HEK293细胞悬浮培养技术及其应用研究进展

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作者 岳欣豫 吉雯娜 +7 位作者 周锦鱼 靳莉武 杨迪 刘振斌 孙娜 乔自林 马忠仁 王家敏 《生物技术通报》 北大核心 2025年第8期82-91,共10页

生物制药产品的生产主要依赖于哺乳动物细胞,尤其是在制造复杂的蛋白质药物,因为其能够进行复杂的翻译后修饰(post-translational modifications, PTMs),对于蛋白质的功能和稳定性至关重要,一些生物制药商品如重组治疗蛋白、疫苗、抗癌... 生物制药产品的生产主要依赖于哺乳动物细胞,尤其是在制造复杂的蛋白质药物,因为其能够进行复杂的翻译后修饰(post-translational modifications, PTMs),对于蛋白质的功能和稳定性至关重要,一些生物制药商品如重组治疗蛋白、疫苗、抗癌药物和其他临床相关药物等大多数都是利用了哺乳动物细胞平台生产。HEK293细胞(human embryonic kidney 293 cells)是所有人类细胞系中最常用的宿主细胞之一,但由于贴壁细胞在生产应用中的高投资成本,以及血清添加有可能携带的外源风险等问题,导致其最初在生产应用方面受到限制,而HEK293悬浮细胞相比于贴壁细胞更具优势,其不仅生产成本大大降低,没有血清的添加更增加了生产生物制品的安全性。目前,HEK293悬浮细胞已广泛应用于多个领域,并已成为生产蛋白质、疫苗和基因治疗药物的强大载体和新平台。本文综述了HEK293细胞的来源及其衍生细胞系,总结目前贴壁细胞的悬浮驯化技术以及用于HEK293细胞的无血清培养基,并描述目前HEK293细胞在疫苗生产、基因治疗药物生产以及实验室基础研究方面的应用进展,讨论了HEK293细胞大规模生产的意义及存在的问题,最后对未来HEK293细胞的研究方向以及大规模生产的应用前景进行展望。 展开更多

关键词 HEK293细胞 悬浮驯化 生物制药

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MDCK细胞无血清悬浮培养技术在流感疫苗研究与生产中的应用进展 被引量：2

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作者 靳莉武 张震宇 +4 位作者 靳冬武 马花 马玉梅 乔自林 王家敏 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期38-47,共10页

流感是一种常见的呼吸道疾病,由流感病毒引起,接种疫苗是预防流感的有效手段。MDCK细胞(Madin-Darby Canine Kidney Cells)具有易于培养和高产量的特点,可以支持流感病毒的复制和增殖,被广泛用于流感疫苗的研究和生产。随着对流感病毒... 流感是一种常见的呼吸道疾病,由流感病毒引起,接种疫苗是预防流感的有效手段。MDCK细胞(Madin-Darby Canine Kidney Cells)具有易于培养和高产量的特点,可以支持流感病毒的复制和增殖,被广泛用于流感疫苗的研究和生产。随着对流感病毒研究的不断深入,为了进一步拓展MDCK细胞用于流感病毒研究和工业应用的能力,研究人员开始发展MDCK细胞无血清全悬浮培养技术。通过长期的培养和优化,驯化的MDCK悬浮细胞株可以更好地适应流感病毒的生长环境,提高流感病毒的产量和感染性。总之,MDCK细胞无血清悬浮培养技术在流感病毒研究和工业应用中发挥着重要作用,为流感疫苗生产和抗流感药物研发提供更好的工具。同时也必须重视MDCK细胞的安全性,采取合适的措施来确保其应用的安全性和可靠性。 展开更多

关键词 MDCK细胞 细胞悬浮驯化 无血清培养基 流感疫苗 安全性

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杆状病毒-昆虫表达系统(IBEVS)表达的动物病毒样颗粒及疫苗研究进展 被引量：1

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作者 王炎 高婉宁 +3 位作者 范益阳 玉妹 张德荣 柏家林 《江苏农业学报》 北大核心 2025年第1期203-208,共6页

