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β-葡萄糖醛酸苷酶基因转染的人肾癌细胞的生物学特性观察 被引量：1
1
作者 邵晨 秦卫军 +5 位作者 温伟红 张磊 王禾 秦荣良 袁建林 邵国兴 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第2期145-147,共3页
目的 :建立高表达 β 葡萄糖醛酸苷酶 (以下简称 βG)基因的肾癌细胞模型 ,并观察转染细胞的生物学特性。方法 :构建真核表达载体 pcDNA3.1 βG ,并利用阳离子脂质体介导将其转入人肾癌细胞株GRC 1中。用mRNA打点杂交和Westernblot,鉴... 目的 :建立高表达 β 葡萄糖醛酸苷酶 (以下简称 βG)基因的肾癌细胞模型 ,并观察转染细胞的生物学特性。方法 :构建真核表达载体 pcDNA3.1 βG ,并利用阳离子脂质体介导将其转入人肾癌细胞株GRC 1中。用mRNA打点杂交和Westernblot,鉴定其转录与表达水平 ,并通过光镜、电镜及细胞增殖周期检测等方法 ,观察转染细胞的生物学特性。结果 :在mRNA与蛋白水平证实 ,转染细胞内有 βG基因的高表达。透射电镜观察 ,转染细胞中的溶酶体、内质网丰富 ,细胞微绒毛及突起增多 ,但转染前后肾癌细胞GRC 1的周期及生长情况无显著性差别。结论 :应用脂质体介导法 ,将βG基因导入人肾癌GRC 1细胞后 ,获得生物学特性稳定 βG基因高表达的肾癌细胞模型 。 展开更多
关键词 肾癌 Β-葡萄糖醛酸苷酶 基因转染 超微结构 生物学特性 脂质体介导法
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人α防御素融合表达、纯化及生物活性检测 被引量：3
2
作者 傅海燕 张剑 +5 位作者 路凡 蒲勤 王孝功 卢兹凡 徐俊卿 赵忠良 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期161-163,共3页
目的:获得大量重组人α防御素(HDα)并检测其活性,为其深入研究提供必要的材料。方法:体外化学合成得到带有羟氨裂解位点编码序列的HDα基因片段,克隆入pBV220-IL-4表达载体构建重组表达载体pBV220-IL-4-HDα。测序正确后将重组质粒转... 目的:获得大量重组人α防御素(HDα)并检测其活性,为其深入研究提供必要的材料。方法:体外化学合成得到带有羟氨裂解位点编码序列的HDα基因片段,克隆入pBV220-IL-4表达载体构建重组表达载体pBV220-IL-4-HDα。测序正确后将重组质粒转入大肠杆菌DH5α中进行温度诱导表达。经羟氨裂解去除IL-4后,对所得蛋白进行纯化、复性,以SDS-PAGE和生物学活性检测鉴定其特性。结果:经温度诱导后,融合蛋白主要以包涵体的形式表达,表达产物约占菌体总蛋白的20%;羟氨裂解切除IL-4后,所得目的蛋白的纯度约为99.8%。抑菌活性试验和克隆形成试验显示,所得HDα对细菌生长有明显的抑制作用。结论:成功地构建了HDα基因的重组表达质粒,获得稳定表达的工程菌,并建立了复性与纯化技术,为进一步对其进行功能研究与应用奠定了基础。 展开更多
关键词 人α防御素(HDα) 表达 纯化 生物学活性 检测
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前列腺干细胞抗原特异性分子探针的构建及其在体MR成像的实验研究 被引量：1
3
作者 任静 王芳 +5 位作者 杨勇 魏光全 张瑞 杨安钢 刘莹 宦怡 《中国医学影像技术》 CSCD 北大核心 2011年第3期437-443,共7页
目的应用纳米金磁微粒标记抗人前列腺干细胞抗原(PSCA)单抗7F5,构建PSCA特异性MR分子探针7F5@Gold Mag,检测其与前列腺癌细胞结合的特异性,并探讨其用于前列腺癌体外及体内MR成像的可行性。方法应用非共价键耦联方法将纳米金磁微粒标记7... 目的应用纳米金磁微粒标记抗人前列腺干细胞抗原(PSCA)单抗7F5,构建PSCA特异性MR分子探针7F5@Gold Mag,检测其与前列腺癌细胞结合的特异性,并探讨其用于前列腺癌体外及体内MR成像的可行性。方法应用非共价键耦联方法将纳米金磁微粒标记7F5,构建PSCA特异性MR分子探针7F5@Gold Mag,检测其与前列腺癌细胞结合的特异性;应用3.0T磁共振扫描仪,观察不同浓度金磁微粒MR成像情况,探讨MRI可分辨的最低浓度;培养人前列腺癌细胞PC-3和肝癌细胞SMMC-7721,将这两种细胞分别与7F5@Gold Mag、无关抗体@Gold Mag交叉配对,对各组细胞行T2 WI并分别测量其信号强度。