elasine(5)、anthriscifoldine B(6)、browniine(7)、和牛扁碱(8)。其中化合物1~6首次从翠雀中分离得到。 展开更多

关键词 翠雀 毛茛科 二萜生物碱 化学成分

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云南食用花卉80%甲醇提取物抗氧化活性的比较研究 被引量：4

3

作者 沈晓静 周绍琴 +3 位作者 王虹 李兴玉 黄璐璐 尹田鹏 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期207-212,共6页

食用花卉因其健康作用而被广泛的消费。为进一步研究和开发云南食用花卉资源,评价其活性成分及其体外抗氧化活性,对采自云南的17种食用花的80%(体积分数)甲醇提取物进行总酚(total phenolic contents,TPC)、总黄酮(total flavonoid cont... 食用花卉因其健康作用而被广泛的消费。为进一步研究和开发云南食用花卉资源,评价其活性成分及其体外抗氧化活性,对采自云南的17种食用花的80%(体积分数)甲醇提取物进行总酚(total phenolic contents,TPC)、总黄酮(total flavonoid contents,TFC)及原花青素(total procyanidin contents,TPYC)含量测定,再通过DPPH法和FRAP法评估其抗氧化能力,并分析活性成分与抗氧化能力相关性。结果表明,17种食用花中以棠梨花所含总酚和总黄酮含量最高,分别为(229.00±1.67)mg GCE/g Ex和(586.20±22.75)RE/g Ex。此外,棠梨花还具有较强的铁还原能力,其还原能力为(2.94±0.32)mmol Fe^(2+)/g Ex。石榴花具有较强的DPPH自由基清除能力,其半抑制浓度值达(0.22±0.007)mg/mL。因此,这些食用花卉可作为天然抗氧化剂的重要潜在来源,并在人类饮食中有广阔的应用前景和开发价值。 展开更多

关键词 食用花卉 抗氧化活性 活性成分 相关性 热图分析

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牙周致病菌编码的Tannerpin-M对粒细胞释放的丝氨酸蛋白酶的抑制作用

4

作者 潘子豪 许佳伟 周爱武 《上海交通大学学报(医学版)》 CSCD 北大核心 2024年第12期1536-1544,共9页

目的·制备牙周致病相关坦纳菌编码的丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor,Serpin),分析其抑制靶蛋白酶的特异性及其结构特征。方法·通过氨基酸序列分析,选择人类口腔微生物组数据库(eHOMD)中的Serpin,将其转入大肠... 目的·制备牙周致病相关坦纳菌编码的丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor,Serpin),分析其抑制靶蛋白酶的特异性及其结构特征。方法·通过氨基酸序列分析,选择人类口腔微生物组数据库(eHOMD)中的Serpin,将其转入大肠埃希菌中进行重组表达;采用镍离子亲和层析等方法制备重组蛋白,分析其抑制丝氨酸蛋白酶的特异性,并通过结构生物学手段解析其三维空间结构。结果·在坦纳菌中发现一个新的且活性中心P1残基为甲硫氨酸的Serpin,将其命名为Tannerpin-M,并成功地从大肠埃希菌BL21(DE3)中制备了高纯度的重组蛋白。进一步的活性检测结果表明重组Tannerpin-M可以有效地与粒细胞来源的蛋白酶(人中性粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G和蛋白酶3)、胰弹性蛋白酶以及激肽释放酶1(KLK1)、KLK7等6种蛋白酶形成SDS稳定的共价复合物,其中Tannerpin-M抑制KLK7的二级反应速率常数为4.25×104 L/(mol·s)。解析分辨率为2.4Å(1Å=0.1 nm)的Tannerpin-M松弛态构象的晶体结构,结果显示Tannerpin-M具有显著延长的反应中心环,可以发生经典的抑制型Serpin从紧张态向松弛态转变的构象变化。结论·口腔致病菌编码的Tannerpin-M是一个典型的抑制型Serpin,其可以有效抑制粒细胞释放的丝氨酸蛋白酶,提示该口腔致病菌可能以此机制来抵抗人体免疫系统的攻击。 展开更多