杆状病毒-昆虫表达系统(IBEVS)是一种高效的外源蛋白表达平台,具有可以容纳较大的外源基因片段、蛋白质表达量较高、支持蛋白质翻译后修饰、操作简便且安全性较高等优势,已被广泛用于兽用疫苗生产。病毒样颗粒(VLP)是一种由病毒蛋白自... 杆状病毒-昆虫表达系统(IBEVS)是一种高效的外源蛋白表达平台,具有可以容纳较大的外源基因片段、蛋白质表达量较高、支持蛋白质翻译后修饰、操作简便且安全性较高等优势,已被广泛用于兽用疫苗生产。病毒样颗粒(VLP)是一种由病毒蛋白自组装形成的纳米颗粒,由于缺乏病毒遗传物质,其安全性较高。VLP表面抗原排列高度有序,可有效诱导免疫反应,是一种新型的亚单位疫苗。本文综述了IBEVS在动物VLP疫苗中的应用现状,分析了当前IBEVS存在的问题及其解决策略,为动物VLP疫苗的进一步开发提供参考。 展开更多

关键词 病毒样颗粒 杆状病毒-昆虫表达系统(IBEVS) 动物病毒样颗粒疫苗

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基于NGS技术的4种绵羊品种微卫星标记开发与鉴定 被引量：1

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作者 陈天莹 海春花 +2 位作者 张俊哲 颜海藩 李铀 《现代畜牧兽医》 2025年第2期15-20,共6页

研究旨在开发绵羊基因组微卫星标记,为绵羊品种的保护及遗传学研究提供有效的分子标记。研究通过二代测序方法为4个中国本土绵羊品种(兰州大尾羊、滩羊、藏羊和小尾寒羊)开发了24个微卫星标记,并使用24个标记分别对采集自甘肃省的11只... 研究旨在开发绵羊基因组微卫星标记,为绵羊品种的保护及遗传学研究提供有效的分子标记。研究通过二代测序方法为4个中国本土绵羊品种(兰州大尾羊、滩羊、藏羊和小尾寒羊)开发了24个微卫星标记,并使用24个标记分别对采集自甘肃省的11只兰州大尾羊、19只滩羊、30只藏羊和12只小尾寒羊进行了筛选。结果显示,在4个绵羊品种中,每个位点的等位基因数为2~11个(平均为4个)。经Bonferroni校正后,有几个位点明显偏离哈代-温伯格平衡(兰州大尾羊2个、滩羊9个、藏羊7个、小尾寒羊2个),这可能是非随机交配的结果。研究表明,试验开发出的标记准确有效,具有较高多态性,可用于中国本土绵羊品种的遗传学研究和遗传管理。 展开更多

关键词 微卫星 兰州大尾羊 滩羊 藏羊 小尾寒羊 绵羊保护品种

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动物细胞永生化研究进展 被引量：2

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作者 张震宇 靳莉武 +4 位作者 王婧尊 田玲 乔自林 杨迪 阿依木古丽·阿不都热依木 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期78-89,共12页

细胞永生化是指通过各种手段、方式来突破原代细胞衰老的限制,延长细胞寿命,实现细胞无限复制增殖,是当前生物医学领域研究的一个热点与难点。永生化细胞株/系可用于生物制品研发、衰老机制探索以延伸生命等;然而目前永生化细胞种类不... 细胞永生化是指通过各种手段、方式来突破原代细胞衰老的限制,延长细胞寿命,实现细胞无限复制增殖,是当前生物医学领域研究的一个热点与难点。永生化细胞株/系可用于生物制品研发、衰老机制探索以延伸生命等;然而目前永生化细胞种类不多、永生化技术相对较难,肿瘤风险以及动物福利伦理等原因,还不能满足研发需求。目的细胞永生化不仅可以永久保存动物细胞遗传资源,还对多种疾病的诊断、治疗及细胞基质疫苗的研发等提供支持。本文就动物细胞永生化的原理、永生化机制及方法的研究最新进展进行综述,为未来的生物医学研究和应用提供参考。 展开更多

关键词 动物细胞 细胞永生化 永生化机制 永生化方法

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病毒样颗粒在肿瘤治疗中的应用研究进展及展望

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作者 刘春 陈国心 +3 位作者 李梦甜 赵钰 马忠仁 张海霞 《中国癌症杂志》 北大核心 2025年第6期585-591,共7页

