【目的】筛选牦牛卵泡发育过程中可能对靶向Smad家族成员4(Smad family member 4,Smad4)基因的bta-miR-146a具有“海绵吸附”作用的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)。【方法】使用miRanda和RNAhybrid数据库对靶向牦牛bta-miR...【目的】筛选牦牛卵泡发育过程中可能对靶向Smad家族成员4(Smad family member 4,Smad4)基因的bta-miR-146a具有“海绵吸附”作用的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)。【方法】使用miRanda和RNAhybrid数据库对靶向牦牛bta-miR-146a的lncRNA进行预测;采集牦牛卵巢,分离健康、闭锁卵泡,用Trizol法提取RNA并反转录为cDNA,利用PCR检测所预测lncRNA的表达情况;利用实时荧光定量PCR法检测所筛选lncRNA和bta-miR-146a/Smad4在牦牛健康、闭锁卵泡中的表达情况;构建lncRNA-ENSBGRT00000000387.1的野生型和突变型双荧光素酶载体,将其与bta-miR-146a-mimics、mimics NC共转染至HEK293T细胞,检测双荧光素酶活性。【结果】试验共筛选出7个可能对靶向Smad 4基因的bta-miR-146a具有“海绵吸附”作用的lncRNAs,其中的lncRNA-ENSBGRT00000000387.1在牦牛卵泡中表达量极显著高于其他lncRNAs(P<0.01)。实时荧光定量PCR检测发现,lncRNA-ENSBGRT00000000387.1、bta-miR-146a和Smad 4基因mRNA在牦牛健康和闭锁卵泡中共表达,且lncRNA-ENSBGRT00000000387.1和Smad 4基因mRNA在牦牛健康卵泡中的表达量均显著高于闭锁卵泡(P<0.05),bta-miR-146a在牦牛健康卵泡中的表达量极显著低于闭锁卵泡(P<0.01)。试验成功构建牦牛lncRNA-ENSBGRT00000000387.1野生型及突变型pmirGLO双荧光素酶报告质粒,双荧光素酶活性结果显示,bta-miR-146a mimics对牦牛lncRNA-ENSBGRT00000000387.1-WT具有极显著下调作用(P<0.01)。【结论】lncRNA-ENSBGRT00000000387.1、bta-miR-146a和Smad 4基因mRNA可能在牦牛卵泡发育或闭锁过程中存在调控机制,并在体外初步证实lncRNA-ENSBGRT00000000387.1与bta-miR-146a具有“海绵吸附”作用,这为进一步研究lncRNA-ENSBGRT00000000387.1在牦牛卵泡中的功能机制提供依据。展开更多
