背景和目的:2016年美国国家癌症研究所(National Cancer Institute,NCI)宣布不再使用NCI-60细胞系进行药物筛选,提示传统的肿瘤细胞系失去作为药物研发和基础研究工具的价值。NCI-60细胞“退休”原因是基于癌症细胞系和动物的实验结果...背景和目的:2016年美国国家癌症研究所(National Cancer Institute,NCI)宣布不再使用NCI-60细胞系进行药物筛选,提示传统的肿瘤细胞系失去作为药物研发和基础研究工具的价值。NCI-60细胞“退休”原因是基于癌症细胞系和动物的实验结果没有在临床试验中获得对应的预期,导致绝大部分潜在药物临床试验失败。癌症细胞系失去价值归因于肿瘤细胞经过长期培养后,其增殖和转移等主要生物学行为和与之有关的关键蛋白质系统发生了根本改变,已不能代表患者的真实癌症特征。现阶段需要创立一种来源于患者新鲜癌症组织和具有清晰临床背景的新癌症模型。本研究旨在为药物研发和基础研究建立经济的患者来源的可以无限传代的乳腺癌原代细胞系。方法:乳腺癌组织在贵州医科大学附属医院乳腺外科收集。肿瘤组织样本收集得到贵州医科大学附属医院伦理委员会批准(伦理编号:2022伦理第313号),收集和使用肿瘤组织均遵守赫尔辛基宣言,患者的乳腺癌组织消化分离后在BCMI培养基中培养,待乳腺癌细胞增殖到一定数量时更换成DMEM培养基。乳腺癌细胞经短串联重复序列(short tandem repeat,STR)检测确定细胞特异性遗传学标志和来源。克隆形成实验和动物实验分析乳腺癌原代细胞系形成肿瘤的能力。结果:成功建立了6种乳腺癌原代细胞系。他们具有清晰的临床病理学特征,包括病理学标志性分子检测、临床诊断、治疗方案和结果以及确定的预后结果。STR检测确定了6种乳腺癌原代细胞系特异性遗传标志和确定了该细胞系的来源。克隆形成实验和动物移植实验说明乳腺癌原代细胞系增殖能力显著大于传统乳腺癌细胞系,二者在形成肿瘤能力方面存在明显的差异。结论:构建的6种乳腺癌原代细胞系为乳腺癌药物研发和基础研究提供了新的癌症模型。展开更多
目的探讨在不同肿瘤细胞中核糖体S6蛋白激酶4(ribosomal protein S6 kinase 4,RSK4)的表达谱是否存在差异,以及预测可能存在的蛋白亚型及其生物学特性。方法提取神经胶质瘤细胞GL261、卵巢癌细胞ID8、乳腺癌细胞4T1和168FARN、结肠癌细...目的探讨在不同肿瘤细胞中核糖体S6蛋白激酶4(ribosomal protein S6 kinase 4,RSK4)的表达谱是否存在差异,以及预测可能存在的蛋白亚型及其生物学特性。方法提取神经胶质瘤细胞GL261、卵巢癌细胞ID8、乳腺癌细胞4T1和168FARN、结肠癌细胞mc38和CT26、胃癌细胞MFC和肺癌细胞LLC1的RNA,采用RT-PCR技术检测RSK4的表达及其剪接异构体,生物信息学分析RSK4的生物学特征及其功能。结果RT-PCR结果显示在GL261、4T1、mc38、CT26、MFC和LLC1中均表达RSK4,且不同的肿瘤细胞中表达了多个剪接异构体,开放阅读框分析RSK4可能至少编码11个蛋白亚型;二级结构分析显示,这些剪接异构体编码的蛋白亚型均由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲组成,且保守结构域均相同;蛋白互作网络富集分析显示,RSK4主要通过mTOR信号通路和突触持续增强等信号通路在核质和胞浆中发挥激酶的活性。结论RSK4在不同的肿瘤细胞中存在不同的表达谱,可能产生多种氮端不同的蛋白异构体,能够通过多种信号通路参与不同的生物学途径。展开更多
目的:探讨着丝粒蛋白F(centromere protein F,CENPF)在腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma,ACC)发生发展中的作用和分子机制。方法:通过小干扰RNA转染敲低ACC细胞中的CENPF。通过细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)、划痕实验...目的:探讨着丝粒蛋白F(centromere protein F,CENPF)在腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma,ACC)发生发展中的作用和分子机制。方法:通过小干扰RNA转染敲低ACC细胞中的CENPF。通过细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)、划痕实验和Transwell测定评估敲低CENPF对ACC细胞增殖、迁移、侵袭的影响;通过蛋白免疫印迹实验分析改变CENPF表达后ACC细胞中磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase,AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路相关蛋白表达变化,通过CCK-8、划痕实验和Transwell测定评估敲低CENPF联合PI3K抑制剂BKM-120对ACC细胞增殖、迁移、侵袭的影响。