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人PSP94与TNFα衍生物联合治疗人前列腺癌的实验研究 被引量:1
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作者 刘丽 刘庆鑫 +4 位作者 刘立忠 石缨 谢宝树 冷爱军 曹颖 《中国生物化学与分子生物学报》 CSCD 2000年第4期546-550,共5页
构建了表达人 PSP94、TNFα衍生物 ( TNFα D1 1 a)及 PSP94与 TNFα D1 1 a( PSP94- TNFαD1 1 a)双功能蛋白真核表达质粒 pc DNA- TNFα D1 1 a、pc DNA- PSP94和 pc DNA- PSP94- TNFαD1 1 a,与 rh PSP94和 rh TNFα D1 1 a蛋白分别... 构建了表达人 PSP94、TNFα衍生物 ( TNFα D1 1 a)及 PSP94与 TNFα D1 1 a( PSP94- TNFαD1 1 a)双功能蛋白真核表达质粒 pc DNA- TNFα D1 1 a、pc DNA- PSP94和 pc DNA- PSP94- TNFαD1 1 a,与 rh PSP94和 rh TNFα D1 1 a蛋白分别在人前列腺癌裸鼠移植瘤动物模型上进行了 PSP94与 TNFαD1 1 a联合治疗人前列腺癌的实验研究 .当动物肿瘤直径长至约 1 0 mm时 ,将以上 3种真核表达质粒分别以 50 μg/只的量给相应组动物的左右四头肌内注射一次 ,同时设 pc DNA3.0空载体对照组 ;rh PSP9450μg/kg、rh TNFαD1 1 a 1 0 0万单位 /kg、rh PSP94和 rh TNFαD1 1 a以同样剂量联合给药 ,肌肉注射 ,每 d一次 ,连续 1 0 d,同时设环磷酰胺阳性对照组和生理盐水阴性对照组 .基因治疗动物给药后第 1 5d处死 ,蛋白治疗组停药后第 2 d处死 ,观察疗效 ,计算抑瘤率 .结果显示 ,以上述方式给药 ,无论是基因治疗组还是重组蛋白组 ,给 PSP94的动物肿瘤虽然未见明显缩小 ,但肿瘤组织均出现不同程度的坏死和液化现象 ;给 TNFαD1 1 a的未见明显的抑瘤效果 ;PSP94-TNFαD1 1 a融合基因或 rh PSP94+ rh TNFαD1 1 a联合给药 ,不仅肿瘤有所缩小 ,而且也有不同程度的坏死和液化现象出现 .初步认为 :( 1 ) 展开更多
关键词 PSP94 TNFα衍生物 基因治疗 前列腺癌
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DnaJ类分子伴侣PBP的基因克隆及亚细胞定位研究 被引量:6
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作者 刘缨 朱美财 +2 位作者 王荫静 占志 刘成刚 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第6期531-534,共4页
目的:从人骨骼肌cDNA文库中,分离、鉴定视网膜感光受体外周蛋白的结合蛋白(PBP)-DnaJ(HSP40)类分子伴侣,并初步分析其在转染的哺乳动物细胞中的表达及分布。方法:以33p-dCTP标记探针杂交筛选人骨骼肌cDNA文库,对阳性克隆进行序列分析,... 目的:从人骨骼肌cDNA文库中,分离、鉴定视网膜感光受体外周蛋白的结合蛋白(PBP)-DnaJ(HSP40)类分子伴侣,并初步分析其在转染的哺乳动物细胞中的表达及分布。方法:以33p-dCTP标记探针杂交筛选人骨骼肌cDNA文库,对阳性克隆进行序列分析,并以脂质体介导转染哺乳动物细胞,用免疫印迹及间接免疫荧光染色法检测目的蛋白的表达。结果:筛选出全长pbp基因,经与GenBank中的序列比较分析证实,与DnaJ家族的1个成员-mrj(1.5 kb)的序列相同,且含140 bp左右富含GC的非编码区上游序列。在COS-7细胞 中瞬时表达的PBP,大多呈典型的胞浆分布,而J-domain缺失的pbp片段多为胞核分布。而在CHO细胞中稳定表达的PBP,在处于不同细胞周期时相的细胞中的分布不同。结论:DnaJ除与HSP70(DnaK)协同发挥重要功能外,其本身作为分子伴侣也可能发挥着重要作用,且与细胞周期可能存在某种密切联系。 展开更多
关键词 DnaJ分子伴侣蛋白 基因 转染细胞 外周蛋白结合蛋白
