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1株李斯特菌噬菌体的分离、保存及生物学特性研究 被引量：2
1
作者 刘凌云 毛盼 +5 位作者 陈晋妮 李玲玲 王艳 宋敬东 陈峥宏 叶长芸 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期435-441,共7页
目的从食品销售环境样本中分离李斯特菌噬菌体,并对分离获得的噬菌体进行电镜形态观察、宿主谱及生物学特征分析。方法采用双层琼脂平板法和点滴法,以分离的英诺克李斯特菌Lin08作为宿主菌,成功分离并鉴定出一株烈性噬菌体LMLPA5,使用... 目的从食品销售环境样本中分离李斯特菌噬菌体,并对分离获得的噬菌体进行电镜形态观察、宿主谱及生物学特征分析。方法采用双层琼脂平板法和点滴法,以分离的英诺克李斯特菌Lin08作为宿主菌,成功分离并鉴定出一株烈性噬菌体LMLPA5,使用透射电镜观察噬菌体形态,并测定噬菌体的宿主谱、最佳感染复数(MOI)、一步生长曲线以及理化稳定性,同时探索噬菌体在4℃、-20℃及-80℃下的保存效果。结果分离获得的LMLPA5噬菌体属于肌尾噬菌体科,其形成的噬菌斑清晰透明,周围无晕环。该噬菌体为广谱的李斯特菌烈性噬菌体,能裂解多个李斯特菌种及单增李斯特菌多个血清型菌株。LMLPA5的最佳MOI为0.1,潜伏期为10 min,平均裂解量为95.2 PFU/cell。LMLPA5对高温较敏感,在70℃暴露1 h即完全失活,而在4℃~40℃作用32 h以上噬菌体仍能保持稳定。在pH为4~10 LMLPA5的活性不受影响,经紫外线照射60 min后噬菌体被完全灭活。LMLPA5对氯仿不敏感,为无囊膜型噬菌体。噬菌体在4℃及-80℃的保存效果较好,可稳定保存8个月以上。结论本研究获得的1株广谱李斯特菌肌尾噬菌体LMLPA5具有较强的裂解能力、抵抗力和稳定性,为进一步的应用提供了基础。 展开更多
关键词 李斯特菌噬菌体 裂性噬菌体 生物学特性
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具备高效CRISPR协同激活活性的HIEC6-dCas9-SAM稳转细胞株构建 被引量：1
2
作者 任柱平 杨泰然 +4 位作者 雷元三 金留飞 崔古贞 田益明 陈峥宏 《生物技术通报》 北大核心 2025年第5期52-61,共10页
【目的】以人正常肠道上皮细胞(HIEC6)为研究模型,建立具有高水平转录激活活性的HIEC6-dCas9-SAM单克隆细胞株,为利用CRISPR激活(CRISPRactivation,CRISPRa)系统筛选人类肠道疾病发生发展相关关键基因和探究分子致病机制提供细胞工具。... 【目的】以人正常肠道上皮细胞(HIEC6)为研究模型,建立具有高水平转录激活活性的HIEC6-dCas9-SAM单克隆细胞株,为利用CRISPR激活(CRISPRactivation,CRISPRa)系统筛选人类肠道疾病发生发展相关关键基因和探究分子致病机制提供细胞工具。【方法】首先利用PiggyBac转座子系统构建HIEC6-dCas9-SAM多克隆细胞;然后通过有限稀释法筛选单克隆细胞株,并使用免疫印迹、间接免疫荧光法鉴定单克隆细胞株中dCas9-SAM蛋白(dCas9、VP64、MS2、HSF1、p65)的表达情况;最后利用CRISPRa荧光报告系统和构建包装特定靶基因sgRNA慢病毒,检测所构建稳转株在转录和蛋白水平的CRISPR激活效率。【结果】成功获得两株HIEC6-dCas9-SAM单克隆细胞,两株细胞均能高水平稳定表达dCas9-SAM蛋白。CRISPRa荧光报告系统检测显示,两株HIEC6-dCas9-SAM稳转细胞的激活效率分别高达96.7%、99.0%。靶基因激活功能验证显示,在转录水平,两株HIEC6-dCas9-SAM稳转细胞中靶基因APN的转录激活水平分别高达2725倍和4521倍,SLC35A1基因的转录激活水平分别为27.5倍和18.1倍;在蛋白水平,APN蛋白的激活效率分别高于12.9倍和11.2倍,SLC35A1蛋白的激活效率分别为1.32倍和0.97倍。两株单克隆稳转细胞均表现出较高的转录激活活性。【结论】成功构建两株具有高水平CRISPR转录激活活性的HIEC6-dCas9-SAM单克隆稳转细胞,为后续基于CRISPRa系统筛选人类肠道疾病发生发展相关关键基因和探究分子致病机制提供了重要细胞工具。 展开更多