建立PC-3和SMMC-7721荷瘤裸鼠模型,对两组荷瘤裸鼠经尾静脉注射7F5@Gold Mag和无关抗体@Gold Mag,分别在注射前、注射后6、12和24 h行MR扫描,观察其对肿瘤T2 WI信号的影响,分别测量其信号强度,探讨其用于MR体内成像的可行性,分析比较其信号强度的差异。结果成功构建PSCA特异性MR分子探针7F5@Gold Mag;流式细胞术检测其与PC-3细胞结合率为92.11%;激光共聚焦显微镜及透射电镜观察见PC-3细胞与7F5@Gold Mag有特异性结合。纳米金磁微粒稀释至1∶640,与1%琼脂糖凝胶相比,T2 WI信号强度差异有统计学意义;7F5@Gold Mag可显著特异性降低PC-3细胞T2 WI信号。PC-3荷瘤裸鼠注射7F5@Gold Mag 6、12和24 h后肿瘤组织T2 WI信号强度较平扫显著降低(F=43.675,P<0.05)。而SMMC-7721荷瘤裸鼠在平扫和注射对比剂后6、12和24 h肿瘤信号强度差异无统计学意义。结论 PSCA特异性MR分子探针7F5@Gold Mag具有良好的理化性质和免疫活性,可特异性降低PC-3细胞的T2 WI信号,对活体前列腺癌组织具有靶向性的增强效果。 展开更多
关键词 前列腺肿瘤 分子成像 纳米微粒 磁共振成像 前列腺干细胞抗原蛋白 人
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嵌合分子CblN/Grb2构建及其原核表达
4
作者 李霞 张健 +3 位作者 王立峰 刘娜 刘新平 药立波 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期128-131,共4页
目的构建CblN/Grb2嵌合分子,表达和纯化GST-CblN/Grb2融合蛋白,并考察嵌合分子CblN/Grb2在体外是否具有泛素连接酶活性。方法提取SKBR-3细胞的总RNA并反转录为cDNA,作为模板用PCR扩增Grb2基因的SH2片段;含有人全长CblcDNA的质粒pEFHACb... 目的构建CblN/Grb2嵌合分子,表达和纯化GST-CblN/Grb2融合蛋白,并考察嵌合分子CblN/Grb2在体外是否具有泛素连接酶活性。方法提取SKBR-3细胞的总RNA并反转录为cDNA,作为模板用PCR扩增Grb2基因的SH2片段;含有人全长CblcDNA的质粒pEFHACbl作为模板扩增Cbl基因N-端(CblN);用重叠延伸PCR方法,在CblN内部SH2两端引入BamHⅠ和EcoRV酶切位点并克隆入pcDNA3·1(+)。再以Grb2基因的SH2置换CblN的SH2即成为pcDNA3·1(+)-CblN/Grb2;以其为模板,通过PCR方法扩增CblN/Grb2并将其亚克隆至表达载体pGEX-4T-2,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达GST-CblN/Grb2融合蛋白并用GlutathioneSepharose4B进行纯化;通过体外泛素化实验检测GST-CblN/Grb2是否具有泛素连接酶活性。结果成功构建了pGEX-4T-2-CblN/Grb2融合表达载体;在大肠杆菌DH5α中表达了GST-CblN/Grb2融合蛋白并获得了纯化蛋白;体外泛素化实验表明GST-CblN/Grb2具有泛素连接酶活性。结论GST-CblN/Grb2的表达、纯化及其体外活性的鉴定为进一步研究该嵌合泛素连接酶对HER2阳性肿瘤细胞生长的影响奠定了基础。 展开更多
关键词 重叠延伸PCR 重组融合蛋白质类 泛素蛋白连接酶类 Cb1蛋白
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一种新的抑癌候选基因——NDR2在人类正常组织及相应肿瘤中的表达 被引量：31
5
作者 李剑 刘新平 +6 位作者 林树新 邓艳春 孟庆军 张文红 李树钧 聂晓燕 药立波 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2002年第2期223-227,共5页
