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以hsa-miR-491-3p为靶标的反义寡核苷酸对NCI-H446细胞生物学特性的影响 被引量：3
1
作者 官士珍 付玉荣 +3 位作者 伊正君 李猛 裴景亮 高昆山 《中国癌症杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期171-176,共6页
背景与目的:miRNAs是一类小分子RNA,参与转录后调控。前期研究结果显示,hsa-miR-491-3p在肺癌和肾癌组织中高表达,目前鲜见其功能研究的报道。本研究旨在探讨以hsa-miR-491-3p为靶标的反义寡核苷酸对人小细胞肺癌NCI-H446细胞生物学特... 背景与目的:miRNAs是一类小分子RNA,参与转录后调控。前期研究结果显示,hsa-miR-491-3p在肺癌和肾癌组织中高表达,目前鲜见其功能研究的报道。本研究旨在探讨以hsa-miR-491-3p为靶标的反义寡核苷酸对人小细胞肺癌NCI-H446细胞生物学特性的影响。方法:合成以hsa-miR-491-3p为靶标的反义寡核苷酸和随机对照序列,转染NCI-H446细胞。实验分4组:空白对照组(组1)、空白转染组(组2)、随机对照组(组3)和反义寡核苷酸组(组4)。用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法筛选最佳作用浓度,Hoechst33258染色检测细胞核的形态变化,流式细胞术检测细胞凋亡和周期变化,划痕实验检测细胞的迁移能力。结果:转染反义寡核苷酸后细胞生长受到抑制,最佳作用浓度为0.5μmol/L。Hoechst33258染色各组的凋亡率分别为(6.67±0.58)%、(7.00±1.00)%、(6.67±1.53)%和(26.33±1.53)%,组4的凋亡率明显高于前3组,差异有统计学意义(P<0.001)。流式细胞仪检测各组的凋亡率分别为(2.44±0.60)%、(2.59±0.85)%、(2.62±1.11)%和(5.22±0.40)%,组4的凋亡率明显高于前3组,差异有统计学意义(P<0.01),且G1期细胞增多,S期细胞减少。划痕实验显示各组细胞24 h的迁移距离分别为(196.88±39.13)、(163.06±21.28)、(225.49±23.42)和(77.41±6.07)μm,组4细胞的迁移距离小于前3组(P<0.05),迁移能力减弱。结论:以hsa-miR-491-3p为靶标的反义寡核苷酸能够抑制NCI-H446细胞增殖,诱导其凋亡,并降低其侵袭能力。 展开更多
关键词 hsa-miR-491-3p 反义寡核苷酸 细胞凋亡 NCI-H446细胞
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人caspase-1基因在肝癌细胞中的表达及对IL-1β水平的影响 被引量：5
2
作者 林志娟 肖伟玲 +2 位作者 王雪净 李青春 梁淑娟 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期29-33,共5页
目的:将人caspase-1基因真核表达载体转染肝癌细胞后观察其表达水平及对IL-1β水平的影响,为研究cas-pase-1与IL-1β的关系及其在慢性炎症与肿瘤中的作用提供依据。方法:利用阳离子聚合物(jetPEI)将pIRES2-EGFP-caspase-1重组表达载体和... 目的:将人caspase-1基因真核表达载体转染肝癌细胞后观察其表达水平及对IL-1β水平的影响,为研究cas-pase-1与IL-1β的关系及其在慢性炎症与肿瘤中的作用提供依据。方法:利用阳离子聚合物(jetPEI)将pIRES2-EGFP-caspase-1重组表达载体和pIRES2-EGFP对照载体转染人肝癌细胞HepG2(HepG2/caspase-1、HepG2/mock),48小时后倒置相差荧光显微镜下观察表达情况,利用RT-PCR、Western blot方法检测两组细胞caspase-1表达水平,采用caspase-1底物显色分析研究的方法检测两组细胞中caspase-1的活性。夹心ELISA法检测细胞培养上清以及细胞裂解液中IL-1β的表达水平。结果:转染48小时后倒置相差显微镜下可见,pIRES2-EGFP-caspase-1和pIRES2-EGFP重组表达载体均能在HepG2细胞中高效表达;HepG2/caspase-1细胞中caspase-1 mRNA表达水平显著提高;经LPS刺激后,HepG2/caspase-1细胞中caspase-1总蛋白的水平明显升高;caspase-1的生物活性水平与对照组相比具有显著性差异(t=25.679,P<0.05);HepG2/caspase-1细胞培养上清中IL-1β的水平明显高于HepG2/mock组细胞(t=3.417,P<0.05),胞浆裂解液中的变化相对不显著(t=2.396,P>0.05)。结论:人caspase-1基因真核表达载体pIRES2-EGFP-caspase-1能够在肝癌细胞中高效表达caspase-1,且该重组表达载体在HepG2细胞中能提高活性IL-1β的表达。 展开更多
