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PKMYT1在糖皮质激素诱导成骨细胞凋亡中的作用
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作者 杨成友 罗鸿 +6 位作者 王涛 谢志鸿 梁亮 李凡超 吴建华 张飞 彭吾训 《中国运动医学杂志》 北大核心 2025年第5期381-393,共13页
目的:探讨膜相关酪氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(PKMYT1)在糖皮质激素(GC)诱导的成骨细胞(OB)凋亡中的作用,为早期激素性股骨头坏死(SANFH)提供理论基础和治疗靶点。方法:(1)选取小鼠颅盖骨成骨样细胞(MC3T3-E1)进行研究,control组使用普通培... 目的:探讨膜相关酪氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(PKMYT1)在糖皮质激素(GC)诱导的成骨细胞(OB)凋亡中的作用,为早期激素性股骨头坏死(SANFH)提供理论基础和治疗靶点。方法:(1)选取小鼠颅盖骨成骨样细胞(MC3T3-E1)进行研究,control组使用普通培养基培养,实验组进行成骨诱导培养,通过碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色(ARS)验证成骨能力。使用不同浓度的GC处理小鼠成骨细胞(mOB),通过膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(AnnexinⅤ-FITC/PI)双染色法检测细胞凋亡,细胞计数试剂盒-8(CCK8)检测细胞增殖,蛋白质免疫印迹(WB)检测抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2(BCL-2)和促凋亡蛋白切割的半胱天冬酶-3和切割的半胱天冬酶-9(cleaved caspase 3/9)的表达。通过蛋白组学测序找出可能调控GC诱导mOB凋亡的分子。进一步通过实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)及WB分析PKMYT1表达。(2)选择不同浓度PKMYT1抑制剂GSK-1520489A处理mOB,以筛选合适抑制剂浓度,进一步分组为control组、GC组、GSK-1520489A组和GC+GSK-1520489A组,通过WB检测各组细胞PKMYT1和凋亡相关蛋白BCL-2、cleaved caspase 3/9的表达,CCK8实验检测细胞活性及细胞毒性,5-乙炔基-2-脱氧尿苷(EDU)检测细胞增殖,细胞活死染色和AnnexinⅤ-FITC/PI双染色法检测凋亡。(3)使用PKMYT1过表达慢病毒感染mOB,通过免疫荧光、q PCR和WB验证过表达效率。过表达PKMYT1成功后,将细胞分为control组、GC组、PKMYT1过表达(OE)组和OE+GC组,通过EDU检测细胞增殖,AnnexinⅤ-FITC/PI双染色法和细胞活死染色检测凋亡。(4)为了验证人成骨细胞(hOB)中PKMYT1变化,选取健康人股骨头提取的hOB为control组,激素性股骨头缺血性坏死(hSANFH)患者股骨头提取的hOB为hSANFH组,通过qPCR和WB检测两组细胞中PKMYT1表达。结果:(1)小鼠颅盖骨成骨样细胞(MC3T3-E1)诱导分化成熟后,在GC作用下,相较于control组,实验组中随着GC浓度增加,AnnexinⅤ-FITC/PI双染色法检测显示mOB凋亡细胞比例增多(P<0.01);CCK8实验显示细胞活性降低(P<0.01);WB检测显示BCL-2表达降低(P<0.01)、cleaved caspase 3/9表达均升高(P<0.01)。蛋白组学测序显示GC处理成熟的mOB后PKMYT1表达降低。(2)不同浓度PKMYT1抑制剂GSK-1520489A处理m OB,随着浓度增加,细胞活性降低,细胞毒性增加(P<0.001)。相对于control组,GSK-1520489A组中m OB增殖减少(P<0.001),mOB凋亡增多(P<0.001);相较于单独使用GC组,使用GC+GSK-1520489A组中m OB增殖减少(P<0.05),mOB凋亡增多(P<0.01)。(3)过表达PKMYT1后,相对于control组,OE组中mOB增殖增加(P<0.001),m OB凋亡未见明显增多(P>0.05)。相对于GC组,OE+GC组中m OB增殖增加(P<0.001),m OB凋亡减少(P<0.001)。(4)在人股骨头组织中提取hOB,q PCR和WB结果表明hSANFH组中PKMYT1表达低于control组(P<0.001)。结论:PKMYT1表达下调促进GC诱导的m OB凋亡;相反,过表达PKMYT1抑制GC诱导的mOB凋亡。PKMYT1可能成为SANFH早期治疗的潜在靶点。 展开更多