病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)是由一种或几种病毒结构蛋白组合而成的中空纳米颗粒,其形态结构与天然病毒极其相似,但不包含任何遗传物质。因VLP具有良好的天然免疫原性和安全性,故常被用于肿瘤疫苗的开发。此外,与传统的药物递... 病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)是由一种或几种病毒结构蛋白组合而成的中空纳米颗粒,其形态结构与天然病毒极其相似,但不包含任何遗传物质。因VLP具有良好的天然免疫原性和安全性,故常被用于肿瘤疫苗的开发。此外,与传统的药物递送载体相比,VLP具有较好的生物相容性,且靶向性强,使得VLP在递送抗肿瘤药物方面备受关注。近年来利用VLP高效递送基因编辑工具,为肿瘤治疗提供了新的可能。VLP可以通过多种机制来抑制肿瘤生长和转移,如VLP可通过激活免疫应答来抑制肿瘤的生长,通过激发机体的免疫系统,促进肿瘤相关抗原的表达,从而增强机体对肿瘤细胞的识别和清除能力等。本文介绍基于不同病毒来源的VLP在预防性或治疗性疫苗以及药物递送载体方面的应用研究进展,并探讨新的开发策略。这些研究不仅可拓宽VLP在抗肿瘤领域的应用范围,也将为未来的研究与应用展现更广阔的前景。 展开更多

关键词 病毒样颗粒 药物递送载体 抗肿瘤药物 肿瘤疫苗

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MDCK细胞成瘤相关蛋白的筛选及验证

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作者 张凡 胡嘉琦 +5 位作者 敖慧娟 李睿 蓝雯琳 谈笑 乔自林 杨琨 《江苏农业学报》 北大核心 2025年第10期2009-2017,共9页

为明确Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞成瘤机制,本研究基于数据非依赖性采集质谱(DIA-MS)技术,以非成瘤性MDCK细胞与高成瘤性MDCK细胞为供试材料,分析不同成瘤性MDCK细胞的蛋白质表达差异。结果表明,非成瘤性MDCK细胞与高成瘤性MDCK细胞中... 为明确Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞成瘤机制,本研究基于数据非依赖性采集质谱(DIA-MS)技术,以非成瘤性MDCK细胞与高成瘤性MDCK细胞为供试材料,分析不同成瘤性MDCK细胞的蛋白质表达差异。结果表明,非成瘤性MDCK细胞与高成瘤性MDCK细胞中共鉴定到11359个蛋白质,其中差异倍数(FC)>1.5且校正P<0.05的差异蛋白质数量为163个。非成瘤性MDCK细胞中93个差异蛋白质上调表达,70个差异蛋白质下调表达。差异蛋白质主要参与蛋白质磷酸化、胞内信号转导及肽酶活性负调控,且功能富集于细胞外空间。2个成瘤关键蛋白质双皮质素样激酶1(DCLK1)和组织因子通路抑制因子2(TFPI2)的实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹(Western blot)结果显示,非成瘤性MDCK细胞中,DCLK1基因相对表达水平极显著低于成瘤性MDCK细胞,TFPI2基因相对表达水平极显著高于成瘤性MDCK细胞。本研究结果为MDCK细胞成瘤机制及肿瘤标志物筛选提供了潜在分子调控靶点。 展开更多

关键词 MDCK细胞 数据非依赖性采集质谱(DIA-MS) 成瘤性 双皮质素样激酶1(DCLK1) 组织因子途径抑制剂2(TFPI2)

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角蛋白酶对牛血液蛋白的酶解效果研究

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作者 李金浩 文涛 +3 位作者 李岩 高钰涵 蓝本翔 周雪雁 《现代畜牧兽医》 2025年第4期28-32,共5页

试验开展了家畜血液酶解的相关研究工作,以期为畜禽血液的合理处理提供参考。试验以牛血为样本,使用角蛋白酶进行血液酶解试验,选择角蛋白酶酶解牛血液蛋白的样本pH值、加酶量、酶解温度、酶解时间等4个因素进行单因素试验和正交试验,... 试验开展了家畜血液酶解的相关研究工作,以期为畜禽血液的合理处理提供参考。试验以牛血为样本,使用角蛋白酶进行血液酶解试验,选择角蛋白酶酶解牛血液蛋白的样本pH值、加酶量、酶解温度、酶解时间等4个因素进行单因素试验和正交试验,研究角蛋白酶在不同的酶解条件下对牛血液样本水解度的影响,并对酶解条件进行优化。结果显示,角蛋白酶酶解牛血液蛋白最佳酶解条件为样本pH值9、加酶量3.75%、酶解温度65℃、酶解时间28h,在该条件下角蛋白酶对牛血液蛋白的水解度为49.66%。研究表明,角蛋白酶对牛血液蛋白具有较好的酶解效果,可为畜禽血液合理回收利用、减少资源浪费、减轻环境污染问题提供一定参考。 展开更多