关键词 丝氨酸蛋白酶抑制剂 坦纳菌 原核表达 晶体结构 牙周致病菌

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异源表达花生基因AhGLK1对拟南芥glk1glk2突变体表型特征及抗旱性的影响 被引量：5

5

作者 刘星 苏良辰 +3 位作者 张拜宏 曾丽丹 李媚娟 李玲 《华南师范大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2020年第3期78-84,共7页

为探讨花生基因AhGLK1对拟南芥表型特征和抗旱能力的影响,以glk1glk2突变体为实验材料,异源表达AhGLK1,观察转基因拟南芥表型特征,包括叶色、叶片数量和形态等;利用共聚焦显微镜观察叶绿体;测定拟南芥叶片失水率和旱后存活率;利用荧光... 为探讨花生基因AhGLK1对拟南芥表型特征和抗旱能力的影响,以glk1glk2突变体为实验材料,异源表达AhGLK1,观察转基因拟南芥表型特征,包括叶色、叶片数量和形态等;利用共聚焦显微镜观察叶绿体;测定拟南芥叶片失水率和旱后存活率;利用荧光测定仪检测干旱和复水恢复过程中,拟南芥叶片叶绿素荧光参数的变化.结果表明:AhGLK1/glk1glk2回复株系拟南芥叶片呈绿色,叶片数量增加,叶片卷曲,叶柄增长,叶绿体发育完善,气孔增多,叶片保水性提高,旱后存活率显著升高.叶绿素荧光参数在干旱胁迫下显著降低,而复水时恢复.证明AhGLK1通过影响叶片数量、形态发育以及光合作用等提高拟南芥的抗旱能力. 展开更多

关键词 AhGLK1 拟南芥 表型特征 抗旱性

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土豆中酪氨酸酶的提取及植物精油对其激活作用与动力学研究 被引量：3

6

作者 陈怀庆 廖兴宏 +3 位作者 赵慧 杨俊棋 王文君 张岩 《食品工业科技》 CAS 北大核心 2020年第7期25-29,36,共6页

本实验采取单因素分析法对土豆中酪氨酸粗酶的提取及反应条件进行优化,采用多巴速率氧化法筛选具有酪氨酸酶激活作用的植物精油,并通过酶动力学实验研究其激活机理。结果表明土豆中酪氨酸酶最佳提取条件为:料液比1∶10(g/mL)、磷酸盐缓... 本实验采取单因素分析法对土豆中酪氨酸粗酶的提取及反应条件进行优化,采用多巴速率氧化法筛选具有酪氨酸酶激活作用的植物精油,并通过酶动力学实验研究其激活机理。结果表明土豆中酪氨酸酶最佳提取条件为:料液比1∶10(g/mL)、磷酸盐缓冲液pH6.8;最佳酪氨酸酶反应条件为:温度35℃、时间13 min、底物L-多巴/粗酶加入量比例5∶5。在最佳提取条件与反应条件下筛选15种植物精油中发现百里香、茶树、依兰精油对酪氨酸酶激活作用显著(P>0.05),IC50值分别为0.488、0.429、0.480 mg/mL,接近阳性对照补骨脂素IC50值0.328 mg/mL,动力学实验发现百里香、茶树、依兰精油激活类型分别为非竞争型、混合型、混合型。 展开更多

关键词 土豆 酪氨酸酶 提取 植物精油 激活 动力学

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基于网络药理学与分子对接技术的石菖蒲治疗癫痫作用机制研究 被引量：3