关键词 dCas9-SAM HIEC6细胞 CRISPR激活 稳转细胞株
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拐枣提取物的活性成分及肠道菌群调节作用研究
3
作者 蒙紫鑫 陈峥宏 吴道艳 《中国测试》 北大核心 2025年第6期114-122,共9页
拐枣富含多酚,该文研究了拐枣甲醇提取物的活性成分和益生功能,为拐枣甲醇提取物的开发利用提供参考。利用气相色谱/质谱(GC/MS)和高效液相色谱(HPLC)技术结合体外发酵模型,对拐枣甲醇提取物的活性成分及肠道菌群调节作用进行分析测试... 拐枣富含多酚,该文研究了拐枣甲醇提取物的活性成分和益生功能,为拐枣甲醇提取物的开发利用提供参考。利用气相色谱/质谱(GC/MS)和高效液相色谱(HPLC)技术结合体外发酵模型,对拐枣甲醇提取物的活性成分及肠道菌群调节作用进行分析测试。结果表明,在拐枣甲醇提取物中检测到7-羟基-4-甲氧基甲基香豆素、(4-溴-2-氯苯氧基)乙酸、胸苷、西伯利亚远志糖A6等主要化学组分;定量检测到可增强拐枣甲醇提取物抗氧化能力的没食子酸、阿魏酸、香草酸、儿茶素等酚类物质。拐枣甲醇提取物可促进肠道益生菌的增殖,提高肠道菌群代谢物短链脂肪酸(SCFAs)的含量。综上,拐枣甲醇提取物具有多种活性成分,对肠道菌群有调节作用,研究结果有望挖掘其在肠道健康和产品开发领域的应用潜力。 展开更多
关键词 拐枣 活性成分 多酚 肠道菌群 短链脂肪酸
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水疱性口炎病毒对小鼠乳腺癌4T1细胞荷瘤小鼠抗肿瘤免疫、移植瘤生长与肺转移的影响
4
作者 李玉迁 徐庆胜 +4 位作者 魏洪 王皞 王硕石 蒋立娜 袁心怡 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期452-461,共10页
目的:探究野生型水疱性口炎病毒印第安纳株(VSV-IN)对小鼠三阴性乳腺癌4T1细胞移植模型小鼠的免疫调节及肿瘤转移的影响。方法:VSV以MOI=1、MOI=10、MOI=100感染4T1细胞12、24、48 h后,CCK-8法检测4T1细胞死亡率,划痕愈合实验检测细胞... 目的:探究野生型水疱性口炎病毒印第安纳株(VSV-IN)对小鼠三阴性乳腺癌4T1细胞移植模型小鼠的免疫调节及肿瘤转移的影响。方法:VSV以MOI=1、MOI=10、MOI=100感染4T1细胞12、24、48 h后,CCK-8法检测4T1细胞死亡率,划痕愈合实验检测细胞迁移能力,qPCR检测细胞中E-cadherin、MMP-2、MMP-9 mRNA的表达。于雌性BALB/c小鼠脂肪垫接种1×10^(6)个/mL的4T1细胞0.1 mL,构建4T1细胞荷瘤小鼠模型,待小鼠肿瘤体积达200 mm3,分别向移植瘤内注射PBS、紫杉醇(TAX)(15 mg/kg)、VSV-IN(1×10^(6)pfu/只),每周1次。给药4次后,处死小鼠、剥离完整移植瘤组织,测量肿瘤体积及质量,肺组织病理切片经H-E染色后观察肿瘤肺部转移结节,流式细胞术检测脾组织中T细胞亚群比例,ELISA法检测小鼠血清IL-6及TNF-α水平,利用GEPIA在线分析乳腺肿中迁移相关蛋白mRNA的表达,免疫组化法检测肿瘤中MMP-2、MMP-9与E-cadherin的表达,利用蛋白-蛋白对接技术预测VSV-IN的G蛋白、M蛋白与ERK2、E-cadherin的亲和力。