关键词 角蛋白酶 家畜血液 水解度 酶解

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稳定过表达犬EGFR蛋白的MDCK细胞的建立及其对凋亡和细胞周期的影响

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作者 杨迪 黄玲巍 +2 位作者 杨雅雯 乔自林 王家敏 《华北农学报》 CSCD 北大核心 2024年第4期223-230,共8页

表皮生长因子受体(EGFR)在许多实体肿瘤中过度表达,建立稳定过表达犬EGFR蛋白的MDCK细胞株,有利于为研究犬或人类肿瘤疾病提供良好的细胞模型和研究基础。首先制备目的片段以构建EGFR基因过表达载体,与慢病毒包装载体共同转染至293T细胞... 表皮生长因子受体(EGFR)在许多实体肿瘤中过度表达,建立稳定过表达犬EGFR蛋白的MDCK细胞株,有利于为研究犬或人类肿瘤疾病提供良好的细胞模型和研究基础。首先制备目的片段以构建EGFR基因过表达载体,与慢病毒包装载体共同转染至293T细胞中,48 h后提取上清液经纯化获得EGFR基因过表达慢病毒液。将其转染至MDCK细胞中,经嘌呤霉素筛选和单细胞克隆后观察感染效率,RT-qPCR和Western Blot、间接免疫荧光分别检测基因及蛋白的表达,建立EGFR蛋白过表达MDCK细胞株。使用流式细胞仪分别检测过表达及对照细胞株的细胞凋亡和细胞周期。犬EGFR基因位于18号染色体,由编码跨膜糖蛋白的30个外显子组成。经反应体系,PCR产物交换入线性化表达载体,获得了阳性转化子8个,大小为738 bp。所获EGFR基因过表达慢病毒滴度为3.5×10^(8 )TU/mL。转染MDCK细胞后在荧光显微镜下观察荧光效果显著,经检测EGFR基因及其蛋白在细胞中的表达量显著升高。间接免疫荧光试验显示,EGFR在细胞中表达明显增强。过表达细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率显著上升,且在G2/M期发生阻滞。成功建立一株稳定的犬EGFR过表达MDCK细胞株,犬EGFR的过表达催化了细胞分裂,使DNA复制加快,同时刺激了细胞凋亡。 展开更多

关键词 犬肾细胞系 表皮生长因子受体 慢病毒载体

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IL-6在病毒感染中作用的研究进展 被引量：1

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作者 王炎 高婉宁 +4 位作者 邵帅 范益阳 纪晓岚 张德荣 柏家林 《中国人兽共患病学报》 CSCD 北大核心 2024年第12期1182-1187,共6页

白介素6(Interleukin-6,IL-6)作为机体先天免疫抵抗病毒感染所分泌的一种细胞因子,因其在细胞因子风暴中产生的影响而受到广泛关注。过去研究表明高水平的IL-6可以有效抑制病毒感染,但越来越多的研究表明,在体内复杂的免疫应答中,IL-6... 白介素6(Interleukin-6,IL-6)作为机体先天免疫抵抗病毒感染所分泌的一种细胞因子,因其在细胞因子风暴中产生的影响而受到广泛关注。过去研究表明高水平的IL-6可以有效抑制病毒感染,但越来越多的研究表明,在体内复杂的免疫应答中,IL-6分泌过多不仅会适得其反,还会对机体造成严重损害。本文综述了IL-6在乙型肝炎病毒、甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、新型冠状病毒、轮状病毒、脑心肌炎病毒感染过程中作用的最新研究进展,以期为阻断病毒感染和研制新型抗病毒药物提供新思路和新途径。 展开更多

关键词 IL-6 病毒感染 细胞因子风暴 信号通路

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热休克蛋白27对水泡性口炎病毒体外增殖的调控作用

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作者 李殿玉 莫荣纤 +6 位作者 赵旭 高铭 李洪珊 白辉盛 马瑞仙 李向茸 冯若飞 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期2540-2549,共10页

