羊种布鲁氏菌LpxB基因的克隆、原核表达及其蛋白的生物信息学分析 被引量：10

1

作者 聂鑫 赵天靖 +8 位作者 曹瑞勇 彭冬梅 李国华 李亚颖 徐开莲 朱华培 庞峰 王凤阳 杜丽 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第7期1681-1687,共7页

试验旨在克隆羊种布鲁氏菌LpxB基因并进行原核表达和蛋白的生物信息学分析。以布鲁氏菌M5-90株基因组为模板,参照GenBank中M5-90株基因组DNA序列,用DNAMAN软件设计1对引物,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增得到大小为1 188bp的LpxB基因,将... 试验旨在克隆羊种布鲁氏菌LpxB基因并进行原核表达和蛋白的生物信息学分析。以布鲁氏菌M5-90株基因组为模板,参照GenBank中M5-90株基因组DNA序列,用DNAMAN软件设计1对引物,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增得到大小为1 188bp的LpxB基因,将其连接入pMD20-T载体上,构建pMD20-T-LpxB重组质粒,将其转化到E.coli DH5α感受态细胞中,经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定正确后扩大培养。将BamHⅠ和XhoⅠ双酶切获得的LpxB片段连接入pET-28a,构建重组质粒pET-28a-LpxB,转化到E.coli BL21(DE3)中,双酶切鉴定正确后扩大培养。经IPTG诱导其表达,用SDS-PAGE和Western blotting对蛋白进行鉴定。运用DNAMAN、BioEdit等软件对LpxB基因编码的氨基酸序列进行分析。结果表明,本研究成功克隆了LpxB基因并进行了蛋白表达,在LpxB蛋白二级结构中,α-螺旋、伸展链、β-折叠和无规卷曲分别占52.41%、14.94%、8.10%和24.55%。 展开更多

关键词 羊种布鲁氏菌 LpxB基因 克隆 原核表达 生物信息学分析

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布鲁氏菌外膜蛋白16基因的克隆及原核表达 被引量：6

2

作者 贾晓晓 焦寒伟 +7 位作者 郭莳雨 史巧芸 荣辉 张珈宁 朱华培 杜丽 成鹰 王凤阳 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2013年第9期51-54,共4页

为了成功克隆外膜蛋白16(outer membrane proteins 16,Omp16)基因并对其进行原核表达,试验根据GenBank中羊布鲁氏菌M5-90株外膜蛋白Omp16基因序列(登录号:JF918760.1)设计1对引物,从布鲁氏菌基因组中扩增出大小约为507bp的目的基因片段... 为了成功克隆外膜蛋白16(outer membrane proteins 16,Omp16)基因并对其进行原核表达,试验根据GenBank中羊布鲁氏菌M5-90株外膜蛋白Omp16基因序列(登录号:JF918760.1)设计1对引物,从布鲁氏菌基因组中扩增出大小约为507bp的目的基因片段,凝胶回收纯化目的片段,连接入pMD20-T质粒,转化E.coli DH5α并测序,测序正确后再亚克隆入pET-28a(+)表达载体,构建重组质粒pET-Omp16,转化入E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导其表达,最后用Western blotting分析方法鉴定诱导得到的蛋白。结果表明,成功构建了pET-Omp16原核表达载体,并在E.coli BL21中表达了Omp16基因,诱导得到的蛋白经鉴定与目的蛋白大小一致,证明成功表达了目的基因。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 外膜蛋白16基因 克隆 原核表达

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羊种布鲁氏菌dhbC基因的克隆、原核表达及生物信息学分析 被引量：5

3

作者 李宝宝 聂鑫 +9 位作者 杨小健 曹瑞勇 朱姝 黄海峰 张振兴 彭冬梅 李国华 李亚颖 王凤阳 杜丽 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2017年第7期1947-1953,共7页