为观察NDR2基因在人类正常组织及相应肿瘤组织中的表达分布特点 ,收集人脑与胶质瘤、肺与肺癌、胃与胃癌、结肠与结肠癌组织标本 ,分别进行组织石蜡切片和总RNA提取 ,应用免疫组化方法和RT PCR技术检测NDR2蛋白质及mRNA表达水平 ,并通过... 为观察NDR2基因在人类正常组织及相应肿瘤组织中的表达分布特点 ,收集人脑与胶质瘤、肺与肺癌、胃与胃癌、结肠与结肠癌组织标本 ,分别进行组织石蜡切片和总RNA提取 ,应用免疫组化方法和RT PCR技术检测NDR2蛋白质及mRNA表达水平 ,并通过DNA测序验证PCR产物的正确性 .免疫组化结果表明 ,在上述各组织均有NDR2蛋白不同程度的表达 .RT PCR结果显示 ,在人脑和胶质瘤组织、肺与肺癌组织、胃与胃癌组织、结肠与结肠癌组织中均有NDR2mRNA表达 ,其表达水平以脑组织为最高 .NDR2mRNA在正常脑和肺组织的表达水平分别显著高于胶质瘤与肺癌组织 ,而结肠与结肠癌组织 ,胃与胃癌组织NDR2mRNA表达水平则无显著差别 .以上结果表明 ,NDR2基因可能广泛表达于人体正常组织内 ,而在胶质瘤与肺癌中的表达较相应正常组织减低 ,提示该基因可能与神经系统及呼吸系统肿瘤的发生发展有关 ,为进一步探讨该基因功能提供了线索 . 展开更多
关键词 抑癌候选基因 正常组织 NDR2 肿瘤 免疫组织化学 MRNA表达
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NDRG2对肝癌细胞HepG2凋亡的诱导作用 被引量：21
6
作者 吴国强 刘新平 +6 位作者 王立峰 张文红 张健 李开宗 窦科峰 张雪峰 药立波 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第4期357-360,共4页
目的 :探讨NDRG2对肝癌细胞HepG2凋亡的诱导作用。方法 :用RT PCR获取NDRG2基因。测序判断正确后 ,将其克隆入含绿色荧光蛋白 (GFP)基因的真核表达载体pIRES2 EGFP中 ,并转染NDRG2表达阴性的HepG2细胞。用光镜观察转染细胞的形态变化 ... 目的 :探讨NDRG2对肝癌细胞HepG2凋亡的诱导作用。方法 :用RT PCR获取NDRG2基因。测序判断正确后 ,将其克隆入含绿色荧光蛋白 (GFP)基因的真核表达载体pIRES2 EGFP中 ,并转染NDRG2表达阴性的HepG2细胞。用光镜观察转染细胞的形态变化 ;荧光显微镜观察NDRG2蛋白的定位 ;流式细胞仪分析细胞周期的改变 ;透射电镜进一步观察细胞超微结构的改变。结果 :获得了NDRG2基因 ,成功地构建了 pIRES2 EGFP NDRG2真核表达载体。转染HepG2细胞后 ,细胞生长受抑 ,结构破坏并死亡。荧光显微镜观察到NDRG2在胞质中表达 ,流式细胞仪检测出现G1期阻滞和凋亡峰 ,透射电镜观察到典型的细胞凋亡特征。结论 :NDRG2基因具有诱导HepG2细胞凋亡的作用 。 展开更多
关键词 NDRG2 HEPG2 GFP 细胞凋亡
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人IgG3上游铰链区/p53四价功能域融合基因的构建及空间构象分析 被引量：9
7
作者 王栋 王禾 +6 位作者 武国军 药立波 季少平 刘新平 袁建林 康福霞 于磊 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第4期381-383,共3页
目的构建人IgG3上游铰链区/p53四价功能域融合基因，并进行空间构象的分析。方法利用递归PCR法，扩增人IgG3上游铰链区/p53四价功能域融合基因，并在融合基因5′端和3′端引入Sal I与Hind Ⅲ酶切位点。将融合基因克隆入pUC19载体中，经... 目的构建人IgG3上游铰链区/p53四价功能域融合基因，并进行空间构象的分析。方法利用递归PCR法，扩增人IgG3上游铰链区/p53四价功能域融合基因，并在融合基因5′端和3′端引入Sal I与Hind Ⅲ酶切位点。将融合基因克隆入pUC19载体中，经酶切鉴定及序列测定证实后，利用计算机软件进行空间构象分析。结果人IgG3上游铰链区/p53四价功能域融合基因，经酶切鉴定及测序证实，其大小及核苷酸序列正确，与设计完全一致。计算机软件分析显示，融合基因表达产物可自动装配成四聚体，并具有4条柔性好的长多肽，可确保与其融合的其他基因片段空间构象的独立性。结论人IgG3上游铰链区/p53四价功能域融合基因的成功构建，为进一步研制多价抗体奠定了基础。 展开更多
关键词 p53四价功能域 IGG3 铰链区 融合基因 递归PCR
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抗HER2单链抗体融合凋亡蛋白对SKOV3细胞的靶向杀伤 被引量：5
8
作者 张立红 贾林涛 +5 位作者 鲍炜 于翠娟 赵晶 金明 王成济 杨安钢 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第2期160-162,共3页
