错配PCR致突变的实验条件研究 被引量：11

1

作者 陈晓穗 汪保安 王琰 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2003年第3期307-310,共4页

目的 :对目前常用的致突菌株和PCR随机突变方法进行评价。 方法 :用单链抗体表达质粒转化致突菌株XL1 Red ,转种传代 7d ,选取克隆测定DNA序列。用错配PCR在相同基因中引入突变 ,比较不同Mg2 + 浓度、不同dNTP的浓度、不同dITP等条件下... 目的 :对目前常用的致突菌株和PCR随机突变方法进行评价。 方法 :用单链抗体表达质粒转化致突菌株XL1 Red ,转种传代 7d ,选取克隆测定DNA序列。用错配PCR在相同基因中引入突变 ,比较不同Mg2 + 浓度、不同dNTP的浓度、不同dITP等条件下所致突变率。 结果 :在XL1 Red菌株中转种 7d(约 5 0代 )后 ,测定突变率 <0 .1%。在错配PCR中 ,增加Mg2 + 浓度可提高突变率 ,增加dTTP和dCTP浓度的致突变效果优于增加dATP和dGTP的效果。在dITP配以低浓度的dATP或dGTP时突变率较低 ,使用 5mmol/LMgCl2 、0 .5mmol/LMnCl2 、1mmol/LdTTP和dCTP的条件下 ,经 2轮PCR(共6 0个循环 )突变率可 >2 %。其突变类型有明显偏向性 ,以A/T的突变为主 ,转换多于颠换。 结论 :用致突菌株引入的突变率过低 ,不适用于抗体亲和力成熟 ,错配PCR在合适条件下可达到 2 %以上突变率 ,适用于随机突变抗体库的构建 ,但其突变类型有偏向性 ,应予以考虑。 展开更多

关键词 聚合酶链反应 突变 致突菌株 SCFV

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人源性天然抗体库的构建及初步鉴定 被引量：16

2

作者 王刚 王琰 +2 位作者 化冰 刘晓琳 乔媛媛 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2002年第1期69-72,共4页

目的 构建较大容量的人源性天然抗体库。方法 以未经铭疫的健康人外周血单个核细胞为基因来源，扩增多样性的Ｋ轻链基因和 ＩｇＧ／ＩｇＭ重链Ｆｄ段基因，分别构建铡库和重链库，然后组合为Ｆａｂ段面展示的噬菌体抗体库。通过多次重... 目的 构建较大容量的人源性天然抗体库。方法 以未经铭疫的健康人外周血单个核细胞为基因来源，扩增多样性的Ｋ轻链基因和 ＩｇＧ／ＩｇＭ重链Ｆｄ段基因，分别构建铡库和重链库，然后组合为Ｆａｂ段面展示的噬菌体抗体库。通过多次重组积累达到理想的库容，对抗体库进行筛选和鉴定。结果 经过５次轻、重链基因的重组和转化，获得了库容为１×1０～９的人源性天然抗体库。该抗体库性能良好，用３种抗原进行“亲和吸附－洗脱－扩增”淘筛，获得针对其中两种抗原的７株特异性噬菌体抗体。结论天然抗体库为用于不经免疫制备人源性单克隆抗体创造了良好的条件。 展开更多

关键词 抗体库 噬菌体展示技术 人单克隆抗体

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大肠杆菌表达的单链抗体柱复性的研究 被引量：7

3

作者 朱迎春 王琰 +3 位作者 高荣凯 刘群英 化冰 陈宇萍 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 1999年第2期169-172,共4页

对包含体表达的抗乙肝病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）的单链抗体（ＳｃＦｖ）纯化复性进行了探索．尝试了利用金属螯合亲和层析和凝胶层析柱进行柱上在位复性的可行性．对包含体表达的ＳｃＦｖ进行透析复性与柱复性，比较其相对复性率及蛋... 对包含体表达的抗乙肝病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）的单链抗体（ＳｃＦｖ）纯化复性进行了探索．尝试了利用金属螯合亲和层析和凝胶层析柱进行柱上在位复性的可行性．对包含体表达的ＳｃＦｖ进行透析复性与柱复性，比较其相对复性率及蛋白质回收率，发现柱上复性效果优于传统的透析复性．抗ＨＢｓＡｇＳｃＦｖ经凝胶色谱ＳｅｐｈａｃｙｌＳ２００柱复性的相对复性率为９８％，蛋白质回收率为８１％．由于将纯化复性同步进行，简化了操作程序。 展开更多