试验旨在对羊种布鲁氏菌dhbC基因进行克隆及原核表达,并对其表达蛋白进行生物信息学分析。参照GenBank中布鲁氏菌M5-90株dhbC基因序列信息设计1对引物,通过PCR反应扩增获得dhbC基因片段。将得到的dhbC基因连接到pMD20-T载体,构建pMD20-T... 试验旨在对羊种布鲁氏菌dhbC基因进行克隆及原核表达,并对其表达蛋白进行生物信息学分析。参照GenBank中布鲁氏菌M5-90株dhbC基因序列信息设计1对引物,通过PCR反应扩增获得dhbC基因片段。将得到的dhbC基因连接到pMD20-T载体,构建pMD20-T-dhbC重组质粒并转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞,提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后构建pET28a-dhbC重组质粒,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞。经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blotting进行分析。运用生物信息学软件DNAMAN及相关在线网站ProtParam、SOPMA及Protscale对dhbC基因编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果表明,试验成功克隆了大小约为1 093bp的dhbC基因并进行了蛋白表达,表达的融合蛋白大小约为47ku,且主要以包涵体形式存在。dhbC蛋白的分子式为C1866H2968N544O562S15,分子质量为42 496.3u,理论等电点(pI)为5.81,消光系数为33 835,不稳定系数为36.76,疏水指数为86.19,总平均疏水性(GRAVY)为-0.215。预测在哺乳动物网织红细胞的半衰期为30h,其二级结构以α-螺旋(41.94%)和无规则卷曲(31.46%)为主。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 dhbC基因 克隆 原核表达 生物信息学分析

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羊布鲁菌外膜蛋白Bp-26基因的克隆及其原核表达 被引量：4

4

作者 史巧芸 荣辉 +7 位作者 郭莳雨 贾晓晓 张珈宁 朱华培 杜丽 成鹰 焦寒伟 王凤阳 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2013年第9期15-17,共3页

应用PCR扩增羊布鲁菌M5-90株基因组DNA,得到大小为753bp的Bp-26基因,将其克隆入pMD20-T载体上,测序正确后,构建重组质粒pET-28a-Bp-26,转化到大肠埃希菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导其表达,用Western blot鉴定蛋白。结果表明,成功构建了pET-2... 应用PCR扩增羊布鲁菌M5-90株基因组DNA,得到大小为753bp的Bp-26基因,将其克隆入pMD20-T载体上,测序正确后,构建重组质粒pET-28a-Bp-26,转化到大肠埃希菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导其表达,用Western blot鉴定蛋白。结果表明,成功构建了pET-28a-Bp-26原核表达载体,并在E.coli BL21中表达Bp-26基因,为开展羊布鲁菌Bp-26目的蛋白的抗原性分析和功能研究奠定了基础。 展开更多

关键词 羊布鲁菌 Bp-26基因 克隆 原核表达

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羊源类鼻疽伯克霍尔德菌BPSS1512基因克隆、原核表达及其蛋白的生物信息学分析 被引量：3

5

作者 曹瑞勇 聂鑫 +9 位作者 李宝宝 张振兴 黄海峰 李亚颖 彭冬梅 李国华 朱姝 杨小健 杜丽 王凤阳 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2017年第8期2234-2240,共7页

为克隆羊源类鼻疽伯克霍尔德菌BPSS1512基因,并对其编码的蛋白进行生物信息学分析,以类鼻疽伯克霍尔德菌基因组为模板,参照GenBank中Burkholderia pseudomallei K96243株基因组DNA序列(登录号:NC_006351.1)设计引物,PCR扩增BPSS1512基因... 为克隆羊源类鼻疽伯克霍尔德菌BPSS1512基因,并对其编码的蛋白进行生物信息学分析,以类鼻疽伯克霍尔德菌基因组为模板,参照GenBank中Burkholderia pseudomallei K96243株基因组DNA序列(登录号:NC_006351.1)设计引物,PCR扩增BPSS1512基因,构建重组质粒,SDS-PAGE和Western blotting分析其蛋白表达,DNAMAN等软件对BPSS1512基因编码的氨基酸序列进行分析。结果显示,PCR扩增成功得到1 425bp的特异性条带,BamHⅠ和HindⅢ双酶切后得到约为5 000和1 500bp的条带,表明重组质粒pET-28a-BPSS1512构建成功,IPTG浓度为10mmol/L,诱导时间8h为最适宜的诱导条件。BPSS1512基因编码的蛋白质分子质量为53ku,在包涵体中表达;在BPSS1512蛋白二级结构中,α-螺旋、延伸链和无规卷曲分别占24.05%、14.77%、61.18%,并且疏水性区域分布在-2.0^+2.4之间,说明BPSS1512蛋白具有较强的疏水性,本试验结果可为类鼻疽病的防制提供参考依据。 展开更多