关键词 激素性股骨头坏死 PKMYT1 成骨细胞 凋亡 增殖
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乳腺癌原代细胞系为药物筛选和基础研究提供癌症新模型
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作者 郝弦 黄建军 +14 位作者 杨文秀 刘晋廷 张军红 罗钰蓓 李青 王大红 高玉炜 谭福云 薄莉 郑羽 王荣 冯江龙 李静 赵春华 豆晓伟 《中国癌症杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期561-570,共10页
背景和目的:2016年美国国家癌症研究所(National Cancer Institute,NCI)宣布不再使用NCI-60细胞系进行药物筛选,提示传统的肿瘤细胞系失去作为药物研发和基础研究工具的价值。NCI-60细胞“退休”原因是基于癌症细胞系和动物的实验结果... 背景和目的:2016年美国国家癌症研究所(National Cancer Institute,NCI)宣布不再使用NCI-60细胞系进行药物筛选,提示传统的肿瘤细胞系失去作为药物研发和基础研究工具的价值。NCI-60细胞“退休”原因是基于癌症细胞系和动物的实验结果没有在临床试验中获得对应的预期,导致绝大部分潜在药物临床试验失败。癌症细胞系失去价值归因于肿瘤细胞经过长期培养后,其增殖和转移等主要生物学行为和与之有关的关键蛋白质系统发生了根本改变,已不能代表患者的真实癌症特征。现阶段需要创立一种来源于患者新鲜癌症组织和具有清晰临床背景的新癌症模型。本研究旨在为药物研发和基础研究建立经济的患者来源的可以无限传代的乳腺癌原代细胞系。方法:乳腺癌组织在贵州医科大学附属医院乳腺外科收集。肿瘤组织样本收集得到贵州医科大学附属医院伦理委员会批准(伦理编号:2022伦理第313号),收集和使用肿瘤组织均遵守赫尔辛基宣言,患者的乳腺癌组织消化分离后在BCMI培养基中培养,待乳腺癌细胞增殖到一定数量时更换成DMEM培养基。乳腺癌细胞经短串联重复序列(short tandem repeat,STR)检测确定细胞特异性遗传学标志和来源。克隆形成实验和动物实验分析乳腺癌原代细胞系形成肿瘤的能力。结果:成功建立了6种乳腺癌原代细胞系。他们具有清晰的临床病理学特征,包括病理学标志性分子检测、临床诊断、治疗方案和结果以及确定的预后结果。STR检测确定了6种乳腺癌原代细胞系特异性遗传标志和确定了该细胞系的来源。克隆形成实验和动物移植实验说明乳腺癌原代细胞系增殖能力显著大于传统乳腺癌细胞系,二者在形成肿瘤能力方面存在明显的差异。结论:构建的6种乳腺癌原代细胞系为乳腺癌药物研发和基础研究提供了新的癌症模型。 展开更多
关键词 乳腺癌原代细胞系 药物研发 基础研究 新癌症模型
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带股方肌蒂骨瓣移位治疗成人股骨头缺血性坏死的疗效及安全性分析 被引量:7
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作者 张健 殷富裕 彭吾训 《中国临床解剖学杂志》 CSCD 北大核心 2017年第2期228-231,共4页
目的研究分析带股方肌蒂骨瓣移位治疗成人股骨头缺血性坏死的疗效及安全性。方法选取2013年1月-2016年1月于我院接受带股方肌蒂骨瓣移植手术的患者96例作为研究对象,参照世界骨循环研究学会分期标准将患者分为Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期3个分期,... 目的研究分析带股方肌蒂骨瓣移位治疗成人股骨头缺血性坏死的疗效及安全性。方法选取2013年1月-2016年1月于我院接受带股方肌蒂骨瓣移植手术的患者96例作为研究对象,参照世界骨循环研究学会分期标准将患者分为Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期3个分期,并分别研究对比3个分期疗效及安全性情况。结果 3个不同分期的患者治疗后Harris评分均要显著高于治疗前,差异有统计学意义(P<0.05)。随着年龄的增长,愈合速度呈明显的延长趋势,差异有统计学意义(P<0.05)。随着患者临床分期的加深,患者治疗的优良率呈明显的下降趋势,差异有统计学意义(P<0.05)。观察不同分期患者并发症情况,结果无明显差异,证明带股方肌蒂骨瓣移植较为安全有效,差异有统计学意义(P<0.05)。结论带股方肌蒂骨瓣移位治疗股骨头缺血性坏死具有十分显著的疗效,患者恢复时间较快,是一种值得肯定的手术方法。 展开更多
关键词 带股方肌蒂 移植 股骨头坏死
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脊髓损伤大鼠触液神经元中p75NTR的表达 被引量:1