关键词 单链抗体ScFv 包含体 纯化 复性 乙型肝炎病毒

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抗人膀胱癌人-鼠嵌合抗体真核表达载体的构建和表达 被引量：9

4

作者 白银 王琰 +3 位作者 周丽君 黄啸 丁义 俞莉章 《北京大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2001年第5期402-406,共5页

目的 :构建嵌合型抗人膀胱癌抗体的真核表达载体 ,并实现其真核表达。方法 :从杂交瘤细胞中克隆得到鼠源单抗的可变区基因 ,插入嵌合抗体IgG1真核表达载体pDHL中 ,转染CHO细胞 ,实现其真核表达 ,并对抗人膀胱癌人 鼠嵌合抗体的功能进行... 目的 :构建嵌合型抗人膀胱癌抗体的真核表达载体 ,并实现其真核表达。方法 :从杂交瘤细胞中克隆得到鼠源单抗的可变区基因 ,插入嵌合抗体IgG1真核表达载体pDHL中 ,转染CHO细胞 ,实现其真核表达 ,并对抗人膀胱癌人 鼠嵌合抗体的功能进行初步鉴定。结果 :成功构建抗人膀胱癌人 鼠嵌合抗体真核表达载体 ,并实现其真核表达。初步的功能鉴定表明抗人膀胱癌人 鼠嵌合抗体具有较好的特异性和亲合力。结论 :构建的抗人膀胱癌人 鼠嵌合抗体真核表达载体在真核细胞内得到表达 ,且其功能较为理想。 展开更多

关键词 人-鼠嵌合抗体 真核表达 单克隆抗体 药物载体 膀胱肿瘤 治疗 膀胱癌

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通过载体DHFR基因的弱化提高抗体在CHO细胞中的表达 被引量：10

5

作者 白银 王琰 +3 位作者 张海荣 周丽君 吕英谦 俞莉章 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期62-64,67,共4页

目的:提高抗人膀胱癌人-鼠嵌合抗体在二氢叶酸还原酶缺陷的CHO细胞株(CHO/DHFR-)中表达的产量。方法:对表达载体中DHFR基因表达调控序列进行一系列的删除突变和点突变后,构建不同的嵌合抗体表达载体。用这些载体转染CHO细胞并以递增量... 目的:提高抗人膀胱癌人-鼠嵌合抗体在二氢叶酸还原酶缺陷的CHO细胞株(CHO/DHFR-)中表达的产量。方法:对表达载体中DHFR基因表达调控序列进行一系列的删除突变和点突变后,构建不同的嵌合抗体表达载体。用这些载体转染CHO细胞并以递增量的氨甲喋呤(MTX)筛选,用ELISA法测定每个加压水平的各组细胞中抗体的表达水平。结果:通过对表达载体中DHFR基因表达调控序列的突变,使DHFR的基础表达水平产生了不同程度的弱化。转染CHO细胞后,可明显提高MTX加压增加抗体表达的效果,抗体表达水平的增加基本与DHFR基因的弱化程度呈正相关。从弱化程度最高的pWS2-BDI组中,我们筛选得到表达量达55μg/(106细胞·24 h)的高表达细胞株,经锌离子进一步诱导后,表达量可达100μg/(106细胞·24 h)以上。结论:弱化表达载体中DHFR的表达,可提高MTX对工程抗体表达的增加效果。 展开更多

关键词 载体 DHFR基因 真核表达 抗体 CHO细胞

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抗HBsAg人IgG表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达 被引量：6

6

作者 陈晓穗 朱迎春 +3 位作者 王欲晓 刘晓琳 周丽君 王琰 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2000年第5期248-251,共4页