关键词 类鼻疽伯克霍尔德菌 BPSS1512基因 克隆 原核表达 生物信息学分析

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羊种布鲁氏菌Wzt基因的克隆及原核表达 被引量：3

6

作者 庞峰 贾晓晓 +7 位作者 赵天靖 朱华培 徐开莲 郭莳雨 史巧芸 荣辉 周海龙 王凤阳 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第11期54-57,共4页

为进一步研究Wzt蛋白在光滑型脂多糖合成路径中的作用,本试验利用PCR技术,以羊种布鲁氏菌16 M株基因组为模板,扩增出大小为759bp的Wzt基因片段,将其连入pMD20-T载体,测序正确后构建重组质粒pET-28a-Wzt,转化E.coli BL21（DE3）工程菌,I... 为进一步研究Wzt蛋白在光滑型脂多糖合成路径中的作用,本试验利用PCR技术,以羊种布鲁氏菌16 M株基因组为模板,扩增出大小为759bp的Wzt基因片段,将其连入pMD20-T载体,测序正确后构建重组质粒pET-28a-Wzt,转化E.coli BL21（DE3）工程菌,IPTG诱导其表达,最后用Western blotting鉴定蛋白。结果显示,扩增出的Wzt基因片段大小为759bp,与GenBank中登录的羊种布鲁氏菌16M株Wzt基因序列（登录号：AF047478.1）同源性为99.87%,证明成功克隆了Wzt基因,同时成功构建了pET-28a-Wzt原核表达载体,并在E.coli BL21（DE3）工程菌中表达了Wzt蛋白,诱导得到的融合蛋白大小约为30ku,位于25～35ku之间,与目的蛋白大小一致,结果表明成功表达了目的基因。 展开更多

关键词 羊种布鲁氏菌 Wzt基因 克隆 原核表达

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基因Ⅳ型戊型肝炎病毒 ORF3对 HEK293细胞 MAPKs磷酸化的影响 被引量：2

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作者 杜丽 成鹰 +9 位作者 史巧芸 焦寒伟 荣辉 张珈宁 贾晓晓 郭莳雨 朱华培 赵天靖 徐开莲 王凤阳 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2014年第4期46-48,共3页

为了分析戊型肝炎病毒ORF3蛋白对于靶细胞MAPK磷酸化的影响,应用人磷酸化MAPK抗体微阵列比较稳定表达EGFP-ORF3的HEK293细胞和稳定表达EGFP的HEK293细胞的磷酸化MAPK表达谱,筛选获得显著上调/下调的磷酸化MAPK。结果表明,在稳定表达EGFP... 为了分析戊型肝炎病毒ORF3蛋白对于靶细胞MAPK磷酸化的影响,应用人磷酸化MAPK抗体微阵列比较稳定表达EGFP-ORF3的HEK293细胞和稳定表达EGFP的HEK293细胞的磷酸化MAPK表达谱,筛选获得显著上调/下调的磷酸化MAPK。结果表明,在稳定表达EGFP-ORF3的HEK293细胞,p-Akt2、p-Aktpan、p-ERK1、p-ERF2、p-RSK1的表达水平升高,而p-P38б表达水平降低。结果表明,ORF3蛋白影响了HEK293细胞的p-Akt2、p-Aktpan、p-ERK1、p-ERF2、p-RSK1、p-P38б等MAPKs的磷酸化水平,为HEV ORF3对于靶细胞磷酸化MAPK表达影响的分子机制研究提供了重要依据。 展开更多

关键词 蛋白芯片 戊型肝炎病毒 靶细胞 MAPK磷酸化 表达

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海南黑山羊MBL2基因的转录调控元件的筛选与分析 被引量：2

8

作者 王雪梅 翟哲 +9 位作者 陈巧玲 吴艳茹 吴昊天 黄惠娴 刘志勇 李崇瑞 满初日嘎 王凤阳 杜丽 陈思 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第6期1795-1806,共12页