结果:经MOI=10、100的VSV-IN处理48 h后,4T1细胞死亡率显著高于对照组(均P<0.01);与对照组相比,VSV-IN组(MOI=10)细胞迁移率明显降低(P<0.01),MMP-9 mRNA的相对表达量明显降低(P<0.05);与对照组小鼠相比,VSV-IN组移植瘤生长较对照组减缓且终点体积显著减小(P<0.05),VSV-IN组小鼠肺转移结节数量显著减少[(12.86±1.86)vs(24±3.67)个,P<0.01],脾内CD4^(+)T、CD8^(+)T细胞比例显著升高(均P<0.05),血清TNF-α、IL-6含量显著升高(均P<0.01);GEPIA分析发现在乳腺癌中E-cadherin、MMP-9表达水平均高于癌旁组织(P<0.05);VSV-IN组小鼠肿瘤细胞内MMP-9表达明显低于对照组(P<0.05);VSV-IN的G、M蛋白与ERK2的结合自由能分别为–11.7 kcal/mol、–6.4 kcal/mol。结论:野生型VSV-IN可抑制4T1细胞荷瘤小鼠的移植瘤生长及转移,这可能与其促进抗肿瘤免疫及调控迁移相关蛋白表达有关。 展开更多
关键词 野生型水疱性口炎病毒 三阴性乳腺癌 4T1细胞 迁移 蛋白-蛋白对接
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幽门螺杆菌katA基因功能及其在耐受氧化损伤中的作用分析
5
作者 王鑫鑫 管玉祝 +6 位作者 李晓苇 洪伟 吴道艳 康颖倩 刘永畅 陈峥宏 崔古贞 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期310-320,共11页
【目的】过氧化氢酶(KatA)是幽门螺杆菌编码的重要毒力因子,在抵抗宿主免疫杀伤和疫苗研发等方面具有重要功能。为了鉴定幽门螺杆菌KatA的酶学特性,并分析其在幽门螺杆菌氧化耐受中的功能。【方法】首先,从幽门螺杆菌临床耐药菌株Hp_G27... 【目的】过氧化氢酶(KatA)是幽门螺杆菌编码的重要毒力因子,在抵抗宿主免疫杀伤和疫苗研发等方面具有重要功能。为了鉴定幽门螺杆菌KatA的酶学特性,并分析其在幽门螺杆菌氧化耐受中的功能。【方法】首先,从幽门螺杆菌临床耐药菌株Hp_G272基因组中分离katA基因,并在大肠杆菌中克隆表达、分离纯化KatA^(G272)蛋白;然后,利用CAT检测试剂盒体外分析KatA^(G272)的过氧化氢酶活性;其次,利用同源重组技术构建katA基因工程菌株,包括敲除菌株和回补菌株;最后,通过比较野生菌株与工程菌株生长表型差异、分解过氧化氢能力差异及耐受过氧化氢能力差异,阐述katA基因的功能及其在幽门螺杆菌耐受氧化损伤中的作用。【结果】在大肠杆菌中成功克隆表达并分离纯化KatA^(G272),体外酶学分析表明,KatA^(G272)是一类嗜酸性过氧化氢酶,基因敲除分析表明,敲除该基因幽门螺杆菌丧失分解和耐受过氧化氢的能力,而回补该基因幽门螺杆菌回复分解和耐受过氧化氢的能力。【结论】katA基因是幽门螺杆菌分解和耐受过氧化氢的唯一功能基因,在幽门螺杆菌氧化耐受中具有重要功能。 展开更多
关键词 幽门螺杆菌 过氧化氢酶 KATA 耐受性 克隆表达 基因敲除
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胃黏膜组织中恶臭假单胞菌临床意义的探讨 被引量：4
6
作者 印琳 刘芳 +8 位作者 郭长城 王琼 杨杰 潘科 潘晨 熊妍 陈颖婷 方文 陈峥宏 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第12期1102-1107,1113,共7页
目的探索恶臭假单胞菌在幽门螺杆菌感染相关胃肠疾病中的意义。方法采集14 C尿素呼气试验阳性患者病变胃黏膜354例,进行细菌的分离培养。根据菌落形态、革兰染色、尿素酶试验及幽门螺杆菌特异性16SrRNA基因片段的PCR进行幽门螺杆菌的鉴... 目的探索恶臭假单胞菌在幽门螺杆菌感染相关胃肠疾病中的意义。方法采集14 C尿素呼气试验阳性患者病变胃黏膜354例,进行细菌的分离培养。根据菌落形态、革兰染色、尿素酶试验及幽门螺杆菌特异性16SrRNA基因片段的PCR进行幽门螺杆菌的鉴定,同时提取胃黏膜组织DNA,通过幽门螺杆菌特异性PCR进行快速诊断。将非幽门螺杆菌转种于营养琼脂培养基,进行快速尿素酶试验。尿素酶阳性的非幽门螺杆菌染色体DNA利用细菌16SrRNA基因通用引物进行PCR扩增、测序及序列比对。使用全自动细菌鉴定仪对经测序比对为恶臭假单胞菌的菌株进行鉴定。采用K-B纸片扩散法进行药物敏感性试验。