7

作者 杨燕 王素芬 何希瑞 《世界科学技术-中医药现代化》 CSCD 北大核心 2022年第1期132-142,共11页

目的 利用网络药理学和分子对接技术研究石菖蒲抗癫痫的有效成分及作用机制。方法 运用中药系统药理数据库及分析平台检索石菖蒲有效成分及主要靶点,通过GeneCards数据库收集癫痫疾病的相关潜在作用靶点,运用Cytoscape.3.7.1和String绘... 目的 利用网络药理学和分子对接技术研究石菖蒲抗癫痫的有效成分及作用机制。方法 运用中药系统药理数据库及分析平台检索石菖蒲有效成分及主要靶点,通过GeneCards数据库收集癫痫疾病的相关潜在作用靶点,运用Cytoscape.3.7.1和String绘制石菖蒲-癫痫靶点互作关系图,运用Metascape数据库进行GO和KEGG信号通路富集分析。运用AutoDock Vina 1.1.2软件对石菖蒲主要有效成分与癫痫相关靶标进行分子对接验证;通过构建戊四唑诱导的癫痫模型初步评价石菖蒲提取物及潜在有效成分的抗癫痫作用。结果 由TCMSP筛选得到4个有效成分及76个主要靶点。癫痫疾病以“Score”大于1.5分进行筛选得到3685个靶标。GO富集分析得到BP条目10个,细胞CC条目9个,MF条目10个(P<0.01),主要涉及核受体活性、离子通道活性、激素结合、神经递质受体活性、蛋白激酶活性、钙调蛋白结合等。KEGG富集得到14条通路,主要涉及c型凝集素受体信号通路、雌激素信号通路、Ca^(2+)信号通路、逆行内源性大麻素信号通路等。分子对接结果显示,桉脂素、山奈酚和8-异戊烯基山奈酚与癫痫关键靶标GABRA2、PPARG等具有良好的结合活性。动物实验结果表明,石菖蒲水提取物及主要潜在有效成分桉脂素和山奈酚在PTZ致小鼠癫痫模型上显示出较好的抗癫痫活性。结论 本研究通过动物实验验证了石菖蒲提取物和潜在有效成分的抗癫痫活性,并且运用网络药理学和分子对接技术探讨了其抗癫痫作用机制,发现石菖蒲可通过多个成分如桉脂素、山奈酚、8-异戊烯基山奈酚,多靶点如GABA_(A)、PPARG等,多条通路如雌激素信号通路、钙信号通路对机体产生协调效应从而抑制癫痫的发作。该研究提示石菖蒲治疗癫痫具有多成分、多靶点、多通路特点,为石菖蒲的进一步研究提供数据支撑。 展开更多

关键词 石菖蒲 癫痫 网络药理学 分子对接 作用机制

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水翁花蕾提取物DMC对胰脂肪酶的抑制作用研究 被引量：3

8

作者 李婷 向灿辉 王文君 《食品工业科技》 CAS 北大核心 2020年第15期65-70,共6页

本文主要探讨了2’,4’-二羟基-6’-甲氧基-3’,5’-二甲基查耳酮(2’,4’-dihydroxy-6’-methoxy-3’,5’-dimethylchalcone,DMC)对胰脂肪酶(Pancreatic Lipase,PL)的抑制作用及作用机理。以4-硝基苯丁酸酯为底物,采用对硝基苯酚法检测... 本文主要探讨了2’,4’-二羟基-6’-甲氧基-3’,5’-二甲基查耳酮(2’,4’-dihydroxy-6’-methoxy-3’,5’-dimethylchalcone,DMC)对胰脂肪酶(Pancreatic Lipase,PL)的抑制作用及作用机理。以4-硝基苯丁酸酯为底物,采用对硝基苯酚法检测DMC对PL活性的影响,采用紫外光谱法、荧光光谱法以及分子对接法研究DMC与PL的相互作用。结果表明:DMC对PL有抑制作用,半数抑制浓度为50.01±3.56μmol/L,酶动力研究表明DMC是PL的竞争型抑制剂;光谱实验结果显示DMC的加入使PL发生了荧光猝灭,猝灭类型为动态猝灭;同步荧光及三维荧光实验表明DMC不会改变PL构象;热力学参数ΔG<0,两者的相互作用是自发进行,ΔH<0,ΔS<0,表明DMC与PL的相互作用力主要为氢键和范德华力;分子对接实验进一步验证了以上结果。由此可见,DMC具有作为PL抑制剂的潜能。 展开更多

关键词 水翁花蕾提取物 2’ 4’-二羟基-6’-甲氧基-3’ 5’-二甲基查耳酮 胰脂肪酶 抑制作用 相互作用

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黄草乌内生真菌Penicillium virgatum的次生代谢产物研究 被引量：2