甘露聚糖结合凝集素C(mannose binding lectin C,MBL-C)是C型(Ca^(2+)依赖型)凝集素超家族的成员,其作为一种急性期蛋白,具有抗细菌感染的功能,参与机体的天然免疫反应。为鉴定出结合在MBL2基因启动子区(1009 bp)的重要转录因子,探寻该... 甘露聚糖结合凝集素C(mannose binding lectin C,MBL-C)是C型(Ca^(2+)依赖型)凝集素超家族的成员,其作为一种急性期蛋白,具有抗细菌感染的功能,参与机体的天然免疫反应。为鉴定出结合在MBL2基因启动子区(1009 bp)的重要转录因子,探寻该基因的转录调控机制,本研究选取海南黑山羊MBL2基因的启动子序列1009 bp,采用DNA重组技术克隆6个转录起始位点上游1009 bp的启动子5′端侧翼缺失序列,克隆片段经双酶切后连接至pGL3-Basic载体。重组质粒转染至293T细胞中,结合双荧光素酶活性检测系统筛选MBL2基因的核心启动子区域。通过在线生物信息学软件预测山羊MBL2基因的核心启动子区域的转录因子结合位点,利用点突变技术构建转录因子结合位点缺失的载体,转染293T细胞后结合双荧光素酶活性检测系统分析其转录活性。结果表明,海南黑山羊MBL2基因的核心启动子区域位于转录起始位点上游-304~-45 bp范围内,在线软件分析该区域存在RELA、NF-κB2、MZF1等3种转录因子结合位点。双荧光素酶报告分析结果表明,RELA和NF-κB2的结合位点缺失后均使山羊MBL2基因的转录活性极显著下降(P<0.01)。结果提示,RELA和NF-κB2对山羊MBL2基因的转录活性可能具有重要的正调控作用。该研究为进一步探寻海南黑山羊MBL2基因的功能提供理论依据。 展开更多

关键词 海南黑山羊 MBL2基因 转录调控 双荧光素酶 核心启动子

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基因Ⅳ型戊型肝炎病毒ORF3对靶细胞脂肪因子表达的影响 被引量：2

9

作者 杜丽 成鹰 +7 位作者 史巧芸 焦寒伟 荣辉 张珈宁 贾晓晓 郭莳雨 朱华培 王凤阳 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2013年第6期78-80,共3页

为了探讨戊型肝炎病毒ORF3影响靶细胞脂肪因子表达的分子机制,应用蛋白芯片技术比较稳定表达EGFP-ORF3的HEK293细胞和稳定表达EGFP的HEK293细胞的脂肪因子表达谱,筛选获得显著上调/下调的脂肪因子。结果表明,在稳定表达EGFP-ORF3的HEK29... 为了探讨戊型肝炎病毒ORF3影响靶细胞脂肪因子表达的分子机制,应用蛋白芯片技术比较稳定表达EGFP-ORF3的HEK293细胞和稳定表达EGFP的HEK293细胞的脂肪因子表达谱,筛选获得显著上调/下调的脂肪因子。结果表明,在稳定表达EGFP-ORF3的HEK293细胞,Fas和TIMP-2的表达水平升高,而ACE-2表达水平降低。研究结果为HEV ORF3对于靶细胞重要脂肪因子表达影响的分子机制研究提供了重要依据。 展开更多

关键词 蛋白芯片 戊型肝炎病毒 靶细胞 脂肪因子 表达

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羊口疮病毒ORF059基因的真核表达研究 被引量：2

10

作者 朱姝 庞峰 +7 位作者 李国华 李亚颖 彭冬梅 杨小健 聂鑫 曹瑞勇 王凤阳 杜丽 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第9期2291-2295,共5页

试验旨在扩增羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)ORF059基因并进行真核表达。提取羊ORFV HCE弱毒株基因组为模板,参照GenBank上ORF059的基因序列,利用DNAMAN设计引物,应用PCR扩增ORF059目的片段,凝胶回收后将其连入pEGFP-N1质粒,构建重组质粒pE... 试验旨在扩增羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)ORF059基因并进行真核表达。提取羊ORFV HCE弱毒株基因组为模板,参照GenBank上ORF059的基因序列,利用DNAMAN设计引物,应用PCR扩增ORF059目的片段,凝胶回收后将其连入pEGFP-N1质粒,构建重组质粒pEGFP-ORF059-N1,测序正确后瞬时转染NIH3T3细胞,应用荧光显微镜观察,Western blotting鉴定融合蛋白的表达。结果表明,ORF059基因片段大小为1 005bp;重组质粒pEGFP-ORF059-N1构建正确;转染pEGFP-ORF059-N1的NIH3T3细胞有明显的绿色荧光;表达的融合蛋白大小约为64ku。本试验结果为进一步研究ORF059的作用机理奠定了基础。 展开更多