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人血小板生成素全长分子在酵母系统中的分泌表达及活性分析 被引量:7
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作者 田生礼 刘丽 +5 位作者 芦兴武 孟岩 谢宝树 刘立忠 王颖 冷爱军 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 1998年第4期358-364,共7页
外源基因可通过整合型载体被整合到毕赤酵母(Pichiapastoris)染色体上,获得遗传性稳定分泌表达株.利用酵母信号肽MFα,对该信号肽蛋白酶识别位点的相关序列进行重新设计,使天然人TPO成熟肽在毕赤酵母系统中分... 外源基因可通过整合型载体被整合到毕赤酵母(Pichiapastoris)染色体上,获得遗传性稳定分泌表达株.利用酵母信号肽MFα,对该信号肽蛋白酶识别位点的相关序列进行重新设计,使天然人TPO成熟肽在毕赤酵母系统中分泌表达成功.表达产物经Western-blot进行分析,分子量约为66kD处蛋白条带可被TPO抗体识别;表达量约为0.1g/L;N端氨基酸序列分析结果与设计的一致;表达产物对小鼠骨髓细胞形成巨核细胞集落形成单位(megakary-ocytecolonyformingunit,CFU-Meg)具有明显的刺激作用. 展开更多
关键词 血小板生成素 毕赤酵母 分泌表达 活性测定
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SAPGTP和PG为接头的5'IL6-TNFα衍生物融合蛋白 被引量:5
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作者 刘丽 徐琪 +4 位作者 胡晓冥 刘立忠 王颖 谢宝树 冷爱军 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 1999年第4期517-521,共5页
通过计算机模拟比较十种理论上柔性较好的接头在 5′ I L6 T N FΔ融合蛋白中对 I L6 和 T N FΔ空间结构的影响情况,从中选择了 S A P G T P接头.以 S A P G T P 作为接头的 5′ I L6 S A P ... 通过计算机模拟比较十种理论上柔性较好的接头在 5′ I L6 T N FΔ融合蛋白中对 I L6 和 T N FΔ空间结构的影响情况,从中选择了 S A P G T P接头.以 S A P G T P 作为接头的 5′ I L6 S A P G T P T N FΔ和以 P G 为接头的5′ I L6 P G T N FΔ空间结构预测结果相似. D N A 序列分析两种蛋白的接头序列均与设计的一致.5′ I L6 S A P G T P T N FΔ和 5′ I L6 P G T N FΔ蛋白的大肠杆菌表达产物经初步分离、纯化及鉴定后,生物学活性及对高表达 I L6 受体肿瘤细胞的杀伤作用比较结果显示:在 L929细胞上,前者的生物学活性是后者的 27 倍;在 U937 细胞上,前者对肿瘤细胞的抑制率是后者的13 倍.它们对高表达 I L6 受体的 U937 细胞杀伤作用分别是同样突变位点的人 T N Fα衍生物的37 和 29 倍.实验表明, S A P G T P作为接头构建的 5′ I L6 S A P G T P T N FΔ融合蛋白优于以 P G 作为接头构建的 5′ I L6 P G T N FΔ融合蛋白. 展开更多
关键词 融合蛋白 接头 白细胞介素6 衍生物 TNF
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酵母系统表达TPO与E.coli表达TPO N端结构域生物半衰期比较
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作者 刘丽 田生礼 +5 位作者 王颖 芦兴武 孟岩 谢宝树 刘立忠 冷爱军 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 1998年第6期784-789,共6页