结果从354例样本中分离出革兰阴性、尿素酶阳性的恶臭假单胞菌10株,经16SrRNA基因测序和序列比对,与GenBank中恶臭假单胞菌的相似性≥98%。10株恶臭假单胞菌的胃黏膜标本中,6例标本幽门螺杆菌特异性PCR为阳性,4例为阴性。传代存活的7株恶臭假单胞菌的K-B法药物敏感试验显示对左氧氟沙星均敏感,1株对四环素敏感,5株对阿莫西林耐药,6株对克拉霉素耐药,7株对甲硝唑、氨苄青霉素均耐药。7株菌经全自动细菌生化鉴定仪鉴定结果均为恶臭假单胞菌。结论病变胃黏膜中分离出尿素酶阳性且对治疗幽门螺杆菌感染的多种抗生素耐药;可能造成临床上14 C-尿素呼气试验假阳性,并继发感染影响胃肠疾病的进展。 展开更多
关键词 恶臭假单胞菌 培养 尿素酶 16SrRNA 耐药性
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噬菌体治疗泛耐药肺炎克雷伯菌肺部感染的临床应用及效果初探 被引量：19
7
作者 李莉莎 李建辉 +4 位作者 何斌 吴楠楠 朱同玉 郭晓奎 陈峥宏 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2021年第9期1272-1276,共5页
目的·探讨使用噬菌体雾化吸入治疗泛耐药肺炎克雷伯菌肺部感染的用药频率及效果。方法·在治疗开始前1 h和使用噬菌体雾化吸入治疗肺部感染过程中每小时,取患者痰液样本进行细菌分离纯化及质谱鉴定,比较细菌裂解谱的异同;同时... 目的·探讨使用噬菌体雾化吸入治疗泛耐药肺炎克雷伯菌肺部感染的用药频率及效果。方法·在治疗开始前1 h和使用噬菌体雾化吸入治疗肺部感染过程中每小时,取患者痰液样本进行细菌分离纯化及质谱鉴定,比较细菌裂解谱的异同;同时,于治疗开始前1 h,第一次治疗开始后2、4 h取血液样本进行细菌培养及噬菌体量的测定。结果·噬菌体经雾化吸入后2 h在体内持续增殖,3 h后噬菌体量下降,4 h后进行第二次治疗,噬菌体在体内的增殖规律与第一次相同;第三次使用噬菌体治疗时,噬菌体仅有少量增殖。噬菌体治疗后患者痰液中仍分离到肺炎克雷伯菌,但分离株的噬菌体裂解谱发生了变化,患者临床症状改善。结论·噬菌体能够有效针对靶细菌进行杀灭并改善患者的临床症状。泛耐药肺炎克雷伯菌肺部感染患者经2次雾化吸入治疗即可达到噬菌体使用的最佳效果。噬菌体治疗后病原菌菌株发生了变化。 展开更多
关键词 噬菌体 泛耐药 肺炎克雷伯菌 治疗应用
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基于蛋白质组学技术探讨麻疹减毒活疫苗191株抑制三阴性乳腺癌细胞增殖的可能机制 被引量：4
8
作者 姚梦玮 李玉迁 +4 位作者 徐庆胜 方小菡 魏洪 迟茜文 刘蕊 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期568-576,共9页
目的:基于蛋白质组学技术探讨麻疹减毒活疫苗191株(MV-Hu191)在体内外对三阴性乳腺癌MDA-MB-231、4T1细胞的影响及其作用机制。方法:采用CCK-8法检测MV-Hu191对MDA-MB-231和4T1细胞增殖的影响;液相色谱-质谱联用技术分析MV-Hu191处理对M... 目的:基于蛋白质组学技术探讨麻疹减毒活疫苗191株(MV-Hu191)在体内外对三阴性乳腺癌MDA-MB-231、4T1细胞的影响及其作用机制。方法:采用CCK-8法检测MV-Hu191对MDA-MB-231和4T1细胞增殖的影响;液相色谱-质谱联用技术分析MV-Hu191处理对MDA-MB-231细胞中蛋白质谱的影响,多重数据库筛选蛋白质谱中的典型差异蛋白质并进行GO、KEGG、亚细胞定位与功能注释。瘤内注射1×106 TCID50 MV-Hu191干预4T1细胞移植瘤模型小鼠,流式细胞术检测小鼠脾组织中T细胞亚群,ELISA法检测小鼠血清TNF-α和IL-6含量。结果:体外实验结果表明,MV-Hu191具有抑制MDA-MB-231和4T1细胞增殖的作用,差异均具有统计学意义(P<0.01)。