目的 :探讨分泌表达的抗HER2单链抗体与重构型人caspase 3融合蛋白对HER2抗原阳性肿瘤细胞的靶向杀伤作用。方法 :将重构型人caspase 3基因亚克隆入pCMV e2 3scFv PEII PEIII的相应位点 ,构建重组真核表达载体 pCMV e2 3scFv PEII revca... 目的 :探讨分泌表达的抗HER2单链抗体与重构型人caspase 3融合蛋白对HER2抗原阳性肿瘤细胞的靶向杀伤作用。方法 :将重构型人caspase 3基因亚克隆入pCMV e2 3scFv PEII PEIII的相应位点 ,构建重组真核表达载体 pCMV e2 3scFv PEII revcasp3,并转染人T淋巴瘤细胞系Jurkat,筛选并建系。用ELISA检测培养上清中融合蛋白的分泌表达。通过共培养实验观察含有该融合蛋白的培养上清对人卵巢癌细胞SKOV3生长的抑制作用。结果 :融合蛋白基因可在Jurkat细胞中 ,分泌表达并杀伤SKOV3细胞。结论 :分泌表达的抗erbB2单链抗体与重构型人caspase 展开更多
关键词 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 单链抗体 表皮生长因子受体 HER-2 肿瘤 SKOV3细胞 靶向杀伤作用
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溶氧反馈-补料分批技术高密度培养基因重组MAGE1/HSP70/MAGE3工程菌 被引量：7
9
作者 胡沛臻 温江田 +7 位作者 路凡 王孝功 李侠 司少艳 葛伟 黄杨 张秀敏 隋延仿 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第16期1576-1579,共4页
目的建立人黑色素瘤抗原MAGE1/HSP70/MAGE3融合蛋白基因重组工程菌E.coli.BL21/pET-MHM的高密度发酵工艺。方法以摇瓶发酵结果为基础,扩大至NBS BiofloⅣ20L发酵罐发酵,利用溶氧反馈-补料分批培养技术,对影响工程菌生长及目的蛋白表达... 目的建立人黑色素瘤抗原MAGE1/HSP70/MAGE3融合蛋白基因重组工程菌E.coli.BL21/pET-MHM的高密度发酵工艺。方法以摇瓶发酵结果为基础,扩大至NBS BiofloⅣ20L发酵罐发酵,利用溶氧反馈-补料分批培养技术,对影响工程菌生长及目的蛋白表达的因素如发酵培养基、活化时间、诱导浓度及时间、pH值及分批补加营养物质等进行优化。结果保持培养过程中40%的溶解氧,采用半合成培养基、活化至对数生长期时0.2mmol/LIPTG诱导5h以及以甘油为碳源连续流加补料的条件发酵,连续3批重复发酵,最终菌密度D(600)均达45～50时,菌体量可提高至70g/L以上,目的蛋白的表达量占菌体蛋白总量的38%以上。结论确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺。 展开更多
关键词 黑色素瘤抗原 重组 大肠杆菌 发酵
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抗人HBsAg单链抗体基因的构建及其在COS-7细胞中的表达 被引量：5
10
作者 温伟红 赵晶 +4 位作者 于翠娟 许彦鸣 金明 王成济 杨安钢 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第2期163-167,共5页
目的 :构建抗人HBsAg单链抗体基因 ,并分析其在COS 7细胞中的表达。方法 :以从噬菌体抗体库中筛选的抗HBsAg的Fab抗体基因为模板 ,分别扩增其轻、重链可变区 (VL、VH)基因 ,通过重组PCR方法将轻、重链可变区基因用连接肽(Gly4Ser) 3的... 目的 :构建抗人HBsAg单链抗体基因 ,并分析其在COS 7细胞中的表达。方法 :以从噬菌体抗体库中筛选的抗HBsAg的Fab抗体基因为模板 ,分别扩增其轻、重链可变区 (VL、VH)基因 ,通过重组PCR方法将轻、重链可变区基因用连接肽(Gly4Ser) 3的编码序列连接 ,并引入前导肽编码序列 ,构建具有L VH Linker VL 结构的单链抗体基因。将所构建的单链抗体基因克隆入绿色荧光蛋白 (GFP)融合表达载体pEGFP N3,并转染COS 7细胞进行表达。结果 :经测序表明 ,前导肽、连接肽、VL 及VH 的序列正确。酶切鉴定证实 ,成功地构建了GFP基因融合表达载体。瞬时转染COS 7细胞后 ,通过荧光显微镜观察证实有ScFv融合蛋白的表达。转染细胞的培养上清浓缩后 ,进行SDS PAGE及Westernblot分析 ,可检出ScFv融合蛋白的分泌性表达。培养上清的间接ELISA检测证实 ,所表达的单链抗体具有与HBsAg结合的特异性。结论 :成功地构建了抗人HBsAg单链抗体基因 ,并可在COS 展开更多