为了探讨血小板生成素(TPO)糖基化与其生物半衰期的关系,首先纯化了巴氏毕赤酵母系统分泌表达的人TPO成熟肽和大肠杆菌表达的人TPON端结构域蛋白.纯化产物经Westernblot鉴定和活性分析后,两种蛋白以相同浓度... 为了探讨血小板生成素(TPO)糖基化与其生物半衰期的关系,首先纯化了巴氏毕赤酵母系统分泌表达的人TPO成熟肽和大肠杆菌表达的人TPON端结构域蛋白.纯化产物经Westernblot鉴定和活性分析后,两种蛋白以相同浓度或相同活性单位给Wister大鼠尾静脉注射,利用酶联免疫分析(ELISA)和TF1细胞测定不同时间点实验动物血浆中TPO浓度或生物学活性,求出两种TPO的生物半衰期(t1/2)值.结果显示,以相同浓度和相同活性单位给药,TPO成熟肽的t1/2均比其N端结构域的长,前者分别是后者的1.65倍和1.27倍. 展开更多
关键词 血小板生成素 糖基化 生物半衰期 N端结构
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抗PAI抑制作用的组织纤溶酶原激活剂在大肠杆菌中的表达 被引量:5
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作者 朱美财 占志 +3 位作者 王雅静 刘成刚 石缨 蔡庆 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期565-569,共5页
目的: 构建t-PA活性不被PAI-1抑制的新一代t-PA突变体.方法: 根据t-PA的结构特点,去除t-PA分子中的指状区、表皮生长因子和Kringle1区,以含全长t-PA编码区序列的pUC18质粒为模板,经PCR扩增编码氨基酸1~3和176~527位的截短式t-PA DNA序... 目的: 构建t-PA活性不被PAI-1抑制的新一代t-PA突变体.方法: 根据t-PA的结构特点,去除t-PA分子中的指状区、表皮生长因子和Kringle1区,以含全长t-PA编码区序列的pUC18质粒为模板,经PCR扩增编码氨基酸1~3和176~527位的截短式t-PA DNA序列; 并将该t-PA分子中的PAI-1结合位点,即第373~384位核苷酸(AAG CAC AGG AGG)突变为(GCG GCC GCG GCG),相应的氨基酸KHRR则变为AAAA.结果:测序证实,t-PA突变体的DNA序列正确,将其克隆于大肠杆菌表达载体中,并在大肠杆菌中得到高效表达.表达蛋白占总菌体蛋白的30%,以包涵体形式存在.经蛋白质变性、复性,得到有活性的t-PA突变体.t-PA突变体与PAI-1反应后t-PA的活性未受到抑制.结论:t-PA突变体可能是一种用于治疗心肌梗死和脑血栓等血栓性疾病的强效且剂量要求低的新型生物工程药物. 展开更多
关键词 组织型纤溶酶原激活剂 突变体 基因克隆 表达 纯化
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人PSP94全长cDNA的获得及PSP94-TNF~Δ融合蛋白的构建 被引量:7
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作者 刘庆鑫 刘丽 +4 位作者 刘建香 刘立忠 王颖 谢宝树 冷爱军 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 1999年第3期359-364,共6页
利用RT-PCR从人肥大前列腺组织钓取94个氨基酸的人前列腺分泌蛋白(PSP94)全长cDNA,序列分析结果与文献报道的完全一致.将PSP94成熟肽与人TNFα衍生物(TNFΔ)通过Linker-SAPGTP在基因水... 利用RT-PCR从人肥大前列腺组织钓取94个氨基酸的人前列腺分泌蛋白(PSP94)全长cDNA,序列分析结果与文献报道的完全一致.将PSP94成熟肽与人TNFα衍生物(TNFΔ)通过Linker-SAPGTP在基因水平上融合成5′PSP94-TNFΔ,融合基因DNA序列分析结果与设计的相符合.5′PSP94-TNFΔ在大肠杆菌中表达产物分子量约为31kD,表达量约占菌体总蛋白量的35%.以L929细胞和人前列腺癌细胞株PC-3为靶细胞进行细胞毒分析结果表明,5′PSP94-TNFΔ融合蛋白既具有TNF的细胞毒活性。 展开更多
关键词 TNF衍生物 融合蛋白 PSP94 前列腺癌 细胞毒
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白细胞介素-18基因肌肉注射产生明显抗肿瘤作用(英文) 被引量:5