关键词 CASPASE-1 肝癌细胞 IL-1Β 炎症
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肝癌细胞特异性IL-1β反义RNA对小鼠移植肝癌的抑制 被引量：6
3
作者 刘艳艳 梁淑娟 +3 位作者 王焕芹 张素华 肖伟玲 吴慧娜 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期253-257,共5页
目的:构建肝癌细胞特异性小鼠IL-1β反义RNA表达载体,观察其对H22肝癌细胞小鼠移植瘤生长的影响及其相关机制。方法:构建由AFP最小启动子和CMV增强子嵌合序列调控的携IL-1β反义RNA表达载体pafpIRES2-antiIL-1β1和pafpIRES2-antiIL-1... 目的:构建肝癌细胞特异性小鼠IL-1β反义RNA表达载体,观察其对H22肝癌细胞小鼠移植瘤生长的影响及其相关机制。方法:构建由AFP最小启动子和CMV增强子嵌合序列调控的携IL-1β反义RNA表达载体pafpIRES2-antiIL-1β1和pafpIRES2-antiIL-1β2,经质粒PCR、限制性酶谱分析、序列测定进行鉴定。反义RNA表达载体转染小鼠H22肝癌细胞,分H22/mock组、H22/antiIL-1β1组、H22/antiIL-1β2三组,RT-PCR检测IL-1β的表达水平。以转染后的H22细胞皮下接种建立荷肝癌小鼠模型,观察移植瘤体积和重量,MTT法检测荷瘤小鼠脾脏中分离的NK细胞对H22细胞的杀伤活性。结果:经质粒PCR、限制性酶谱分析、序列测定证实成功构建能够在肝癌细胞中特异性表达IL-1β反义RNA的表达载体pafpIRES2-anti-IL-1β1和pafpIRES2-antiIL-1β2,转染H22细胞后细胞中IL-1β表达水平明显下降,以pafpIRES2-antiIL-1β2更为显著。成功建立荷肝癌小鼠模型,与H22/mock组小鼠相比,H22/antiIL-1β2组小鼠移植瘤体积较小,生长显著减慢(P<0.05)。H22/anti-IL-1β1、H22/antiIL-1β2组荷瘤小鼠的NK细胞对H22细胞的杀伤活性明显增强(P<0.05或P<0.01)。结论:成功构建的肝癌细胞特异性IL-1β反义RNA表达载体可有效抑制小鼠移植肝癌的生长,其机制与靶向阻断IL-1β表达、上调NK细胞的杀伤活性有关。 展开更多
关键词 肝癌 白细胞介素1Β 反义RNA NK细胞
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AFP启动子调控的小鼠IL-1β重组载体的构建及其在肝癌H22细胞中的表达 被引量：3
4
作者 李青春 梁淑娟 +3 位作者 王雪净 刘艳艳 王焕芹 张素华 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第7期603-605,共3页
目的:构建小鼠甲胎蛋白(AFP)启动子调控的小鼠IL-1β(mIL-1β)重组真核表达载体pafpIRES2-EGFP-mIL-1β,并检测其在真核细胞内的表达。方法:重叠延伸PCR技术(SOE-PCR)获得含小鼠AFP最小启动子及巨细胞病毒(CMV)增强子区(ECMV)的嵌合基因... 目的:构建小鼠甲胎蛋白(AFP)启动子调控的小鼠IL-1β(mIL-1β)重组真核表达载体pafpIRES2-EGFP-mIL-1β,并检测其在真核细胞内的表达。方法:重叠延伸PCR技术(SOE-PCR)获得含小鼠AFP最小启动子及巨细胞病毒(CMV)增强子区(ECMV)的嵌合基因,将其克隆至pIRES2-EGFP载体,构建肝癌细胞特异性表达载体pafpIRES2-EGFP。RT-PCR扩增小鼠IL-1β基因,克隆至pafpIRES2-EGFP,进行酶谱分析及DNA序列测定。利用jetPEI法将其分别转染H22细胞和YAC-1细胞,倒置相差荧光显微镜下观察,RT-PCR分析mIL-1β表达水平的变化。结果:SOE-PCR方法获得长度为537bp的AFP和ECMV嵌合基因,克隆后经限制性酶切和DNA序列分析确认成功构建了小鼠肝癌细胞特异性表达载体pafpIRES2-EGFP。PCR扩增小鼠IL-1β基因后将其克隆至pafpIRES2-EGFP,获得AFP启动子调控的小鼠IL-1β重组真核表达载体pafpIRES2-EGFP-mIL-1β,细胞转染分析证实,该载体能够在小鼠肝癌细胞中特异性高效表达,RT-PCR检测可见转染细胞中mIL-1β水平明显升高。结论:成功构建真核表达载体pafpIRES2-EGFP-mIL-1β,该载体能够在小鼠肝癌细胞中特异性表达IL-1β。 展开更多