结果:敲低ACC-M中CENPF表达后,CCK-8实验证明其增殖能力减弱;划痕实验表明其迁移能力减弱,Transwell实验表明其侵袭能力减弱,PI3K/AKT通路关键蛋白p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表达水平下降。在下调CENPF的ACC-M中加入PI3K抑制剂,PI3K/AKT通路关键蛋白表达水平进一步下降。此外,加入PI3K抑制剂后,CENPF下调的ACC-M增殖、迁移、侵袭能力较单纯下调CENPF的ACC-M进一步减弱。结论:CENPF通过调控PI3K/AKT信号通路参与ACC进展。展开更多
目的β-淀粉样蛋白(Aβ)的异常聚集,导致细胞外老年斑和细胞内神经原纤维缠结的形成,从而引发的细胞毒性诱导神经元凋亡,导致渐进性认知功能障碍的临床表现,是阿尔茨海默病(AD)常见发病机制之一。因此,我们研究PNU282987激活SD新生乳鼠...目的β-淀粉样蛋白(Aβ)的异常聚集,导致细胞外老年斑和细胞内神经原纤维缠结的形成,从而引发的细胞毒性诱导神经元凋亡,导致渐进性认知功能障碍的临床表现,是阿尔茨海默病(AD)常见发病机制之一。因此,我们研究PNU282987激活SD新生乳鼠大脑皮质星形胶质细胞α7尼古丁乙酰胆碱能受体(n ACh R)后通过PI3K/Akt/HSF1信号通路介导内源性αB-crystallin(Cryab)对Aβ聚集的影响。方法分离出生24 h内SD乳鼠皮质层的星形胶质细胞进行培养、纯化、并传代,通过细胞免疫荧光的方法对星形胶质细胞进行鉴定;体外制备Aβ1-42寡聚体并进行鉴定;将细胞分为空白对照组、MLA处理组、PNU282987处理组、PNU282987+MLA处理组、LY294002处理组、PNU282987+LY294002处理组、Aβ处理组、PNU282987+Aβ处理组、PNU282987+LY294002+Aβ处理组及HSF1敲低组。收集细胞总蛋白,通过Western蛋白印迹法检测p-Akt,Cryab,HSF1和Aβ的蛋白表达水平。结果细胞免疫荧光鉴定显示培养的原代星形胶质细胞占总细胞98%以上;Western蛋白印迹法对细胞中Cryab,p-Akt,HSF1和Aβ表达水平的结果显示:与空白对照组相比较,PNU282987处理后,Cryab,p-Akt,HSF1蛋白都表现出上升的趋势(P<0.05),而单独MLA组或LY294002组无明显差异;在HSF1敲低组,PNU282987上调Cryab的作用受到明显的抑制;正常对照组未检测到Aβ的表达,与Aβ组相比,PNU282987组的Aβ表达降低(P<0.05);与PNU282987+Aβ组相比,PNU282987+LY294002+Aβ组的Aβ表达升高(P<0.01)。结论在原代星形胶质细胞模型上,PNU282987可通过激活星形胶质细胞的α7 n ACh R介导HSF1上调内源性Cryab从而抑制Aβ集聚,PI3K/Akt信号通路很可能是这个过程中的重要参与因素,为探讨Cryab和HSF1可能是治疗AD的一个潜在靶点提供了一定的基础研究。展开更多
文摘背景和目的:2016年美国国家癌症研究所(National Cancer Institute,NCI)宣布不再使用NCI-60细胞系进行药物筛选,提示传统的肿瘤细胞系失去作为药物研发和基础研究工具的价值。NCI-60细胞“退休”原因是基于癌症细胞系和动物的实验结果没有在临床试验中获得对应的预期,导致绝大部分潜在药物临床试验失败。癌症细胞系失去价值归因于肿瘤细胞经过长期培养后,其增殖和转移等主要生物学行为和与之有关的关键蛋白质系统发生了根本改变,已不能代表患者的真实癌症特征。现阶段需要创立一种来源于患者新鲜癌症组织和具有清晰临床背景的新癌症模型。本研究旨在为药物研发和基础研究建立经济的患者来源的可以无限传代的乳腺癌原代细胞系。方法:乳腺癌组织在贵州医科大学附属医院乳腺外科收集。肿瘤组织样本收集得到贵州医科大学附属医院伦理委员会批准(伦理编号:2022伦理第313号),收集和使用肿瘤组织均遵守赫尔辛基宣言,患者的乳腺癌组织消化分离后在BCMI培养基中培养,待乳腺癌细胞增殖到一定数量时更换成DMEM培养基。乳腺癌细胞经短串联重复序列(short tandem repeat,STR)检测确定细胞特异性遗传学标志和来源。克隆形成实验和动物实验分析乳腺癌原代细胞系形成肿瘤的能力。结果:成功建立了6种乳腺癌原代细胞系。他们具有清晰的临床病理学特征,包括病理学标志性分子检测、临床诊断、治疗方案和结果以及确定的预后结果。STR检测确定了6种乳腺癌原代细胞系特异性遗传标志和确定了该细胞系的来源。克隆形成实验和动物移植实验说明乳腺癌原代细胞系增殖能力显著大于传统乳腺癌细胞系,二者在形成肿瘤能力方面存在明显的差异。结论:构建的6种乳腺癌原代细胞系为乳腺癌药物研发和基础研究提供了新的癌症模型。