尝试将 1株来源于人源性噬菌体抗体库的抗HBsAg人Fab ,转换成完整的抗HBsAg人IgG。方法 :采用重叠PCR方法 ,在抗HBsAg人Fab的Vκ和VH基因的 5’端接上人工合成的人κ链的前导序列 ,构建表达完整IgG1的真核表达载体 ,转染CHO(DHFR- )细... 尝试将 1株来源于人源性噬菌体抗体库的抗HBsAg人Fab ,转换成完整的抗HBsAg人IgG。方法 :采用重叠PCR方法 ,在抗HBsAg人Fab的Vκ和VH基因的 5’端接上人工合成的人κ链的前导序列 ,构建表达完整IgG1的真核表达载体 ,转染CHO(DHFR- )细胞 ,用ELISA、RT PCR和免疫印迹检测抗HBsAg人IgG的表达。通过DHFR MTX体系及金属离子诱导提高Ig表达。结果 :获得表达量在每 2 4h 1μg 10 6 细胞的稳定表达抗HBsAg人IgG的转染细胞系。并证实所表达IgG具有良好特异性及完整Fc段 ,其亲和力约为 2 .1× 10 9M 1 。又通过DHFR MTX扩增系统的作用及金属离子锌和镉对小鼠金属硫蛋白启动子的激活作用 ,使IgG的表达量提高了约 2 0倍。结论 :通过拼接人κ链的前导序列在真核表达系统成功地将抗HBsAg人Fab转换成完整的HBsAg人IgG1,为其进一步应用打下了基础。 展开更多

关键词 噬菌体抗体 真核表达 乙型肝炎 HBsAg IgG CHO

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大容量人源噬菌体抗体库的构建 被引量：9

7

作者 陈宇萍 张国民 +4 位作者 乔媛媛 王刚 刘玉峰 化冰 王琰 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第5期463-466,共4页

目的:构建大容量易于改造成Diabody的噬菌体单链抗体库,筛选人源性抗体。方法:从正常成人外周血和新生儿脐血中分离淋巴细胞提取RNA,经RT-PCR扩增轻重链可变区基因(VL和VH),通过重叠PCR(over-lapPCR)将VL和VH拼接成单链抗体(ScFv)基因(... 目的:构建大容量易于改造成Diabody的噬菌体单链抗体库,筛选人源性抗体。方法:从正常成人外周血和新生儿脐血中分离淋巴细胞提取RNA,经RT-PCR扩增轻重链可变区基因(VL和VH),通过重叠PCR(over-lapPCR)将VL和VH拼接成单链抗体(ScFv)基因(其中VH两侧是两个非同源的loxp基因),并克隆入噬菌体表达载体PDF,得到初级噬菌体抗体库。将初级抗体库以高MOI超感染Cre+菌株BS1365,通过loxp-cre定位重组系统,介导轻重链在菌内重组配对,然后低感染XL1-Blue菌,得到大容量的次级抗体库。以多种不同抗原对库进行筛选,得到多样性较好的特异性抗体。结果:经超感染重组,得到1·2×1010的大容量抗体库。经三种蛋白抗原筛选,均得到多株特异性较好的噬菌体抗体,并成功构建为活性较好的Diabody。结论:经Loxp-Cre定位重组系统在单细胞内重组,能够高效地构建大容量噬菌体单链抗体库。 展开更多

关键词 噬菌体展示 抗体库 Cre重组 单链抗体

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白藜芦醇甙对内毒素刺激小鼠腹腔巨噬细胞产生TNF_α和NAG的影响 被引量：15

8

作者 张曼 乐毅 金丽娟 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 1995年第3期242-245,共4页

收集小鼠腹腔巨噬细胞，调整细胞浓度为５×１０￣５／ｍｌ，加入２４孔培养板每孔１ｍｌ，内毒素刺激前后不同时间加入白藜芦醇甙培养，检测上清中肿瘤坏死因子，溶酶体酶（Ｎ－乙酰－β－Ｄ氨基葡萄糖苷酶ＮＡＧ）的变化，结果说... 收集小鼠腹腔巨噬细胞，调整细胞浓度为５×１０￣５／ｍｌ，加入２４孔培养板每孔１ｍｌ，内毒素刺激前后不同时间加入白藜芦醇甙培养，检测上清中肿瘤坏死因子，溶酶体酶（Ｎ－乙酰－β－Ｄ氨基葡萄糖苷酶ＮＡＧ）的变化，结果说明：白藜芦醇甙可减少上清中ＴＮＦ＿α和ＮＡＧ的量，通过此可减少内毒素刺激产生的由ＴＮＦ＿α和ＮＡＧ介导的组织损伤。 展开更多

关键词 内毒素 巨噬细胞 肿瘤坏死因子 白藜芦醇甙 虎杖

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基因工程人抗角蛋白抗体的免疫学纯化与鉴定 被引量：6

9

作者 王刚 刘玉峰 +2 位作者 王琰 朱迎春 化冰 《临床皮肤科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第3期139-141,共3页