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作者 王栋 谢斌华 +3 位作者 张慧芊 吕谨南 王硕 李青 《中国脊柱脊髓杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第4期361-367,共7页
目的 :探讨大鼠触液神经元(cerebrospinal fluid-contacting neurons,CSF-CNs)p75神经营养因子受体(p75 neurotrophin receptor,p75NTR)在脊髓损伤后的表达变化。方法 :成年雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠36只,按随机数字表法分为正常对照... 目的 :探讨大鼠触液神经元(cerebrospinal fluid-contacting neurons,CSF-CNs)p75神经营养因子受体(p75 neurotrophin receptor,p75NTR)在脊髓损伤后的表达变化。方法 :成年雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠36只,按随机数字表法分为正常对照组(6只)、假手术组(6只)和脊髓损伤组(24只),脊髓损伤组采用Allen′s打击模型(10g×3cm)在大鼠脊髓T10段造成急性脊髓损伤,分别于损伤3d、1周、2周、4周后进行取材;对照组不做任何处理,假手术组只暴露脊髓,不击伤脊髓。对各组大鼠运动功能行BBB评分,各时间点取材行病理切片HE染色观察。取材前48h侧脑室注射霍乱毒素B亚单位与辣根过氧化物酶复合物(CB-HRP)特异性标记触液神经元。处死大鼠后,取损伤的脊髓节段10mm,用免疫荧光双标法检测触液神经元p75NTR的表达,ImagePro Plus计数目标神经元CB-HRP/p75双阳性细胞的数目。结果 :假手术组各时间点BBB评分均为21.0±0;脊髓损伤组在术后3d、1周、2周、4周各时间点BBB评分分别为3.20±0.81、10.73±1.02、12.48±1.86、13.29±1.93,两组各时间点差异均具有统计学意义(P<0.05)。HE染色可见正常对照组和假手术组脊髓组织结构完整,细胞形态正常;脊髓损伤组脊髓组织结构紊乱,神经元变性坏死,胶质细胞增生,胶质瘢痕和脊髓空洞形成。免疫荧光双标示正常对照组和假手术组可见少量CB-HRP/p75双阳性细胞,计数分别为5.16±0.55、4.31±0.61,两组比较差异无统计学意义(P>0.05);脊髓损伤组伤后3d、1周、2周CB-HRP/p75双阳性细胞数分别为13.35±1.53、21.68±2.15、16.26±2.09,与正常对照组和假手术组比较差异均有统计学意义(P<0.05),伤后4周时,CB-HRP/p75双阳性细胞数为4.83±0.73,与正常对照组和假手术组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 :p75NTR可在大鼠脊髓触液神经元中表达,且在脊髓损伤后表达增加,触液神经元可能通过p75NTR参与脊髓损伤的修复过程。 展开更多
关键词 脊髓损伤 触液神经元 P75神经营养因子受体
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基础到临床:miRNA调控Wnt信号通路影响骨质疏松症的现状 被引量:5
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作者 李玮民 李豪(综述) +1 位作者 杨城 王春庆(审校) 《医学研究与战创伤救治》 CAS 北大核心 2023年第4期416-424,共9页
骨质疏松症(OP)是由于骨量减少及骨微观结构破坏引起的一类全球常见的代谢性骨病。微小RNA(miRNA)是一类不编码蛋白质的内源性小RNA分子,可以通过多种机制影响其他基因的表达。Wnt信号通路是一条在生物进化中高度保守的通路,影响着干细... 骨质疏松症(OP)是由于骨量减少及骨微观结构破坏引起的一类全球常见的代谢性骨病。微小RNA(miRNA)是一类不编码蛋白质的内源性小RNA分子,可以通过多种机制影响其他基因的表达。Wnt信号通路是一条在生物进化中高度保守的通路,影响着干细胞更新、细胞的增殖与分化等。miRNA可通过调控Wnt信号通路进一步调节整个成骨细胞谱系的定向分化,在OP发病及治疗过程中起关键作用。文章详细分析miRNA通过Wnt信号通路对OP的调节机制,深入了解miRNA在OP中的作用,针对其临床转化运用作出展望,以求进一步探索miRNA通过调控Wnt信号通路治疗OP的可行性。文章主要就多种miRNA通过Wnt信号通路对OP的影响的分子机制进行综述。 展开更多
关键词 骨质疏松症 成骨细胞 破骨细胞 微小RNA WNT信号通路