关键词 IL-1Β AFP启动子 组织特异性 肝癌
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IL-1β对Hepa1-6细胞增殖、迁移及IFN应答的影响 被引量：1
5
作者 林志娟 梁淑娟 +2 位作者 王焕芹 李艳平 肖伟玲 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期139-142,共4页
目的:构建应用于小鼠肝脏内表达和研究的IL-1β肝癌细胞特异性表达载体,观察其对小鼠Hepa1-6细胞体外增殖活性、迁移能力及干扰素增殖抑制效应等体外生物学行为的影响。方法:由C57BL/6小鼠腹腔液巨噬细胞扩增IL-1β基因,构建肝脏特异性p... 目的:构建应用于小鼠肝脏内表达和研究的IL-1β肝癌细胞特异性表达载体,观察其对小鼠Hepa1-6细胞体外增殖活性、迁移能力及干扰素增殖抑制效应等体外生物学行为的影响。方法:由C57BL/6小鼠腹腔液巨噬细胞扩增IL-1β基因,构建肝脏特异性pLIVE-IL-1β重组表达载体。利用transIT-LT1将鉴定后的pLIVE-IL-1β转染至Hepa1-6肝癌细胞,RT-PCR及双抗体夹心ELISA法分析转染前后IL-1表达水平,MTT法分析IL-1对细胞体外增殖活性的影响;利用细胞划痕实验分析对其迁移能力的影响,并确定对IFN-α诱导的细胞增殖抑制效应的作用。结果:重组载体经限制性酶谱分析酶解出822bp的条带,其序列与GenBank登录的小鼠IL-1β基因一致;转染后的Hepa1-6细胞培养上清中IL-1β的表达明显增高,细胞体外增殖速度明显加快;给予IFN-α作用后,IL-1β的表达使细胞对干扰素的抵抗性明显增强。结论:小鼠IL-1β肝癌组织特异性表达载体pLIVE-IL-1β能够在小鼠肝癌细胞中高效表达IL-1β,并能够显著促进肿瘤的体外增殖和迁移能力,削弱IFN-α对Hepa1-6细胞的增殖抑制作用。 展开更多
关键词 IL-1Β 肝癌 NK细胞 促炎性细胞因子 干扰素
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小鼠分泌型IL-1β真核表达载体的构建及其表达
6
作者 肖伟玲 王雪净 +3 位作者 牟东珍 林志娟 王焕芹 梁淑娟 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第7期744-746,共3页
目的:构建小鼠经典分泌途径IL-1β真核表达载体,转染至Hepa1-6细胞,并测定其分泌表达水平。方法:引物延伸获得小鼠AFP信号肽序列(sAFP),RT-PCR扩增获得小鼠IL-1β成熟蛋白基因序列(mIL-1β),SOE方法将两段序列拼接形成融合基因,与pIRES2... 目的:构建小鼠经典分泌途径IL-1β真核表达载体,转染至Hepa1-6细胞,并测定其分泌表达水平。方法:引物延伸获得小鼠AFP信号肽序列(sAFP),RT-PCR扩增获得小鼠IL-1β成熟蛋白基因序列(mIL-1β),SOE方法将两段序列拼接形成融合基因,与pIRES2-EGFP质粒重组构建分泌型真核表达载体pIRES2-EGFP-smIL-1β,并将其转染至Hepa1-6细胞,RT-PCR检测融合基因的表达水平,Western blot检测细胞内mIL-1β蛋白的表达,ELISA法测定培养上清及细胞裂解液中mIL-1β水平。结果:经SOE法拼接获得的融合基因与GenBank中登录的序列一致,RT-PCR检测显示该载体能够在Hepa1-6细胞中表达融合基因mRNA,细胞培养上清中mIL-1β的分泌水平明显上升,而胞质中的mIL-1β无明显变化。结论:成功地构建了经典途径分泌的mIL-1β重组表达载体,该载体可以在Hepa1-6细胞培养上清中有效分泌具有生物活性的mIL-1β。 展开更多
关键词 鼠白细胞介素1β 信号肽 分泌表达 肝癌细胞
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肿瘤源性IL-1β激活血管内皮细胞中NF-κB p65通路促进其对肝癌细胞的粘附 被引量：2
7
作者 房佩佩 付晓燕 +5 位作者 吴沛恩 吴圆圆 张倩 张凯铖 彭美玉 梁淑娟 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2022年第3期294-302,共9页