在成功克隆和表达了人源性抗角蛋白抗体之后，利用金属螯合亲和层析法进行提取纯化，并用Western blot、竞争抑制性ELISA和非竞争性酶免疫亲和力测定技术对该抗体的特异性、识别抗原组分以及亲和力等免疫学特性进行鉴定。结果发现，金... 在成功克隆和表达了人源性抗角蛋白抗体之后，利用金属螯合亲和层析法进行提取纯化，并用Western blot、竞争抑制性ELISA和非竞争性酶免疫亲和力测定技术对该抗体的特异性、识别抗原组分以及亲和力等免疫学特性进行鉴定。结果发现，金属螯合亲和层析技术能够有效地将抗角蛋白可溶性Fab从表达上清中纯化出来。所制备抗体特异性良好，能够识别相对分子量45 000～48 000角蛋白，并具有较高的亲和力，亲和系数为3.5×109M－1。这种高特异性、高亲和力的人源性抗角蛋白抗体将在抗角蛋白自身抗体的功能与意义研究以及今后临床应用前景的探讨中发挥重要作用。 展开更多

关键词 人单克隆抗体 角蛋白 免疫学 金属螯合亲和层析 基因工程

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从大容量抗体库中筛选抗TNF-α人单链抗体 被引量：9

10

作者 王欲晓 乔媛媛 +1 位作者 周丽君 王琰 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第9期878-880,共3页

目的:从天然的单链大容量噬菌体抗体库中筛选特异性的抗TNF-α的人单链抗体(scFv)。方法:以TNF-α为抗原,通过"吸附-洗脱-扩增"过程从大容量抗体库中筛选特异性抗体,对其抗原结合活性和序列进行分析鉴定。结果:经过4轮筛选,获... 目的:从天然的单链大容量噬菌体抗体库中筛选特异性的抗TNF-α的人单链抗体(scFv)。方法:以TNF-α为抗原,通过"吸附-洗脱-扩增"过程从大容量抗体库中筛选特异性抗体,对其抗原结合活性和序列进行分析鉴定。结果:经过4轮筛选,获得62个与TNF-α结合的阳性克隆,其中27个特异性结合的克隆,指纹分析有7种不同的可变区片段;其中5种获得可溶性表达;基因序列分析表明其轻重链分属VλⅠ和VHⅣ亚群。结论:利用单链大容量抗体库技术可以不经免疫制备获得特异性抗TNF-α的scFv,为今后的研究和应用提供依据。 展开更多

关键词 大容量噬菌体抗体库 TNF-Α 噬菌体抗体

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人锰超氧化物歧化酶cDNA的克隆、测序及表达 被引量：4

11

作者 骆训懿 周丽君 +5 位作者 陈晓穗 王欲晓 谢邦铁 王晶翼 陈宇萍 何菱 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 1996年第4期349-352,共4页

用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）以人肝细胞总ＲＮＡ为模板，扩增了人锰超氧化物歧化酶（ｈＭｎＳＯＤ）的ｃＤＮＡ片段，将此ｃＤＮＡ克隆到载体ｐＧＥＭ－Ｔ中对重组质粒进行限制酶切分析和序列测定，确定为含ｈＭｎＳＯＤｃ... 用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）以人肝细胞总ＲＮＡ为模板，扩增了人锰超氧化物歧化酶（ｈＭｎＳＯＤ）的ｃＤＮＡ片段，将此ｃＤＮＡ克隆到载体ｐＧＥＭ－Ｔ中对重组质粒进行限制酶切分析和序列测定，确定为含ｈＭｎＳＯＤｃＤＮＡ的重组质粒将该ｈＭｎＳＯＤｃＤＮＡ重组到表达载体ｐＢＶ２２０内，重组质粒在大肠杆菌ＤＨ５－α中表达ｈＭｎＳＯＤ，表达产物占菌体总蛋白的１４％。 展开更多

关键词 锰 超氧化物歧化酶 CDNA 基因克隆 序列测定

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从噬菌体抗体库筛选人源性抗白细胞介素8抗体 被引量：8

12

作者 王雷 乔媛媛 +4 位作者 王刚 陈宇萍 杨军 王琰 刘玉峰 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第2期185-187,共3页