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作者 张国荣 赵建增 +6 位作者 张晋东 王小平 陈涛 朱美财 刘亚宁 姜树强 王哲 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第1期7-13,共7页
为了探讨人白细胞介素 (h IL ) - 1 8基因转导的抗肿瘤作用 ,构建了 h IL- 1 8c DNA真核表达质粒载体 pc DNA3/h IL- 1 8.将 pc DNA3/h IL- 1 8经脂质体包裹 ,按照 1 0 0μg/只的剂量注射入雄性Balb/c小鼠后肢肌肉 ,在设定时间处死小鼠... 为了探讨人白细胞介素 (h IL ) - 1 8基因转导的抗肿瘤作用 ,构建了 h IL- 1 8c DNA真核表达质粒载体 pc DNA3/h IL- 1 8.将 pc DNA3/h IL- 1 8经脂质体包裹 ,按照 1 0 0μg/只的剂量注射入雄性Balb/c小鼠后肢肌肉 ,在设定时间处死小鼠取注射部位肉提取总 RNA,应用半定量反转录聚合酶链反应 (RT- PCR)及免疫组化法检测了 h IL- 1 8m RNA及其蛋白质在小鼠肌肉中不同时间点的表达水平 .随后 30只雄性 Balb/c小鼠于基因注射后第 7d腹部皮下 (i.d.)或腹腔内 (i.p.)接种 1×1 0 5个同系小鼠 S- 1 80肉瘤细胞 .观察了 S- 1 80肿瘤细胞在腹腔及皮下的生长情况、小鼠体重、肿瘤重量及存活时间 .结果发现 ,pc DNA3/h IL- 1 8注射后 2 d能检测到 h IL- 1 8m RNA表达 ,第 7d表达量较高 ,第 2 8d仍有 h IL- 1 8m RNA表达 .免疫组化染色显示了注射部位散在有 h IL- 1 8蛋白质颗粒 .h IL- 1 8基因注射组小鼠体重、肿瘤重量均比对照组轻 (P值分别小于 0 .0 0 5、0 .0 5) ,存活时间比对照组延长 .结果显示 ,真核表达系统 pc DNA3/h IL - 1 8经脂质体包裹肌注后能有效表达 ,具有明显的抑制肿瘤生长作用 . 展开更多
关键词 人白细胞介素-18 肌肉注射 肿瘤 基因治疗
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人PSP94的分泌表达及其表达产物抗前列腺癌作用 被引量:2
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作者 刘丽 刘建香 +4 位作者 刘立忠 石缨 谢宝树 冷爱军 曹颖 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 2000年第4期542-545,共4页
将编码人 94个氨基酸的前列腺分泌蛋白 ( PSP94) c DNA与酵母整合载体 p PICZαA重组 ,构建的重组质粒线性化后转染酵母细胞 GS1 1 5,获得了 PSP94在酵母细胞中遗传性稳定表达酵母工程细胞 .诱导后的培养物中 ,rh PSP94表达量约为 0 .9m... 将编码人 94个氨基酸的前列腺分泌蛋白 ( PSP94) c DNA与酵母整合载体 p PICZαA重组 ,构建的重组质粒线性化后转染酵母细胞 GS1 1 5,获得了 PSP94在酵母细胞中遗传性稳定表达酵母工程细胞 .诱导后的培养物中 ,rh PSP94表达量约为 0 .9mg/L,分子量约 1 6.5k D.培养上清经离子交换层析纯化后 ,目的蛋白的纯度为 92 % .体外在人前列腺癌细胞上活性分析表明 ,rh PSP94以1 0 0μg/L ,对该细胞的抑制率 2 0 .4% ;单纯新型 TNF,以 1 0 3 U/ml,抑制率 2 9.8% ;rh PSP94和新型 TNF以上述同样剂量联合应用 ,抑制率为 86.3% .提示 PSP94在体外对抗前列腺癌细胞有杀伤作用 ,但不明显 ;PSP94与新型 TNF联合应用 ,可使抑制率明显提高 ,可能 PSP94与新型 TNF有协同抗前列腺癌的作用 . 展开更多
关键词 前列腺分泌蛋白 TNF衍生物 前列腺癌 抗肿瘤
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正加速度重复暴露大鼠脑差异表达基因的筛选 被引量:2