关键词 乙型肝炎 HBSAG 单链抗体基因 COS-7细胞 基因表达
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抗人肿瘤坏死因子-α单链抗体基因在大肠杆菌中的融合表达 被引量：6
11
作者 陈萍 邓健蓓 +2 位作者 药立波 韩骅 苏成芝 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 1998年第3期188-190,共3页
目的：将抗ｈＴＮＦ－α单链抗体基因克隆入融合表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ－１中，以期得到ＧＳＴ－ＳｃＦｖ融合表达蛋白。方法：将限制性内切酶酶切拼接法获得的Ｅ６ＳｃＦｖ基因克隆入融合表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ－１中，转化大肠杆菌ＤＨ... 目的：将抗ｈＴＮＦ－α单链抗体基因克隆入融合表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ－１中，以期得到ＧＳＴ－ＳｃＦｖ融合表达蛋白。方法：将限制性内切酶酶切拼接法获得的Ｅ６ＳｃＦｖ基因克隆入融合表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ－１中，转化大肠杆菌ＤＨ５α，经异丙基－β－Ｄ－硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导，１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测表达产物，光密度扫描和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ验证表达产物。结果：ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示，Ｅ６ＳｃＦｖ表达产物约为５２ｋｕ左右，与预期的结果相符；光密度扫描结果表明，ＧＳＴ－Ｅ６ＳｃＦｖ融合蛋白占菌体总蛋白的４０％；Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ证实，在相应分子量处，有ＧＳＴ－Ｅ６ＳｃＦｖ融合蛋白的显色印迹；进一步对表达产物的形式分析，ＧＳＴ－Ｅ６ＳｃＦｖ融合蛋白的表达产物为包涵体形式。 展开更多
关键词 肿瘤坏死因子Α 单链抗体 大肠杆菌 基因表达
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抗角蛋白Fab抗体在大肠杆菌中的表达与复性研究 被引量：5
12
作者 樊建勇 王刚 +2 位作者 李巍 吴元明 刘玉峰 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第4期441-443,共3页
目的 :用大肠杆菌分别表达抗角蛋白抗体的轻链和Fd片段 ,体外复性得到Fab抗体。方法 :从已构建的质粒p3MH/Fab中 ,亚克隆抗角蛋白抗体的轻链和Fd片段基因 ,并分别插入载体pET32a中 ,构建重组质粒。以重组质粒分别转化大肠杆菌BL2 1(DE3... 目的 :用大肠杆菌分别表达抗角蛋白抗体的轻链和Fd片段 ,体外复性得到Fab抗体。方法 :从已构建的质粒p3MH/Fab中 ,亚克隆抗角蛋白抗体的轻链和Fd片段基因 ,并分别插入载体pET32a中 ,构建重组质粒。以重组质粒分别转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,在IPTG诱导下进行表达。SDS PAGE分析发现 ,在相对分子量 (Mr)为 2 5 0 0 0处有外源蛋白表达。轻链和Fd片段变性后等量混合于折叠液中 ,复性后形成Mr 约为4 5 0 0 0的蛋白。结果 :成功地表达抗角蛋白抗体的轻链和Fd片段 ,ELISA和Westernblot证实 ,复性产物具有与角蛋白结合的能力。结论 :获得了具有活性的抗角蛋白的Fab抗体 ,为其应用研究打下了基础 ,也表明包涵体表达基因工程抗体技术是可行的。 展开更多
关键词 FAB 角蛋白 表达 复性