目的 探讨肿瘤来源的白细胞介素1β(IL-1β)对血管内皮细胞粘附肝癌细胞功能的影响及分子机制。方法 慢病毒转染建立稳定表达IL-1β(HepG2/IL-1β)和GFP(HepG2/GFP)的HepG2细胞,ELISA法测定细胞培养上清中IL-1β浓度,以含IL-1β的HepG2... 目的 探讨肿瘤来源的白细胞介素1β(IL-1β)对血管内皮细胞粘附肝癌细胞功能的影响及分子机制。方法 慢病毒转染建立稳定表达IL-1β(HepG2/IL-1β)和GFP(HepG2/GFP)的HepG2细胞,ELISA法测定细胞培养上清中IL-1β浓度,以含IL-1β的HepG2细胞条件培养液(IL-1β-CM)作为肿瘤源性IL-1β来源,以GFP慢病毒感染的HepG2细胞条件性培养液(Ctrl-CM)为对照。以含10 ng/mL IL-1β的IL-1β-CM刺激人脐静脉内皮细胞(HUVECs+IL-1β-CM),观察其对HepG2/IL-1β、HepG2/GFP细胞的粘附能力,并与HUVECs+Ctrl-CM比较。qRT-PCR法检测血管内皮细胞中E-选择素(CD62E)、细胞间粘附分子-1(ICAM-1,即CD54)、血管细胞粘附分子-1(VCAM-1,即CD106)mRNA表达水平。流式细胞术检测CD62E、CD54蛋白表达水平。Western blot分析HUVECs中IL-1β-CM激活的信号通路,以及靶向阻断信号通路对粘附分子表达和细胞间粘附作用的影响。结果 肿瘤源性IL-1β显著促进了HUVECs对HepG2细胞的粘附作用,明显上调HUVECs细胞中CD62E、CD54 mRNA表达水平。CD62E蛋白在IL-1β刺激后4 h短暂升高,CD54蛋白呈现为持续升高模式,自刺激4 h起维持至24 h。IL-1β激活血管内皮细胞中NF-κB p65、p38 MAPK信号通路,其中NF-κB p65位于上游且对p38 MAPK活化具有控制作用。靶向阻断NF-κB p65通路显著下调了HUVECs表面CD62E、CD54表达和对HepG2细胞的粘附效应。结论 肿瘤源性IL-1β通过激活NF-κB p65为主的信号机制调控血管内皮细胞CD62E和CD54表达,促进血管内皮细胞对肝癌细胞的粘附作用,进而在肝癌细胞的浸润转移中发挥作用。 展开更多
关键词 肝癌 白细胞介素1Β 血管内皮细胞 粘附分子 信号通路
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人异质性胞核核糖核蛋白I(hnRNP I)原核表达及初步应用
8
作者 孙成涛 冯帆 +3 位作者 王蕾 刘培红 牟东珍 鞠吉雨 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第12期1092-1094,共3页
目的:克隆人异质性胞核核糖核蛋白I(hnRNP I)基因并构建原核表达载体,用纯化的重组蛋白进行系统性硬化症(SSc)体外诊断应用研究。方法:从体外培养的HeLa细胞中提取总RNA,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增hnRNP I基因,构建原核表达载体... 目的:克隆人异质性胞核核糖核蛋白I(hnRNP I)基因并构建原核表达载体,用纯化的重组蛋白进行系统性硬化症(SSc)体外诊断应用研究。方法:从体外培养的HeLa细胞中提取总RNA,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增hnRNP I基因,构建原核表达载体pET-30a-hnRNP I,在原核表达系统E.coliBL21(DE3)中表达重组蛋白。重组蛋白纯化后作为抗原对包括系统性硬化症(SSc)、系统性红斑狼疮(SLE)、干燥综合征(SS)、混合型结缔组织病(MCTD)、未分化型结缔组织病(UCTD)、类风湿性关节炎(RA)、正常对照(control)在内的血清相应抗体进行ELISA检测。结果:成功构建了原核表达载体pET-30a-hnRNPI,在IPTG诱导下在E.coli BL21(DE3)中高效表达相对分子质量(Mr)为59600的重组hnRNP I蛋白,重组蛋白可以可溶蛋白和包涵体蛋白两种形式存在。hnRNP I蛋白抗体在SSc中阳性率(48.72%)明显高于其他各组(P<0.05)。结论:利用构建的原核表达载体成功表达出hnRNP I蛋白,此重组蛋白可用于SSc的临床诊断检测。 展开更多
关键词 人异质性胞核核糖核蛋白I(hnRNP I) 原核表达 系统性硬化症
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