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作者 林凯 蔡庆 +2 位作者 卞修武 刘红巾 朱美财 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第11期956-960,共5页
目的 筛选大鼠经正加速度 (Gositiveacceleration ,+Gz)重复暴露后脑的差异表达基因 ,探讨 +Gz重复暴露致脑损伤的分子机制。方法 应用抑制性消减杂交技术 ,构建高消减效率的 +Gz重复暴露大鼠脑cDNA消减文库 ;用差异筛选技术筛选阳性... 目的 筛选大鼠经正加速度 (Gositiveacceleration ,+Gz)重复暴露后脑的差异表达基因 ,探讨 +Gz重复暴露致脑损伤的分子机制。方法 应用抑制性消减杂交技术 ,构建高消减效率的 +Gz重复暴露大鼠脑cDNA消减文库 ;用差异筛选技术筛选阳性克隆 ;用序列分析确定阳性克隆的性质 ;用RT -PCR证实阳性克隆的可靠性。结果 从消减库中获得70个阳性克隆 ;经差异筛选后 ,选取其中 10个阳性克隆 ,序列分析表明 ,7个克隆与已知基因高度同源 ,3个为新的候选基因。RT -PCR证实了差异表达基因在 +Gz重复暴露大鼠脑中高表达。结论 用抑制性消减杂交技术筛选发现的 3个新的cDNA可能在 展开更多
关键词 正加速度(+Gz) 脑损伤 差异表达基因 抑制性消减杂交
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人TPON端结构域在大肠杆菌中的表达、纯化及活性分析 被引量:1
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作者 刘丽 田生礼 +3 位作者 王艳华 孟岩 芦兴武 谢宝树 《生物化学杂志》 CSCD 1997年第6期666-671,共6页
在利用反转录-PCR从人胎肝中获得编码人血小板生成素(hTPO)全长cD-NA的基础上,综合TPO结构与功能的研究信息,在大肠杆菌中表达了成熟肽N端结构域.目的蛋白在菌体内以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的30... 在利用反转录-PCR从人胎肝中获得编码人血小板生成素(hTPO)全长cD-NA的基础上,综合TPO结构与功能的研究信息,在大肠杆菌中表达了成熟肽N端结构域.目的蛋白在菌体内以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的30%;包涵体经变性、复性、凝胶过滤、离子交换层析等步骤处理后,所得产物给Babl/c小鼠腹腔连续注射8d,第9d摘眼球采血,计数血小板的数量.结果表明,TPON端结构域具有明显促进血小板生成的作用. 展开更多
关键词 血小板生成素 遗传工程 药物 N端结构域 研制
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微量免疫荧光试验和PCR在诊断肺炎衣原体急性感染中的应用
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作者 李建标 蔡庆 +4 位作者 王颖 赵建中 端青 纪树国 朱美财 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2001年第4期459-461,共3页
目的 探讨肺炎衣原体 (Cpn)急性感染在呼吸道疾病中的重要性。方法 用微量免疫荧光 (MIF)试验检测了 93例住院病人血清中Cpn抗体IgG ,同时用PCR测定了其中 5 5例病人咽试子标本中CpnDNA。结果  3 5 .5 %呼吸道疾病存在Cpn急性感染。... 目的 探讨肺炎衣原体 (Cpn)急性感染在呼吸道疾病中的重要性。方法 用微量免疫荧光 (MIF)试验检测了 93例住院病人血清中Cpn抗体IgG ,同时用PCR测定了其中 5 5例病人咽试子标本中CpnDNA。结果  3 5 .5 %呼吸道疾病存在Cpn急性感染。在肺炎组抗体 (效价≥ 5 12 )阳性率为 47.6% ,提示 1998~ 1999年可能处在北京市Cpn流行期 ;在哮喘组的阳性率达到 5 0 % ;在肺心病组和肺癌组的阳性率分别为 5 0 .0 %和 2 6.3 %。PCR检测Cpn的阳性率仅为 9.1% ,MIF和PCR的检测结果存在差别。结论 检测Cpn抗体IgG有助于对Cpn急性感染进行诊断 。 展开更多