关键词 羊口疮病毒 ORF059基因 真核表达 NIH3T3细胞

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五指山小型猪APEX1基因cDNA的克隆及生物信息学分析 被引量：1

11

作者 李治深 杜丽 +7 位作者 刘涛 申明霞 王凤阳 成鹰 陈品林 林杰材 满初日嘎 祁超 《安徽农业科学》 CAS 北大核心 2009年第30期14621-14624,共4页

[目的]对五指山小型猪脱嘌呤嘧啶核酸内切酶cDNA进行克隆和生物信息学分析。[方法]以构建的五指山小型猪外周血白细胞cDNA文库为材料,采用菌落PCR方法,克隆得到APEX1基因全长cDNA,并运用生物信息学软件对该基因核苷酸序列及其编码蛋白... [目的]对五指山小型猪脱嘌呤嘧啶核酸内切酶cDNA进行克隆和生物信息学分析。[方法]以构建的五指山小型猪外周血白细胞cDNA文库为材料,采用菌落PCR方法,克隆得到APEX1基因全长cDNA,并运用生物信息学软件对该基因核苷酸序列及其编码蛋白的理化性质及二级结构等进行分析和预测。[结果]生物信息学分析表明,该cDNA全长1392bp,5′非翻译区长132bp,3′非翻译区长303bp,含有一个957bp的完整开放阅读框,编码318个氨基酸。该蛋白的分子量为35kD,等电点为8.05。比对分析表明,五指山小型猪APEX1基因的核酸序列及其氨基酸序列与人、小鼠、黑猩猩等哺乳动物具有较高的相似性。[结论]成功克隆了五指山小型猪A-PEX1基因cDNA,为进一步研究APEX1在动物体内的作用机制奠定了基础。 展开更多

关键词 五指山小型猪 脱嘌呤嘧啶核酸内切酶 CDNA文库 克隆 序列分析

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布鲁菌外膜蛋白Omp22基因的原核表达与生物信息学分析 被引量：1

12

作者 朱华培 赵天靖 +10 位作者 徐开莲 贾晓晓 郭莳雨 史巧芸 庞峰 荣辉 张珈宁 成鹰 焦寒伟 杜丽 王凤阳 《动物医学进展》 北大核心 2015年第3期9-12,共4页

克隆布鲁菌Omp22基因,原核表达后进行生物学信息分析。根据GenBank中羊种布鲁菌M5-90株基因组PCR扩增出639bp的目的基因片段,构建克隆重组质粒pMD-20T-Omp22,转化入E.coli DH5α。测序正确后构建表达重组质粒pET-28a-Omp22,转化入E.coli... 克隆布鲁菌Omp22基因,原核表达后进行生物学信息分析。根据GenBank中羊种布鲁菌M5-90株基因组PCR扩增出639bp的目的基因片段,构建克隆重组质粒pMD-20T-Omp22,转化入E.coli DH5α。测序正确后构建表达重组质粒pET-28a-Omp22,转化入E.coli BL21(DE3)。IPTG诱导表达,Western blot鉴定诱导融合蛋白。结果表明,成功克隆Omp22基因,构建pET-28a-Omp22原核表达载体,在E.coli BL21(DE3)中表达Omp22基因。DNA Man和BIOEDIT软件生物性息学分析Omp22融合蛋白二级结构中α-螺旋占22.17%;伸展链占19.81%;β-折叠占2.83%;无规卷曲占55.19%。说明该蛋白具有较高亲水性。 展开更多

关键词 布鲁菌 外膜蛋白22基因 克隆 原核表达 生物信息学分析

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水牛MD-2 cDNA基因的克隆与原核表达 被引量：1

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作者 焦寒伟 杜丽 +6 位作者 雷明 张冬琳 郝永昌 张晓茹 匡文华 成鹰 王凤阳 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2011年第9期9-13,共5页