　目的: 从噬菌体抗体库中筛选人源性抗IL- 8单链抗体(scFV)。方法: 采用原核表达载体pRSET- IL- 8在大肠杆菌BL21(DE3)中表达IL- 8 His融合蛋白, 并通过亲和层析纯化。以该融合蛋白为固相抗原, 对噬菌体抗体库进行 3轮淘筛, 并对所获... 　目的: 从噬菌体抗体库中筛选人源性抗IL- 8单链抗体(scFV)。方法: 采用原核表达载体pRSET- IL- 8在大肠杆菌BL21(DE3)中表达IL- 8 His融合蛋白, 并通过亲和层析纯化。以该融合蛋白为固相抗原, 对噬菌体抗体库进行 3轮淘筛, 并对所获阳性克隆进行抗原结合活性测定和DNA序列测定。结果: 获得 2株特异性抗IL- 8噬菌体抗体。对其DNA序列测定结果表明, 其VH基因均属于人IgGVH3亚群, Vλ基因分别属于人VλDPL5和VλDPL2亚群。结论: 利用噬菌体抗体库技术可不经免疫制备人源性抗IL- 8抗体, 为银屑病及相关疾病的临床应用提供了条件。 展开更多

关键词 噬菌体抗体库 白细胞介素8 筛选

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抗HBsAg和抗RBC双特异minibody载体的构建及表达 被引量：4

13

作者 陈宇萍 乔媛媛 +4 位作者 化冰 刘晓琳 谢帮铁 马大龙 王琰 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2001年第6期298-301,共4页

目的 :用抗HBsAg和抗RBC单链抗体构建双特异minibody抗体模型。方法 :将人IgG1CH3 经点突变方式 ,在CH3界面由大分子氨基酸代替小分子氨基酸形成“knob”(T36 6W) (杵状结构 ) ,另一个CH3 分子由 3个小分子氨基酸代替 3个大分子氨基酸... 目的 :用抗HBsAg和抗RBC单链抗体构建双特异minibody抗体模型。方法 :将人IgG1CH3 经点突变方式 ,在CH3界面由大分子氨基酸代替小分子氨基酸形成“knob”(T36 6W) (杵状结构 ) ,另一个CH3 分子由 3个小分子氨基酸代替 3个大分子氨基酸形成“hole”(T36 6S :L36 8A :Y40 7V) (臼状结构 ) ,并在此基础上在适当位置引入半胱氨酸残基形成二硫键 (S35 4C :T36 6W /Y34 9C :T36 6S :L36 8A :Y40 7V)。然后将“knob”和“hole”分别接连于抗HBsAg和抗RBC单链抗体基因 3’端 ,并将两基因组装于同一表达载体中 ,在大肠杆菌中分泌表达。结果 :依CH3 界面不同共构建 3种不同的表达载体 ,分别带有①野生型CH3 ,②杵臼结构 (T36 6W/T36 6S :L36 8A :Y40 7V)突变型CH3 ,③杵臼结构加二硫键 (S35 4C :T36 6W/Y34 9C :T36 6S :L36 8A :Y40 7V)突变型CH3 。大肠杆菌分泌表达后 ,ELISA法检测抗HBsAg和抗RBC活性 ,3种表达上清均有相同的抗HBsAg和抗RBC活性 ;两种带有突变型CH3 的minibody用血球凝集法可检测到抗HBsAg和抗RBC双特异活性。结论 :CH3 界面经适当改造可促进异源二聚体形成 ,并在大肠杆菌获得功能性表达 ,得到双特异minibody。 展开更多

关键词 CH3 knob-into-hole Minibody 双特异抗体 突变型基因

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抗人胃癌3H11人-鼠嵌合抗体的构建及表达 被引量：5

14

作者 李竞 王卓智 +5 位作者 王琰 刘群英 化冰 陈宇萍 朱迎春 董志伟 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 1998年第2期116-120,共5页