关键词 衣原体感染 呼吸道疾病 荧光免疫测定 聚合酶链反应 PCR 肺炎
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血小板生成素基因在体内的表达及对造血祖细胞增殖活性的影响 被引量:5
13
作者 赵建增 刘丽 +1 位作者 陈惠仁 梅英杰 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 1998年第2期117-121,共5页
探讨了从肌肉组织植入的人血小板生成素(TPO)基因在小鼠体内的表达规律,以及对造血祖细胞增殖活性的影响.基因在导入后的24小时内就开始转录,先于血小板、血液TPO浓度、及造血祖细胞的变化.所表达的TPO在血液中的聚积... 探讨了从肌肉组织植入的人血小板生成素(TPO)基因在小鼠体内的表达规律,以及对造血祖细胞增殖活性的影响.基因在导入后的24小时内就开始转录,先于血小板、血液TPO浓度、及造血祖细胞的变化.所表达的TPO在血液中的聚积可持续4周以上.巨核祖细胞,粒系祖细胞都出现2周左右的增殖增长,长于血小板计数的升高,但红系祖细胞的变化不明显.这些结果显示,基因治疗过程中血小板计数等变化源于TPO的表达及刺激,而在此期间一些调控机制被激活,对血小板形成的平衡发挥作用. 展开更多
关键词 血小板生成素 基因治疗 造血祖细胞 细胞增殖
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人白血病抑制因子基因cDNA的克隆及分析 被引量:2
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作者 涂强 王永俊 +6 位作者 李文 谢宝树 朱元晓 阎玉河 余竟源 兰兰 林万明 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 1993年第1期41-42,共2页
白血病抑制因子(leukemia inhibitoryfactor,LIF)是80年代初发现的一种新的细胞因子。它能不可逆地抑制白血病细胞增殖、并诱导其分化,同时它还能在没有明显毒副作用的情况下在体内或体外直接刺激巨核血小板系统生成,增加外周血血小板... 白血病抑制因子(leukemia inhibitoryfactor,LIF)是80年代初发现的一种新的细胞因子。它能不可逆地抑制白血病细胞增殖、并诱导其分化,同时它还能在没有明显毒副作用的情况下在体内或体外直接刺激巨核血小板系统生成,增加外周血血小板数量。 展开更多
关键词 白血病 抑制因子 基因克隆
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外源血小板生成素基因体内导入对循环免疫因子水平的影响 被引量:3
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作者 赵建增 刘丽 梅英杰 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 1999年第3期103-105,共3页
目的:研究外源TPO基因由质粒载体导入后,小鼠体内一些细胞因子的变化规律。方法:用脂质体将表达人TPO的真核表达质粒pcDNA3/hTPO包裹后,注射到Balb/c鼠的后肢肌肉内,用ELISA法检测小鼠血液中多种细胞... 目的:研究外源TPO基因由质粒载体导入后,小鼠体内一些细胞因子的变化规律。方法:用脂质体将表达人TPO的真核表达质粒pcDNA3/hTPO包裹后,注射到Balb/c鼠的后肢肌肉内,用ELISA法检测小鼠血液中多种细胞因子的水平。结果:在TPOcDNA转移到体内后,血液中IFNγ、TNFα和IL2迅速升高。其中,IFNγ与血小板计数呈明显负相关,并且在血小板计数回落后,保持在对照水平的9~12倍;TNFα仅在第1周内与之成正相关,但可达对照水平的120倍;IL2升高幅度较小,与TPO水平相一致。血液中Ⅱ型组织相容性抗原分子也呈升高趋势,与IL2的变化类似;而Ⅰ型分子与TNFα的变化相似。结论:TPO在多方面刺激了机体免疫机能,而免疫因子如IFNγ在血小板生成过程中起重要的调节作用。 展开更多
关键词 血小板生成素 免疫调节 IFN-Γ TNF-α IL-2
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