9

作者 李幸 郑春辉 +2 位作者 严园锋 冯昆 尹田鹏 《化学研究与应用》 CAS CSCD 北大核心 2022年第9期2216-2220,共5页

运用柱层析分离技术和NMR鉴定方法,从乌头属植物黄草乌(Aconitum vilmorinianum Kom.)内生真菌Penicillium virgatum AV-45的固体发酵提取物中分离鉴定了10个化合物,即(2R,3S)-1-(4-羟基苯基)-2,3-丁二醇(1)、cyclonerodiol(2)、demethy... 运用柱层析分离技术和NMR鉴定方法,从乌头属植物黄草乌(Aconitum vilmorinianum Kom.)内生真菌Penicillium virgatum AV-45的固体发酵提取物中分离鉴定了10个化合物,即(2R,3S)-1-(4-羟基苯基)-2,3-丁二醇(1)、cyclonerodiol(2)、demethylincisterol A(3)、麦角甾醇-5,8-过氧化物(4)、cerevisterol(5)、β-谷甾醇(6)、3-乙酰基-β-谷甾醇(7)、单油酸甘油酯(8)、10-eicosenoic acid(9)和methyl 12,13-epoxyoleate(10)。其中化合物1和10首次从青霉菌属真菌的次生代谢产物中分离得到。 展开更多

关键词 黄草乌 内生菌 Penicillium virgatum 次生代谢产物

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大黄酸抑制线粒体分裂和EMT减缓乳腺癌细胞迁移 被引量：2

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作者 李小波 谢艳 +4 位作者 陈金霞 娄兴凤 苗春龙 范庆 郑衍芳 《世界科学技术-中医药现代化》 CSCD 北大核心 2023年第8期2692-2698,共7页

目的探讨大黄酸对人乳腺癌细胞MDA-MB-231的线粒体分裂和上皮细胞转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响。方法乳腺癌细胞MDA-MB-231分为对照组(0μmol·L^(-1)大黄酸组)、低剂量大黄酸组(100μmol·L^(-1)大黄... 目的探讨大黄酸对人乳腺癌细胞MDA-MB-231的线粒体分裂和上皮细胞转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响。方法乳腺癌细胞MDA-MB-231分为对照组(0μmol·L^(-1)大黄酸组)、低剂量大黄酸组(100μmol·L^(-1)大黄酸组)、高剂量大黄酸组(200μmol·L^(-1)大黄酸组),不同浓度大黄酸处理24 h后,采用CCK-8检测细胞的增殖活性,细胞划痕实验检测细胞迁移情况,透射电镜检测线粒体形态和分布,免疫印迹法检测线粒体融合蛋白2(Mitofusi2,Mfn2)和动力相关蛋白1(Dynamin-related protein1,Drp1)、波形蛋白(Vimentin)、E钙粘蛋白(E-cadherin)蛋白的表达。结果与对照组相比,大黄酸可减低Drp1、Vimentin蛋白表达(P<0.05),增高Mfn2、E-cadherin蛋白表达,减少细胞线粒体数目和上皮细胞转分化的情况,从而减低乳腺癌细胞MDA-MB-231转移(P<0.05)。大黄酸高剂量效果较低剂量更佳(P<0.05)。结论大黄酸通过降低Drp1,Vimentin,增高Mfn2,E-cadherin蛋白表达,降低线粒体分裂和上皮细胞转分化,抑制乳腺癌迁移。 展开更多

关键词 大黄酸 乳腺癌转移 线粒体分裂 上皮细胞转分化

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链球菌脂蛋白的功能作用及其作为疫苗候选蛋白和抗菌药物靶标的研究进展

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作者 阳小燕 朱可欣 +3 位作者 郭众 邓一丹 李莎 乐尧金 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2020年第9期956-967,共12页