为了降低抗人胃癌鼠单抗3H11的免疫原性,以利于该单抗在临床中的应用。我们构建并表达了3H11的人-鼠嵌合抗体,将3H11的轻、重链可变区基因分别插入到含有人k链及IgGl重链恒定区基因的真核细胞表达载体中,构建了3H11人-鼠嵌合抗体轻、重... 为了降低抗人胃癌鼠单抗3H11的免疫原性,以利于该单抗在临床中的应用。我们构建并表达了3H11的人-鼠嵌合抗体,将3H11的轻、重链可变区基因分别插入到含有人k链及IgGl重链恒定区基因的真核细胞表达载体中,构建了3H11人-鼠嵌合抗体轻、重链表达载体。应用Lipofectin方法先将嵌合轻链表达载体转染到Sp2/0细胞中,经用含霉酚酸的选择培养基筛选及克隆化培养,获得稳定分泌3H11人-鼠嵌合轻链的转染细胞株。再将嵌合重链表达载体转染该细胞系,用含有组氨醇的选择培养基筛选,获得组氨醇抗性细胞株,经亚克隆后得到可稳定分泌人k链和人IgGl的转染细胞系,经ELISA检测该细胞系所分泌的上清含有可与人胃癌细胞系803结合的人IgG抗体活性,RT-PCR结果显示该细胞株有人-鼠嵌合抗体mRNA的转录,证明已获得分泌3H11人-鼠嵌合抗体的细胞系。 展开更多

关键词 3H11 人-鼠嵌合抗体 胃肿瘤 真核基因 表达

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通过随机突变提高抗TNF-α单链抗体的亲和力 被引量：5

15

作者 汪保安 陈晓穗 +3 位作者 王欲晓 曲佳 周丽君 王琰 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期445-448,共4页

目的:提高抗TNFα单链抗体(scFv)的亲和力。方法:应用错配PCR技术在抗TNFαscFv基因中引入随机突变,再通过DNA交换(shuffling)使引入的点突变进一步重排组合,构建突变噬菌体抗体库。采用硫氰酸盐洗脱法对抗体库进行淘筛。挑选活性得到... 目的:提高抗TNFα单链抗体(scFv)的亲和力。方法:应用错配PCR技术在抗TNFαscFv基因中引入随机突变,再通过DNA交换(shuffling)使引入的点突变进一步重排组合,构建突变噬菌体抗体库。采用硫氰酸盐洗脱法对抗体库进行淘筛。挑选活性得到改良的克隆,用斑点ELISA法及硫氰酸盐洗脱ELISA法评估其亲和力的改善。结果:对PCR错配的突变库筛选未得到亲和力明显改善的抗体变种,经DNA交换进一步构建变种库后,筛选获得1个亲和力提高的克隆,其相对亲和指数为1.37mol/L,较亲本抗体的相对亲和指数0.48mol/L有明显提高。结论:通过错配PCR和DNA交换引入随机突变构建抗体库,可有效地提高scFv的亲和力。 展开更多

关键词 致错PCR DNA重排 亲和力

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重组人Fab金属螯合层析法纯化条件的研究 被引量：4

16

作者 朱迎春 王琰 +2 位作者 刘群英 化冰 高荣凯 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 1997年第2期136-139,共4页

在重组人Fab (rhFab)表达载体的羧基端插入六个组氨酸 ,使其对金属螯合层析介质产生特异性吸附 ,可用金属螯合亲和层析法进行分离纯化 .采用自制金属 (铜、锌金属离子 )螯合层析介质 ,以 pH和咪唑两种洗脱方法 ,对rhFab段的纯化效果进... 在重组人Fab (rhFab)表达载体的羧基端插入六个组氨酸 ,使其对金属螯合层析介质产生特异性吸附 ,可用金属螯合亲和层析法进行分离纯化 .采用自制金属 (铜、锌金属离子 )螯合层析介质 ,以 pH和咪唑两种洗脱方法 ,对rhFab段的纯化效果进行了探讨 .结果显示 :铜离子螯合层析介质比锌离子螯合层析介质对rhFab的亲和能力更强 ;pH洗脱方法的重复性优于咪唑法 ;金属铜离子螯合层析法对rhFab进行一步纯化可得到纯度大于 展开更多

关键词 组氨酸 重组人Fab 金属螯合层析

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细胞同步化能显著提高逆转录病毒载体的转染效率 被引量：4

17

作者 杨金亮 黄晋生 +1 位作者 房殿春 张海荣 《第三军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第1期34-34,38,共2页

关键词 细胞培养 低温处理 同步化 逆转录病毒载体 转染效率 基因治疗

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抗胃癌单抗3H11可变区氨基端序列对抗体活性的影响 被引量：4

18

作者 李竞 王琰 +5 位作者 王卓智 刘群英 化冰 陈宇萍 朱迎春 董志伟 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 1999年第4期369-373,共5页