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嵌合重组caspase-3诱导表达促进肿瘤细胞凋亡 被引量：3
13
作者 贾林涛 张立红 +4 位作者 于翠娟 纪宗玲 曹云新 王成济 杨安钢 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2003年第2期272-277,共6页
通过稳定转染人宫颈癌HeLa细胞 ,建立了野生型caspase 3(wt casp3) ,大小亚基序列颠倒的重组caspase 3(r casp3) ,和N端融合绿脓杆菌外毒素 (PE)转膜肽段的嵌合重组caspase 3(cr casp3)的诱导表达细胞系 .蜕皮素诱导后细胞中检测到目的... 通过稳定转染人宫颈癌HeLa细胞 ,建立了野生型caspase 3(wt casp3) ,大小亚基序列颠倒的重组caspase 3(r casp3) ,和N端融合绿脓杆菌外毒素 (PE)转膜肽段的嵌合重组caspase 3(cr casp3)的诱导表达细胞系 .蜕皮素诱导后细胞中检测到目的基因的表达 ,MTT检测和细胞计数结果表明 ,r casp3和cr casp3诱导表达后有效地导致HeLa细胞死亡 ,通过测定细胞中caspase 3活性 ,以及细胞周期检测、DNA梯状电泳条带检测(DNAladder)、电镜观察等证实r casp3和cr casp3诱导表达后细胞发生了凋亡 ,且二者的促凋亡活性相当 ,而wt casp3诱导表达细胞并未出现上述效应 .结果表明 ,与野生型caspase 3活化需要上游分子的切割不同 ,重组caspase 3具有自发的促凋亡活性 ,而N端PE肽段的融合不影响这种活性 ,因此PE转膜结构域和重组caspase 3有望参与构建能转膜进入细胞内部 。 展开更多
关键词 嵌合重组 CASPASE-3 诱导 肿瘤 细胞凋亡 绿脓杆菌外毒素 转膜肽段
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RNA干涉的最新研究进展 被引量：31
14
作者 吴元明 陈苏民 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第4期411-417,共7页
RNA干涉 (RNAi)是将双链RNA(dsRNA)导入细胞引起特异基因mRNA降解的一种细胞反应过程 .它是转录后基因沉默 (PTGS)的一种 .RNAi在生物界中广泛存在 .RNAi发生过程主要分为 3个阶段 :起始阶段 ,扩增阶段 ,效应阶段 .RNAi在维持基因组稳... RNA干涉 (RNAi)是将双链RNA(dsRNA)导入细胞引起特异基因mRNA降解的一种细胞反应过程 .它是转录后基因沉默 (PTGS)的一种 .RNAi在生物界中广泛存在 .RNAi发生过程主要分为 3个阶段 :起始阶段 ,扩增阶段 ,效应阶段 .RNAi在维持基因组稳定、保护基因组免受外源核酸侵入、基因表达调控等方面发挥重要生物学作用 .RNAi作为基因沉默的一个工具 ,已被广泛用于基因功能研究、基因治疗和新药研究与开发等方面 . 展开更多
关键词 RNA干涉 基因功能 转录后基因沉默 基因治疗
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重组人骨形成蛋白-2对细胞成骨分化的作用 被引量：5
15
作者 朱帮福 张斌 +5 位作者 李毅 纪宗玲 蒲勤 柴玉波 陈南春 陈苏民 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第2期134-137,共4页
目的进一步探讨ｒｈＢＭＰ－２的促细胞成骨分化作用，以期找到合适的成骨分化标志作为ｒｈＢＭＰ－２的定量活性测定指标。方法　首先表达制备ｒｈＢＭＰ－２，用小鼠股部肌袋包埋法进行诱骨活性实验，然后检测ｒｈＢＭＰ－２作用后的... 目的进一步探讨ｒｈＢＭＰ－２的促细胞成骨分化作用，以期找到合适的成骨分化标志作为ｒｈＢＭＰ－２的定量活性测定指标。方法　首先表达制备ｒｈＢＭＰ－２，用小鼠股部肌袋包埋法进行诱骨活性实验，然后检测ｒｈＢＭＰ－２作用后的骨髓基质细胞（ＭＳＣ）、ＮＩＨ３Ｔ３和Ｃ２Ｃ１２等３种细胞的碱性磷酸酶（ＡＬＰ）和骨钙素（ＯＣ）、细胞总蛋白合成量以及细胞增殖的变化。结果　ｒｈＢＭＰ－２具有良好的诱导骨形成的活性，可增加３种细胞的ＯＣ含量和蛋白合成量，对ＭＳＣ的ＡＬＰ活性变化影响明显，且可促进ＭＳＣ的增殖，抑制ＮＩＨ３Ｔ３细胞的生长。结论　ｒｈＢＭＰ－２具有促进上述细胞向成骨细胞分化的作用；在一定剂量范围内，ｒｈＢＭＰ－２的作用与细胞骨钙素合成量的增加呈线性正相关，故定量测定ＯＣ的含量基本可反映ｒｈＢＭＰ－２的活性。 展开更多