文摘目的探讨在不同肿瘤细胞中核糖体S6蛋白激酶4(ribosomal protein S6 kinase 4,RSK4)的表达谱是否存在差异,以及预测可能存在的蛋白亚型及其生物学特性。方法提取神经胶质瘤细胞GL261、卵巢癌细胞ID8、乳腺癌细胞4T1和168FARN、结肠癌细胞mc38和CT26、胃癌细胞MFC和肺癌细胞LLC1的RNA,采用RT-PCR技术检测RSK4的表达及其剪接异构体,生物信息学分析RSK4的生物学特征及其功能。结果RT-PCR结果显示在GL261、4T1、mc38、CT26、MFC和LLC1中均表达RSK4,且不同的肿瘤细胞中表达了多个剪接异构体,开放阅读框分析RSK4可能至少编码11个蛋白亚型;二级结构分析显示,这些剪接异构体编码的蛋白亚型均由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲组成,且保守结构域均相同;蛋白互作网络富集分析显示,RSK4主要通过mTOR信号通路和突触持续增强等信号通路在核质和胞浆中发挥激酶的活性。结论RSK4在不同的肿瘤细胞中存在不同的表达谱,可能产生多种氮端不同的蛋白异构体,能够通过多种信号通路参与不同的生物学途径。
文摘目的:探讨着丝粒蛋白F(centromere protein F,CENPF)在腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma,ACC)发生发展中的作用和分子机制。方法:通过小干扰RNA转染敲低ACC细胞中的CENPF。通过细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)、划痕实验和Transwell测定评估敲低CENPF对ACC细胞增殖、迁移、侵袭的影响;通过蛋白免疫印迹实验分析改变CENPF表达后ACC细胞中磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase,AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路相关蛋白表达变化,通过CCK-8、划痕实验和Transwell测定评估敲低CENPF联合PI3K抑制剂BKM-120对ACC细胞增殖、迁移、侵袭的影响。结果:敲低ACC-M中CENPF表达后,CCK-8实验证明其增殖能力减弱;划痕实验表明其迁移能力减弱,Transwell实验表明其侵袭能力减弱,PI3K/AKT通路关键蛋白p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表达水平下降。在下调CENPF的ACC-M中加入PI3K抑制剂,PI3K/AKT通路关键蛋白表达水平进一步下降。此外,加入PI3K抑制剂后,CENPF下调的ACC-M增殖、迁移、侵袭能力较单纯下调CENPF的ACC-M进一步减弱。结论:CENPF通过调控PI3K/AKT信号通路参与ACC进展。
文摘目的β-淀粉样蛋白(Aβ)的异常聚集,导致细胞外老年斑和细胞内神经原纤维缠结的形成,从而引发的细胞毒性诱导神经元凋亡,导致渐进性认知功能障碍的临床表现,是阿尔茨海默病(AD)常见发病机制之一。因此,我们研究PNU282987激活SD新生乳鼠大脑皮质星形胶质细胞α7尼古丁乙酰胆碱能受体(n ACh R)后通过PI3K/Akt/HSF1信号通路介导内源性αB-crystallin(Cryab)对Aβ聚集的影响。方法分离出生24 h内SD乳鼠皮质层的星形胶质细胞进行培养、纯化、并传代,通过细胞免疫荧光的方法对星形胶质细胞进行鉴定;体外制备Aβ1-42寡聚体并进行鉴定;将细胞分为空白对照组、MLA处理组、PNU282987处理组、PNU282987+MLA处理组、LY294002处理组、PNU282987+LY294002处理组、Aβ处理组、PNU282987+Aβ处理组、PNU282987+LY294002+Aβ处理组及HSF1敲低组。收集细胞总蛋白,通过Western蛋白印迹法检测p-Akt,Cryab,HSF1和Aβ的蛋白表达水平。结果细胞免疫荧光鉴定显示培养的原代星形胶质细胞占总细胞98%以上;Western蛋白印迹法对细胞中Cryab,p-Akt,HSF1和Aβ表达水平的结果显示:与空白对照组相比较,PNU282987处理后,Cryab,p-Akt,HSF1蛋白都表现出上升的趋势(P<0.05),而单独MLA组或LY294002组无明显差异;在HSF1敲低组,PNU282987上调Cryab的作用受到明显的抑制;正常对照组未检测到Aβ的表达,与Aβ组相比,PNU282987组的Aβ表达降低(P<0.05);与PNU282987+Aβ组相比,PNU282987+LY294002+Aβ组的Aβ表达升高(P<0.01)。结论在原代星形胶质细胞模型上,PNU282987可通过激活星形胶质细胞的α7 n ACh R介导HSF1上调内源性Cryab从而抑制Aβ集聚,PI3K/Akt信号通路很可能是这个过程中的重要参与因素,为探讨Cryab和HSF1可能是治疗AD的一个潜在靶点提供了一定的基础研究。