采用 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 方法， 利用第一骨架区通用引物扩增重链 Ｆｄ 段和κ链的基因， 克隆到 Ｆａｂ 表达载体中， 在大肠杆菌中获得了表达但未检测到抗原结合活性． 根据已克隆的３ Ｈ１１ Ｖ Ｌ、 Ｖ Ｈ 的真实序列， 重新设计... 采用 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 方法， 利用第一骨架区通用引物扩增重链 Ｆｄ 段和κ链的基因， 克隆到 Ｆａｂ 表达载体中， 在大肠杆菌中获得了表达但未检测到抗原结合活性． 根据已克隆的３ Ｈ１１ Ｖ Ｌ、 Ｖ Ｈ 的真实序列， 重新设计κ链及 Ｆｄ 段５′端引物， 分别将骨架区引物在κ链及 Ｆｄ 段５′端所造成的氨基酸残基改变纠正为原始序列， 构建分别含有矫正后κ链或矫正后 Ｆｄ 以及二个链均得到矫正的 Ｆａｂ 表达载体， 这些载体在大肠杆菌中均获得类似水平的表达， 对任何一个链的矫正均可部分恢复 Ｆａｂ 段胃癌细胞的结合活性． 结果说明在构建小分子抗体时， Ｐ Ｃ Ｒ 引物引入的轻。 展开更多

关键词 胃癌 免疫球蛋白 可变区基因 单克隆抗体

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抗膀胱癌单抗Fab段基因的克隆及表达 被引量：3

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作者 周丽君 王琰 +2 位作者 白银 张海荣 余莉章 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2002年第2期117-121,共5页

目的:克隆抗膀胱癌单抗BDI的Fab段基因并在大肠杆菌中表达。方法:用逆转录-聚合酶链反应技术(RT-PCR),从分泌抗人膀胱癌的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆k链和Fd段基因,克隆到Fab表达载体中,在大肠杆菌表达噬菌体抗体和可溶Fab;运用PCR介导... 目的:克隆抗膀胱癌单抗BDI的Fab段基因并在大肠杆菌中表达。方法:用逆转录-聚合酶链反应技术(RT-PCR),从分泌抗人膀胱癌的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆k链和Fd段基因,克隆到Fab表达载体中,在大肠杆菌表达噬菌体抗体和可溶Fab;运用PCR介导的定位点突变改造V_H氨基端序列;用ELISA、免疫组化法等进行特异性鉴定。结果:从分泌抗膀胱癌的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆了重链Fd段和k链基因,在大肠杆菌中获得有抗原结合活性的噬菌体抗体和可溶性Fab的表达,但活性很弱,将V_H氨基端序列矫正为亲本单抗原始序列后,明显改善了其活性,通过ELISA、免疫组化及模拟抗体库筛选证实了所获抗体片段的特异性结合及在抗体库技术中的可用性。结论:获得了功能性抗膀胱癌小分子抗体,并再次提示抗体氨基端序列对抗体活性的影响的重要性。 展开更多

关键词 克隆 表达 抗膀胱癌单抗 免疫球蛋白可变区基因 FAB 膀胱癌

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不同启动子驱动免疫球蛋白在CHO细胞中表达活性的比较 被引量：3

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作者 朱迎春 王欲晓 +2 位作者 陈晓穗 周丽君 王琰 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 2000年第4期356-359,共4页

目的为提高抗体在真核细胞中的表达 ,比较了3种不同启动子驱动免疫球蛋白在CHO细胞中的表达活性。方法分别构建了在这3种启动子调控下轻链和完整人IgG的表达载体 ,比较了它们在转染CHO细胞后的瞬时和稳定表达。结果EF 1α启动子的表达... 目的为提高抗体在真核细胞中的表达 ,比较了3种不同启动子驱动免疫球蛋白在CHO细胞中的表达活性。方法分别构建了在这3种启动子调控下轻链和完整人IgG的表达载体 ,比较了它们在转染CHO细胞后的瞬时和稳定表达。结果EF 1α启动子的表达水平略强于HCMV和MTI启动子 ,后二者中HCMV又略强于MTI ,但它们的差别并不明显。对于我们所用的抗HBS人IgG基因 ,MTI启动子由于其活性可受重金属锌、镉的诱导而使表达量增加数倍 ,显示出一定的优势。结论MTI启动子不失为在哺乳动物细胞中表达抗体分子的一个选择。 展开更多

关键词 CHO细胞 真核表达 免疫球蛋白 启动子 HBSAG

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