为探讨水牛抵抗革兰阴性菌感染的免疫机制,克隆、表达了水牛髓样分化蛋白-2(bMD-2)基因,并用Western blot进行鉴定。采用RT-PCR方法从水牛外周血白细胞中扩增bMD-2基因,构建pET28a-bMD-2表达载体,转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,IPTG诱导... 为探讨水牛抵抗革兰阴性菌感染的免疫机制,克隆、表达了水牛髓样分化蛋白-2(bMD-2)基因,并用Western blot进行鉴定。采用RT-PCR方法从水牛外周血白细胞中扩增bMD-2基因,构建pET28a-bMD-2表达载体,转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果显示,bMD-2基因含有一个483 bp的开放阅读框,编码161个氨基酸;37℃条件下,经1 mmol/LIPTG诱导表达6 h后,His-bMD-2在E.coliBL21中表达量最高,并以包涵体的形式存在,融合蛋白的分子质量约为25 ku。结果表明水牛MD-2原核表达载体成功构建并表达,为继续深入对水牛MD-2基因功能的研究提供参考。 展开更多

关键词 水牛 MD-2 克隆 原核表达

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基因Ⅳ型戊型肝炎病毒开放阅读框3表达的蛋白(pORF3)对L02细胞基质金属蛋白酶(MMP)表达的影响

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作者 郭莳雨 史巧芸 +9 位作者 贾晓晓 朱华培 赵天靖 庞峰 徐开莲 梁源祥 崔克 杜丽 吴科榜 王凤阳 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2015年第4期804-809,共6页

为了探讨基因Ⅳ型戊型肝炎病毒开放阅读框3(ORF3)表达的蛋白(pORF3)影响靶细胞基质金属蛋白酶(MMP)表达的分子机制,试验运用蛋白芯片技术对比分析了稳定表达pEGFP-ORF3和pEGFP的L02细胞中基质金属蛋白酶表达谱,筛选出表达水平上调/下调... 为了探讨基因Ⅳ型戊型肝炎病毒开放阅读框3(ORF3)表达的蛋白(pORF3)影响靶细胞基质金属蛋白酶(MMP)表达的分子机制,试验运用蛋白芯片技术对比分析了稳定表达pEGFP-ORF3和pEGFP的L02细胞中基质金属蛋白酶表达谱,筛选出表达水平上调/下调的基质金属蛋白酶。结果表明,在稳定表达pEGFP-ORF3的L02细胞中,TIMP-1、TIMP-2和TIMP-4表达水平均降低。本试验结果为戊型肝炎病毒pORF3对L02细胞中基质金属蛋白酶相关蛋白表达影响的分子机制研究提供了理论依据。 展开更多

关键词 蛋白芯片 戊型肝炎 L02细胞 基质金属蛋白酶 表达

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羊传染性脓疱病毒CEV112基因的克隆与原核表达

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作者 杨小健 李亚颖 +7 位作者 庞峰 李国华 彭冬梅 朱姝 聂鑫 曹瑞勇 王凤阳 杜丽 《动物医学进展》 北大核心 2017年第3期68-72,共5页

为了克隆羊传染性脓疱病毒CEV112基因并对其进行原核表达,根据GenBank中CEV112基因序列信息设计1对引物,以CEV基因组为模板,采用PCR扩增出1条大小为867bp的CEV112基因,将其连接到pMD20-T载体上,构建pMD20-T-CEV112重组质粒,转化到大肠... 为了克隆羊传染性脓疱病毒CEV112基因并对其进行原核表达,根据GenBank中CEV112基因序列信息设计1对引物,以CEV基因组为模板,采用PCR扩增出1条大小为867bp的CEV112基因,将其连接到pMD20-T载体上,构建pMD20-T-CEV112重组质粒,转化到大肠埃希菌(E.coli)DH5α感受态细胞中,提取质粒进行酶切鉴定。鉴定正确后构建重组质粒pET28a-CEV112,转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blot进行分析。结果表明,成功构建了pET-28a-CEV112原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达了CEV112基因,表达的融合蛋白大小约36ku,且主要以包涵体形式存在,为后续开展CEV112基因的功能研究奠定了基础。 展开更多