关键词 重组人骨形成蛋白-2 成骨分化 细胞分化
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MRG15的克隆及其在正常和年龄相关性白内障晶状体上皮细胞中的表达 被引量：7
16
作者 刘燕 周健 +3 位作者 刘新平 药立波 苏景宽 惠延年 《眼科研究》 CSCD 北大核心 2005年第3期228-231,共4页
目的克隆死亡因子相关基因15(MRG15)并研究其在正常晶状体和年龄相关性白内障晶状体上皮细胞中的表达,比较二者的差异。方法用改良的消减杂交法克隆死亡因子相关基因15,地高辛标记MRG15cDNA片断制作探针,用原位杂交法研究其在晶状体前... 目的克隆死亡因子相关基因15(MRG15)并研究其在正常晶状体和年龄相关性白内障晶状体上皮细胞中的表达,比较二者的差异。方法用改良的消减杂交法克隆死亡因子相关基因15,地高辛标记MRG15cDNA片断制作探针,用原位杂交法研究其在晶状体前囊膜切片上的表达,并作统计学处理。结果克隆到了死亡因子相关基因15的cDNA片断,长约639bp,死亡因子相关基因15在正常晶状体和年龄相关性白内障晶状体上皮细胞中均有表达;经统计分析,其在年龄相关性白内障晶状体上皮细胞中的表达高于其在正常晶状体上皮细胞中的表达。结论MRG15在正常晶状体和年龄相关性白内障晶状体上皮细胞中均有表达;在年龄相关性白内障晶状体上皮细胞中,其表达较正常晶状体增高,提示其可能在白内障的发生中起重要作用。 展开更多
关键词 死亡因子相关基因15 MRNA 年龄相关性白内障 晶状体上皮细胞
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人β防御素4基因的合成及克隆载体的构建 被引量：4
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作者 曹玉红 张光运 +2 位作者 张国成 徐彦鸣 张建 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第4期377-378,380,共3页
目的：合成人β防御素4（HBD4）基因并构建其克隆载体.方法：根据GenBank中HBD4结构基因的序列, 设计合成了6条长度为32 ～60 bp的寡聚核苷酸片段, 用重叠延伸PCR法扩增合成HBD4 cDNA全长.PCR产物经双酶切后, 克隆入载体pMD18-T中, 并... 目的：合成人β防御素4（HBD4）基因并构建其克隆载体.方法：根据GenBank中HBD4结构基因的序列, 设计合成了6条长度为32 ～60 bp的寡聚核苷酸片段, 用重叠延伸PCR法扩增合成HBD4 cDNA全长.PCR产物经双酶切后, 克隆入载体pMD18-T中, 并导入细菌中进行扩增.结果：HBD4基因的PCR产物和重组载体经凝胶电泳和酶切鉴定、 测序分析证实, 合成的目的基因与设计的HBD4 cDNA的序列相一致, 并成功地克隆入克隆载体pMD18-T中.结论：用重叠延伸PCR法能方便、 准确地获得目的基因片段.重组克隆载体pMD18-T-HBD4 的获得, 为构建HBD4基因的表达载体并表达奠定了基础. 展开更多
关键词 人β防御素4 重叠延伸PCR 基因合成 基因克隆
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人NDRG1的融合表达、纯化及抗体制备 被引量：3
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作者 张健 刘新平 +6 位作者 张伟 吴国强 沈岚 王立峰 苏金 张万会 药立波 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第6期698-703,共6页
NDRG1是在N myc缺陷的小鼠胚胎组织中发现的一异常高表达的新基因 .在研究高同型半胱氨酸血症引起动脉粥样硬化的机制时 ,在培养的人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)中发现了人NDRG1 .为了研究人NDRG1的功能以及结构与功能之间的关系 ,用RT PCR... NDRG1是在N myc缺陷的小鼠胚胎组织中发现的一异常高表达的新基因 .在研究高同型半胱氨酸血症引起动脉粥样硬化的机制时 ,在培养的人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)中发现了人NDRG1 .