脂蛋白是一类广泛存在于革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌中的细胞膜锚定蛋白,具有多种生物学功能.脂蛋白不仅作为细菌的毒力因子,而且能够识别和激活宿主的免疫系统,是当前预防和治疗细菌感染的热门靶点之一,本文对链球菌中脂蛋白的主... 脂蛋白是一类广泛存在于革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌中的细胞膜锚定蛋白,具有多种生物学功能.脂蛋白不仅作为细菌的毒力因子,而且能够识别和激活宿主的免疫系统,是当前预防和治疗细菌感染的热门靶点之一,本文对链球菌中脂蛋白的主要功能及其在疫苗和抗菌药物研究中的进展进行了综述和展望,为今后链球菌中脂蛋白的深入研究拓宽了思路. 展开更多

关键词 脂蛋白 肺炎链球菌 A族链球菌 B族链球菌 变异链球菌 疫苗 抗菌药物靶标

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ChIP-seq分析花生中AhGLK1与AhHDA1调控的下游靶基因网络

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作者 刘星 苏良辰 +1 位作者 李丽梅 李玲 《作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第11期2765-2773,共9页

花生(Arachis hypogaea L.)是重要的经济油料作物,其生长发育、产量与品质受干旱影响。为深入了解花生的抗旱机理,本研究通过ChIP-seq对组蛋白去乙酰化酶AhHDA1和转录因子AhGLK1富集的DNA序列进行分析,揭示两者调控的下游靶基因网络。... 花生(Arachis hypogaea L.)是重要的经济油料作物,其生长发育、产量与品质受干旱影响。为深入了解花生的抗旱机理,本研究通过ChIP-seq对组蛋白去乙酰化酶AhHDA1和转录因子AhGLK1富集的DNA序列进行分析,揭示两者调控的下游靶基因网络。通过比对分析,GLK-IP获得6571万clean beads,HDA-IP获得6390万clean beads,Input获得7006万clean beads,唯一比对率分别为74.97%、76.81%和76.75%。GLK-IP获得714个peak, HDA-IP获得543个peak。Peak在基因的外显子、内含子、上游、下游和基因间等功能元件均有分布。GO富集结果显示,AhGLK1-IP和AhHDA1-IP的peak相关基因在分子功能中的富集分别为35.1%和32.8%,在生物学过程中的富集分别为39.3%和44.2%,在细胞组分中的富集分别为25.5%和22.8%。KEGG信号通路富集结果显示,AhGLK1-IP相关基因显著富集在“代谢途径(metabolic pathways)”、“抗生素生物合成(biosynthesis of antibiotics)”、“二羧酸代谢(glyoxylate and dicarboxylate metabolism)”、“不同环境中微生物代谢(microbial metabolism in diverse environments)”、“碳代谢(carbon metabolism)”、“次生代谢生物合成(biosynthesis of secondary metabolites)”和“氨基酸生物合成(biosynthesis of amino acids)。而AhHDA1-IP相关基因在“N聚糖生物合成(N-glycan biosynthesis)”、“精氨酸和脯氨酸代谢(arginine and proline metabolism)”和“苯丙氨酸代谢(phenylalanine metabolism)”通路显著富集。AhGLK1-IP和AhHDA1-IP共同富集的peak有4个,在AhGLK1-IP和AhHDA1-IP特异富集的基序(motif)中存在共同的保守序列AGAA/T。研究结果为深入认识AhGLK1和AhHDA1基因的功能和了解花生响应干旱胁迫和旱后恢复生长中的调控机制具有参考价值。 展开更多

关键词 花生 CHIP-SEQ AhGLK1 AhHDA1 靶基因

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小鼠肺炎链球菌脂蛋白SPD1609多克隆抗体的制备

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作者 阳小燕 何丽媛 +1 位作者 韦发昌 郭众 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第12期1122-1127,共6页