关键词 羊传染性脓疱病毒 CEV112基因 克隆 原核表达

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转基因表达的时空调控

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作者 杜丽 孟庆文 +1 位作者 满处日嘎 王凤阳 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2010年第10期102-105,共4页

建立转基因表达的时空调控系统,对于分析基因在组织或发育阶段的特异表达,以及建立研究外源基因表达、调控的动物模型等方面,具有极其重要的应用价值。论文综述了近年来基于四环素(tetracy-cline,Tet)的调控系统,基于酵母转录激活蛋白,... 建立转基因表达的时空调控系统,对于分析基因在组织或发育阶段的特异表达,以及建立研究外源基因表达、调控的动物模型等方面,具有极其重要的应用价值。论文综述了近年来基于四环素(tetracy-cline,Tet)的调控系统,基于酵母转录激活蛋白,小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)和RNA干扰(RNA interference,RNAi)等转基因表达的时空调控技术研究进展。 展开更多

关键词 转基因 表达 时空调控

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布鲁氏菌外膜蛋白2b基因的克隆、原核表达及蛋白生物信息学分析 被引量：7

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作者 赵天靖 贾晓晓 +10 位作者 焦寒伟 朱华培 徐开莲 郭莳雨 史巧芸 荣辉 成鹰 张珈宁 庞峰 杜丽 王凤阳 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第9期11-14,共4页

本试验旨在克隆布鲁氏菌外膜蛋白2b(Omp2b)基因并进行原核表达和蛋白的生物信息学分析。根据布鲁氏菌M5-90株外膜蛋白Omp2b基因序列设计引物,以布鲁氏菌基因组为模板,通过PCR技术扩增得到Omp2b基因片段,回收纯化后,将此片段连接入pMD20-... 本试验旨在克隆布鲁氏菌外膜蛋白2b(Omp2b)基因并进行原核表达和蛋白的生物信息学分析。根据布鲁氏菌M5-90株外膜蛋白Omp2b基因序列设计引物,以布鲁氏菌基因组为模板,通过PCR技术扩增得到Omp2b基因片段,回收纯化后,将此片段连接入pMD20-T质粒,将该重组质粒转化E.coli DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆菌提取质粒后,送公司测序。将该片段亚克隆入pET28a载体,构建pET28a-Omp2b表达载体,转化E.coli BL21(DE3)菌株,IPTG诱导其表达,用SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定此蛋白。运用DNAMAN、BioEdit等各种工具软件对Omp2b基因编码的氨基酸序列进行分析。结果显示,成功克隆了Omp2b基因,其开放阅读框为1041bp,编码347个氨基酸;构建了pET28a-Omp2b原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中成功表达了Omp2b基因,表达蛋白约38ku;Omp2b蛋白二级结构中α-螺旋、伸展链、β-折叠和无规卷曲分别占20.17%、26.22%、5.76%和47.84%。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 Omp2b 克隆 原核表达 生物信息学分析

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羊种布鲁氏菌Omp10基因的克隆及原核表达 被引量：8

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作者 徐开莲 朱华培 +10 位作者 赵天靖 贾晓晓 郭莳雨 庞峰 焦寒伟 成鹰 杜丽 史巧芸 荣辉 张珈宁 王凤阳 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2014年第12期122-125,共4页

根据GenBank公布的羊布鲁氏菌(B.melitensis)M5-90株外膜蛋白(outer membrane protein,Omp)基因序列,设计1对引物,以其全基因组为模板,采用PCR技术对其进行扩增,得到381bp的目的片段,连接入pMD20-T载体,转化E.coli DH5α感受态细胞;测... 根据GenBank公布的羊布鲁氏菌(B.melitensis)M5-90株外膜蛋白(outer membrane protein,Omp)基因序列,设计1对引物,以其全基因组为模板,采用PCR技术对其进行扩增,得到381bp的目的片段,连接入pMD20-T载体,转化E.coli DH5α感受态细胞;测序正确后,构建pET-28a-Omp10原核表达质粒,再将该质粒转化入E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白His-Omp10,用SDS-PAGE和Western blotting进行分析。结果表明,成功构建了含Omp10基因的原核表达载体,并在E.coli BL21(DE3)中表达了Omp10基因,诱导得到的融合蛋白经鉴定与目的蛋白大小一致,证明Omp10得到成功表达。该试验为布鲁氏菌病的进一步研究奠定基础。 展开更多