为了研究人NDRG1的功能以及结构与功能之间的关系 ,用RT PCR技术 ,从人脑总RNA中克隆NDRG1cDNA ,进行序列测定后 ,将NDRG1插入pPROEXHTb表达载体中 ,转化E .coliDH5α感受态细胞 ,并在LB培养基中获得高效可溶表达 .表达的 6His NDRG1融合蛋白经Ni2 + NTA偶联的琼脂糖珠纯化 ,通过圆二色性分析其二级结构 ,结果为 :α螺旋 :2 3 6 ,β片层 :1 8 6 ,转角 :2 5 7,无规卷曲 :32 0 .用此融合表达的蛋白免疫家兔 ,制备得到高效价的抗体 ,利用固定于硝酸纤维素膜上的NDRG1抗原亲和吸附纯化抗血清提高了抗体的特异性 。 展开更多
关键词 融合表达 圆二色性 免疫血清 抗体制备 基因表达 NDRG1基因
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人NT3、BDNF基因Tet-on可调控重组腺病毒载体的构建和鉴定 被引量：4
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作者 李志全 朱庆生 +4 位作者 朱锦宇 郝伟 许彦鸣 王成济 杨安钢 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第3期344-347,共4页
目的 :分别构建含人神经营养素 3(NT3)基因和脑源性神经营养因子 (BDNF)基因的重组四环素可诱导的腺病毒载体 ,并进行PCR和酶切鉴定。方法 :将NT3和BDNF基因依次分别亚克隆到pIND载体和pTRE Shuttle2载体中 ,构建重组载体pTRE Shuttle2 ... 目的 :分别构建含人神经营养素 3(NT3)基因和脑源性神经营养因子 (BDNF)基因的重组四环素可诱导的腺病毒载体 ,并进行PCR和酶切鉴定。方法 :将NT3和BDNF基因依次分别亚克隆到pIND载体和pTRE Shuttle2载体中 ,构建重组载体pTRE Shuttle2 NT3和pTRE Shuttle2 BDNF。用PI SceI和I CeuI双酶切后将所获NT3及BDNF基因片段再与线性化的腺病毒载体pAdeno X连接 ,构建成pAdeno NT3及pAdeno BDNF的重组腺病毒载体。以电穿孔转化E .coli后挑取克隆进行PCR及酶切鉴定。结果 :重组腺病毒载体的PCR鉴定表明 ,在 312bp处出现特定的条带 ;酶切鉴定证实 ,得到约 2 3kb的预期片段 ,说明人NT3、BDNF基因与腺病毒载体pAdeno X已正确连接。结论 :成功地构建了含人NT3和BDNF基因的四环素可诱导重组腺病毒载体 。 展开更多
关键词 神经营养素3 脑源性神经营养因子 四环素 重组腺病毒载体
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抗人精浆蛋白单抗κ链基因的克隆及其在HeLa细胞的表达 被引量：3
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作者 杨洁 郝晓柯 +6 位作者 张盈华 孙脊峰 赵晶 许彦鸣 金明 王成济 杨安钢 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第2期110-112,共3页
目的　　获得鼠抗人精浆蛋白单抗（ｍＡｂ）κ链基因，并将其转染到ＨｅＬａ细胞进行表达。方法　从分泌抗人精浆蛋白ｍＡｂ的杂交瘤细胞系Ｅ４Ｂ７中提取总ＲＮＡ，用ＲＴ－ＰＣＲ法获取κ链ｃＤＮＡ。将其克隆入真核表达载体ｐｃＤＮ... 目的　　获得鼠抗人精浆蛋白单抗（ｍＡｂ）κ链基因，并将其转染到ＨｅＬａ细胞进行表达。方法　从分泌抗人精浆蛋白ｍＡｂ的杂交瘤细胞系Ｅ４Ｂ７中提取总ＲＮＡ，用ＲＴ－ＰＣＲ法获取κ链ｃＤＮＡ。将其克隆入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３，用脂质体转染法转染ＨｅＬａ细胞，并用免疫荧光染色法检测κ链的表达。结果从分泌抗人精浆蛋白的鼠ｍＡｂ杂交瘤细胞系Ｅ４Ｂ７中克隆了κ链基因。序列测定表明，Ｖκ属于鼠免疫球蛋白ⅩⅢ家族。以含κ链基因的真核表达载体ｐｃＤＮＡ３－Ｅ４Ｂ７κ转染ＨｅＬａ细胞后，在ＨｅＬａ细胞中检测到了κ链的表达。结论　获得了序列正确的κ链基因，并在ＨｅＬａ细胞中成功地表达，为进一步构建和表达Ｆａｂ段打下了良好基础。 展开更多
关键词 抗人精浆蛋白单克隆抗体 κ链基因 克隆 HELA细胞 基因表达
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