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灭菌中药敷贴预防骨折患者外固定针道感染的效果研究 被引量:2
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作者 吴成莉 王锐霞 +4 位作者 刘林 姚山川 吴杰 周业红 刘颖清 《护理学杂志》 CSCD 北大核心 2023年第17期70-73,共4页
目的探讨灭菌中药敷贴预防骨折外固定治疗患者针道感染的效果。方法选取47例临时外固定治疗的骨折患者,随机分配到试验组24例和对照组23例。试验组采用无菌中药敷贴贴于针道处,7 d更换1次;对照组使用灭菌纱布覆盖针道,以75%乙醇将纱布浸... 目的探讨灭菌中药敷贴预防骨折外固定治疗患者针道感染的效果。方法选取47例临时外固定治疗的骨折患者,随机分配到试验组24例和对照组23例。试验组采用无菌中药敷贴贴于针道处,7 d更换1次;对照组使用灭菌纱布覆盖针道,以75%乙醇将纱布浸湿,每天2次,每3天更换纱布1次。比较两组针道感染率、针道局部疼痛程度及不良事件发生情况,检测白细胞计数(WBC)、C-反应蛋白值进行效果评价。结果试验组针道感染率为4.17%,对照组为26.09%,两组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。试验组干预后第3~7天针道局部疼痛程度显著低于对照组(均P<0.05)。两组干预后第7天C-反应蛋白值比较,差异有统计学意义(P<0.05)。试验组未发生不良事件,对照组2例发生针道周围皮肤过敏,均无严重不良事件发生。结论采用中药敷贴应用于外固定针道护理,可有效预防外固定针道感染,降低患者疼痛程度,中药敷贴用于外固定针道护理的效果显著。 展开更多
关键词 骨折 外固定 针道感染 中药敷贴 乙醇 护理
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BMSCs分泌的miR-125b通过外泌体途径对体外成骨分化的影响
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作者 陈超 李昊天 +3 位作者 王槐骏 杨城 李玮民 王春庆 《中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志》 CSCD 北大核心 2023年第4期345-353,共9页
目的研究骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分泌的miR-125b是否通过外泌体途径抑制其体外成骨分化。方法提取BMSCs原代,通过流式细胞仪进行其表面抗原(CD45、CD90)的鉴定来确定纯度,分别进行成骨诱导,茜素红... 目的研究骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分泌的miR-125b是否通过外泌体途径抑制其体外成骨分化。方法提取BMSCs原代,通过流式细胞仪进行其表面抗原(CD45、CD90)的鉴定来确定纯度,分别进行成骨诱导,茜素红染色检测成骨效果;成脂诱导,油红染色检测成脂效果。检测P3代上清液外泌体标志性蛋白CD9、CD63的表达量,电镜下观察确定外泌体提取成功。成骨诱导后的第0、7、14、21天进行qRT-PCR测定外泌体内miR-125b及细胞内碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、Runx2的mRNA的表达量。BMSCs侵染miR-125b模拟物及模拟物阴性对照剂,miR-125b抑制剂及其抑制物阴性对照剂,转染后验证转染效率。转染后五组(前四组+生理盐水空白对照组)细胞上清液外泌体提取,提取后与BMSCs共培养,继续成骨诱导48 h,qPCR及蛋白质免疫印迹(Western Blot)分别测定BMSCs细胞ALP、Runx2、miR-125b的表达量。结果(1)成功分离的BMSCs向成脂、成骨分化。(2)成骨诱导分化期间,P3代BMSCs的成骨标志基因ALP mRNA表达量明显增加,Runx2基因的表达趋势与其相同,而在上清液所提取的外泌体中,miR-125b趋势相反,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)转染后共培养组中模拟物组较模拟物阴性对照组其成骨标志基因ALP、Runx2 mRNA和ALP蛋白表达显著下降,而抑制组较抑制剂阴性对照组其成骨基因ALP、Runx2 mRNA和ALP蛋白表达显著上升,差异有统计学意义(P<0.05)。结论BMSCs来源miR-125b能通过外泌体途径抑制其体外成骨分化。 展开更多
关键词 骨髓间充质干细胞 外泌体 miR-125b 成骨分化
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