关键词 布鲁氏菌 Omp10基因 原核表达 克隆

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多杀性巴氏杆菌OmpA基因的原核表达及生物信息学分析 被引量：7

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作者 郑义盈 李宝宝 +10 位作者 黄海峰 张振兴 章泸尹 张萌萌 安琪 王成强 陈杰 李彬 陈珍 杜丽 王凤阳 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第7期1926-1934,共9页

本试验旨在探究羊源多杀性巴氏杆菌OmpA基因的原核表达及其生物信息学特征。以羊源多杀性巴氏杆菌HN-01株基因组为模板,设计特异性引物扩增OmpA基因;构建pET-28a(+)-OmpA重组质粒后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,将鉴定正确的重组菌... 本试验旨在探究羊源多杀性巴氏杆菌OmpA基因的原核表达及其生物信息学特征。以羊源多杀性巴氏杆菌HN-01株基因组为模板,设计特异性引物扩增OmpA基因;构建pET-28a(+)-OmpA重组质粒后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,将鉴定正确的重组菌经IPTG诱导表达;通过SDS-PAGE及Western blotting分析表达蛋白的特征,并运用生物信息学工具对OmpA基因序列进行分析。结果显示,羊源多杀性巴氏杆菌OmpA基因大小约为1044bp,该基因序列与HN-06株的同源性达89.72%。通过诱导后发现,pET-28a(+)-OmpA重组菌最佳诱导条件为1mmol/LIPTG37℃诱导6h,表达的重组蛋白大小约为40ku,以包涵体的形式存在。Western blotting结果显示,约40ku的重组蛋白携带His标签。经生物信息学分析,OmpA分子式为C1684H2619N457O505S3,属碱性疏水蛋白,其多肽链的1-21位氨基酸为信号肽区域,并具有多种结构。综上所述,OmpA可能具有特殊结构,与众多外膜蛋白结构特点相似。本研究构建了多杀性巴氏杆菌OmpA基因原核表达系统,优化诱导条件后能稳定获得OmpA重组蛋白,为进一步探究巴氏杆菌的致病机理提供理论依据。 展开更多

关键词 多杀性巴氏杆菌 OmpA基因 原核表达

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牛乳头状瘤病毒13型L1基因的克隆及原核表达 被引量：2

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作者 赵天靖 贾晓晓 +8 位作者 史巧芸 郭莳雨 庞峰 朱华培 徐开莲 李亚颖 彭冬梅 李国华 王凤阳 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2015年第9期2286-2291,共6页

本研究旨在克隆并表达牛乳头状瘤病毒13型(BPV13)L1基因。以BPV13基因组为模板,通过PCR技术扩增得到大小1 494bp的目的片段,同时用BamHⅠ和HindⅢ分别对目的片段和pET28a(+)载体进行双酶切,将双酶切后的L1基因片段克隆至原核表达载体pET... 本研究旨在克隆并表达牛乳头状瘤病毒13型(BPV13)L1基因。以BPV13基因组为模板,通过PCR技术扩增得到大小1 494bp的目的片段,同时用BamHⅠ和HindⅢ分别对目的片段和pET28a(+)载体进行双酶切,将双酶切后的L1基因片段克隆至原核表达载体pET28a(+),构建pET28a-L1重组质粒,双酶切和测序鉴定正确后转入大肠杆菌BL21(DE3)受体菌中,筛选出最佳IPTG浓度和最佳诱导时间后进行诱导表达,进行SDS-PAGE和Western blotting检测。结果表明,L1基因正确插入到原核表达载体pET28a(+)中;IPTG诱导后含重组质粒pET28a-L1的表达菌成功表达了带His标签的融合蛋白;SDS-PAGE电泳结果显示融合蛋白分子质量为60ku,与预期大小一致,超声破菌后,SDS-PAGE电泳显示融合蛋白存在于沉淀中;Western blotting验证为带His标签的融合蛋白。本试验为进一步研究BPV13 L1基因的功能及为BPV13有效DNA疫苗的研制奠定基础。 展开更多

关键词 牛乳头状瘤病毒13型(BPV13) L1 克隆 原核表达

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