目的制备肺炎链球菌脂蛋白SPD1609的小鼠多克隆抗体。方法通过PCR扩增肺炎链球菌D39菌株中的spd1609基因,连接到原核表达载体pGEX-4T-1上,构建重组质粒pGEX-4T-1609。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)... 目的制备肺炎链球菌脂蛋白SPD1609的小鼠多克隆抗体。方法通过PCR扩增肺炎链球菌D39菌株中的spd1609基因,连接到原核表达载体pGEX-4T-1上,构建重组质粒pGEX-4T-1609。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶-SPD1609(GST-1609)融合蛋白。利用GST亲和层析柱纯化GST-1609融合蛋白,纯化后的融合蛋白用凝血酶(thrombin)外切酶切掉GST标签,进一步通过GST亲和层析得到SPD1609蛋白。用纯化的不含GST标签的SPD1609蛋白免疫小鼠,制备多克隆抗体,用ELISA检测抗体的效价,Western blot法检测抗体的特异性。结果成功构建了原核表达载体pGEX-4T-1609,经GST亲和层析柱分离纯化后可得到相对分子质量(Mr)35000的SPD1609蛋白,蛋白纯度在95%以上。ELISA检测结果显示纯化后的SPD1609蛋白可诱导小鼠产生特异性免疫应答,免疫小鼠血清抗体的效价达1∶40960,Western blot法检测显示此多克隆抗体可以特异地识别原核表达和肺炎链球菌细胞内表达的SPD1609蛋白。结论成功制备具有较好特异性的SPD1609蛋白的小鼠多克隆抗体。 展开更多

关键词 SPD1609蛋白 肺炎链球菌 原核表达 多克隆抗体

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蓝藻丝氨酸蛋白酶抑制剂arthropin的制备及其靶蛋白酶的筛选

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作者 许佳伟 周爱武 杨愈丰 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期428-436,共9页

目的·制备高纯度的蓝藻丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor,serpin),筛选其靶蛋白酶,并探究其抑制活性。方法·通过氨基酸序列分析,在人类口腔微生物组数据库(eHOMD)发现了一种钝顶节旋藻(Arthrospira platensis)的... 目的·制备高纯度的蓝藻丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor,serpin),筛选其靶蛋白酶,并探究其抑制活性。方法·通过氨基酸序列分析,在人类口腔微生物组数据库(eHOMD)发现了一种钝顶节旋藻(Arthrospira platensis)的serpin,将其命名为arthropin;构建融合表达载体pSUMO3-arthropin,将其转入大肠埃希菌BL21(DE3)诱导表达;采用镍离子亲和层析、酶切、反向镍离子亲和层析、阴离子交换层析的4步层析纯化方案将arthropin重组蛋白分离纯化;将arthropin重组蛋白分别与活化的凝血因子Ⅸ(activated factorⅨ,FⅨa)、FⅩa、FⅪa、活化的蛋白C(activated protein C,APC)、激肽释放酶1(kallikrein 1,KLK1)等14种丝氨酸蛋白酶共孵育,再利用SDS-PAGE分析共价复合物形成情况,利用反应动力学方法检测arthropin对KLK1的抑制速率。对arthropin重组蛋白的结晶条件进行筛选,选取合适的晶体进行X射线衍射并采集数据。利用AlphaFlod Colab预测arthropin亚稳态结构模型。结果·SDS-PAGE分析发现,arthropin融合蛋白在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达;纯化后,获得了高纯度的与理论相对分子质量(45800)相近的arthropin重组蛋白。将arthropin重组蛋白与14种丝氨酸蛋白酶共孵育后发现,arthropin能与FⅩa、APC、FⅨa、FⅪa、胰蛋白酶(trypsin)、组织蛋白酶G(cathepsin G)、KLK1、KLK7和凝血酶(thrombin)9种蛋白酶形成稳定的共价复合物。Arthropin抑制KLK1的二级反应抑制速率常数为1.7×103 L/(mol·s)。Arthropin重组蛋白可以在25%聚乙二醇单甲醚550(PEG MME 550)、0.1 mol/L吗啉乙磺酸(MES,pH 6.5)、0.01 mol/L ZnCl2条件下形成片状晶体,X射线衍射分辨率为10Å(1Å=1×10−10 m)。AlphaFlod Colab预测结果发现,arthropin具有经典的抑制型serpin的结构特点。结论·成功获得高纯度的钝顶节旋藻丝氨酸蛋白酶抑制剂arthropin,其具有较广谱的丝氨酸蛋白酶抑制能力,但抑制速率较低。 展开更多

关键词 丝氨酸蛋白酶抑制剂 钝顶节旋藻 原核表达 蛋白结晶

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