蛋白质组学分析结果显示,MV-Hu191作用MDA-MB-231细胞后明显上调蛋白质有38个、下调有12个;差异表达的蛋白质主要参与细胞黏附、信号受体激活、细胞代谢、应激反应等生物学过程,22个差异蛋白质亚细胞定位位于细胞外,KEGG功能分类显示与免疫调节功能相关的差异蛋白质最多且均为上调蛋白,包括C4A、C8B、SERPINF2、A2M、SERPINC1、CTSB、SERPING1、C5;PPI预测发现免疫相关差异蛋白与CD4、CD8、TNF-α及IL-6相互关联。体内实验结果显示,MV-Hu191干预组小鼠脾组织中CD4+T细胞数量略高于对照组,但差异无统计学意义(P>0.05),CD4+/CD8+T细胞比值明显高于对照组(P<0.05),血清TNF-α和IL-6含量显著上升(均P<0.01)。结论:MV-Hu191显著抑制MDA-MB-231、4T1细胞增殖及拮抗4T1细胞荷瘤小鼠成瘤性,其机制可能是MV-Hu191通过激活免疫效应分子实现抗肿瘤作用。 展开更多
关键词 麻疹溶瘤病毒 MV-Hu191 三阴性乳腺癌 MDA-MB-231细胞 4T1细胞 细胞增殖 蛋白质组学
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两种栽培方式对红托竹荪菌托不同部位成分的影响 被引量：9
9
作者 魏洪 姚梦玮 +3 位作者 迟茜文 翁梓靖 龙金宇 陈光贤 《中国果菜》 2021年第10期62-68,共7页
为研究不同栽培模式对红托竹荪菌托营养成分的影响,本实验比较了红托竹荪在林下和大棚两种栽培模式下,其菌托3个部位(菌皮、胶质和连接膜)的蛋白质、多糖、多酚、黄酮和氨基酸含量的差异。结果表明:红托竹荪菌托3个部位都含有蛋白质、... 为研究不同栽培模式对红托竹荪菌托营养成分的影响,本实验比较了红托竹荪在林下和大棚两种栽培模式下,其菌托3个部位(菌皮、胶质和连接膜)的蛋白质、多糖、多酚、黄酮和氨基酸含量的差异。结果表明:红托竹荪菌托3个部位都含有蛋白质、多糖、多酚、黄酮和氨基酸;大棚菌皮的蛋白质含量(22.516 g/100 g)和连接膜的蛋白质含量(22.708 g/100 g)显著高于林下菌皮和连接膜的(分别为19.995 g/100 g和19.861 g/100 g),总氨基酸和必需氨基酸含量高于林下;而林下菌皮和连接膜的多糖、多酚和黄酮含量则明显高于大棚菌皮和连接膜的。两种栽培模式下,菌皮和连接膜均测出15种氨基酸,且都含有苏氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、亮氨酸6种必需氨基酸。可见废弃菌托含有丰富的营养元素,且不同栽培方式下的营养成分不同,可根据其优势成分进行开发应用。 展开更多
关键词 红托竹荪 栽培方式 菌托 营养成分
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幽门螺杆菌6S RNA敲除菌株构建及对细胞毒性的影响 被引量：1
10
作者 崔古贞 管玉祝 +7 位作者 刘芳 王鑫鑫 吴道艳 洪伟 向松 张峥嵘 张玉典 陈峥宏 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第1期44-50,共7页
目的构建幽门螺杆菌6S RNA基因敲除菌株,研究6S RNA敲除后对细菌生长及细胞毒力的影响。方法以幽门螺杆菌6S RNA基因为靶基因,构建6S RNA敲除质粒;利用电转法转化幽门螺杆菌,利用同源重组机制构建6S RNA敲除菌株;分析6S RNA敲除对细菌... 目的构建幽门螺杆菌6S RNA基因敲除菌株,研究6S RNA敲除后对细菌生长及细胞毒力的影响。方法以幽门螺杆菌6S RNA基因为靶基因,构建6S RNA敲除质粒;利用电转法转化幽门螺杆菌,利用同源重组机制构建6S RNA敲除菌株;分析6S RNA敲除对细菌生长及细胞毒性的影响。结果成功构建幽门螺杆菌6S RNA基因敲除菌株,与野生型菌株相比,敲除菌株的生长方式显著改变,对GES-1胃粘膜上皮细胞的毒性显著降低。结论6S RNA具有调控幽门螺杆菌生长及毒力相关因子的功能,为幽门螺杆菌生物学功能及转录调控机制研究奠定了基础。 展开更多
关键词 幽门螺杆菌 6S RNA 转录调控 基因敲除
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