本研究旨在探究热休克蛋白27(heat shock protein 27, HSP27)对水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus, VSV)体外增殖及VSV感染介导的维甲酸诱导基因I样受体家族(retinoid acid-inducible gene-I-like receptor, RLR)信号通路的作... 本研究旨在探究热休克蛋白27(heat shock protein 27, HSP27)对水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus, VSV)体外增殖及VSV感染介导的维甲酸诱导基因I样受体家族(retinoid acid-inducible gene-I-like receptor, RLR)信号通路的作用及机制。利用实时荧光定量PCR、免疫印迹、免疫共沉淀、病毒滴度测定及免疫荧光等方法,首先检测VSV感染对HSP27 mRNA和蛋白表达的影响,进而验证过表达和干扰HSP27对VSV增殖的影响,进一步探究HSP27对VSV感染介导的RLR信号通路的影响,最后分析HSP27与RLR信号通路靶分子的相互作用及共定位情况。结果表明,VSV感染可促使HSP27基因转录和蛋白表达上调,稳定过表达和瞬时过表达HSP27均能显著抑制VSV的体外增殖;干扰宿主细胞中HSP27表达可促进VSV增殖。HSP27能够增强VSV及维甲酸诱导基因I蛋白(retinoic acid-inducible gene I protein, RIG-I)介导的IFN-β的产生及RIG-I的蛋白表达,而且HSP27与RIG-I相互作用并共定位于细胞质中。本研究揭示了HSP27靶向RIG-I上调其表达,增强RLR信号通路的转导,进而负调控VSV体外增殖,为深入揭示宿主因子HSP27在病毒感染中的作用机制奠定基础。 展开更多

关键词 热休克蛋白27 水泡性口炎病毒 RLR信号通路 维甲酸诱导基因I蛋白

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小反刍兽疫病毒非结构蛋白C单克隆抗体的制备与鉴定

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作者 李菊 毕冬琳 +5 位作者 杨晓莉 杨东亮 张潇文 刘方程 李琼毅 柏家林 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2024年第5期1047-1054,共8页

为制备小反刍兽疫病毒(PPRV)非结构蛋白C单克隆抗体,根据PPRV C基因编码多肽链氨基酸序列抗原性分析,设计合成一条含20个氨基酸的抗原肽(CRSGKPRGETPGPLLPEIMQ)和一条含21个氨基酸的筛选抗原多肽(PLRAGERGLAPQAVQHRTLIK),将它们分别与... 为制备小反刍兽疫病毒(PPRV)非结构蛋白C单克隆抗体,根据PPRV C基因编码多肽链氨基酸序列抗原性分析,设计合成一条含20个氨基酸的抗原肽(CRSGKPRGETPGPLLPEIMQ)和一条含21个氨基酸的筛选抗原多肽(PLRAGERGLAPQAVQHRTLIK),将它们分别与钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH)和生物素羧基蛋白(biotin carboxyl carrier protein, Biotin)交联,制备获得免疫原和筛选抗原。用免疫原肌肉注射5只8~12周龄、体重约20 g的无特定病原体(specific pathogen free, SPF)级BALB/c雌性小鼠,第1次免疫后分别间隔7 d进行第2次免疫和第3次免疫,三免后21 d进行冲击免疫,冲击免疫后第3天采集血液分离血清,采用间接酶联免疫吸附法(ELISA)测得1只免疫小鼠血清抗体效价为1∶312 500,2只为1∶62 500。取3只小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0经聚乙二醇(PEG)融合制备杂交瘤细胞,通过间接ELISA筛选出26株阳性淋巴杂交瘤细胞,进一步经克隆化培养筛选出46株单克隆细胞株。通过Western blot(WB)筛选获得2株能稳定分泌特异性抗PPRV C蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,WB、间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay, IFA)鉴定显示,制备的单克隆抗体具有较好的灵敏性和病毒反应性。研究结果为进一步阐明C蛋白在PPRV生命周期中的作用奠定了基础,也为小反刍兽疫(PPR)诊断提供了有效的诊断试剂。 展开更多

关键词 小反刍兽疫病毒 非结构蛋白C 杂交瘤细胞技术 单克隆抗体

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