目的:分析HBV感染不同阶段患者外周血T淋巴细胞中PD-1(program death factor-1)分子的基因定量表达情况,探讨PD-1表达水平与血清学指标的相关性。方法:采集并筛选HLA-A2阳性的31例慢性乙型肝炎(CHB)患者、9例急性恢复期乙型肝炎患者(AHB...目的:分析HBV感染不同阶段患者外周血T淋巴细胞中PD-1(program death factor-1)分子的基因定量表达情况,探讨PD-1表达水平与血清学指标的相关性。方法:采集并筛选HLA-A2阳性的31例慢性乙型肝炎(CHB)患者、9例急性恢复期乙型肝炎患者(AHB)、15例乙肝相关性肝硬化患者(LC)和10例健康献血者的外周血,实时荧光定量PCR分析总T细胞内PD-1的mRNA水平,同时测定其配体PD-L1、PD-L2在外周血单个核细胞(PBMCs)中的表达量;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HBV血清标记物水平,荧光定量PCR检测血清HBV DNA载量,同时进行肝功能检测。结果:以各基因在正常对照组的定量表达水平为基础值,HBeAg阳性CHB组T细胞内PD-1和PBMCs内PD-L1的mRNA表达水平明显升高,与HBeAg阴性CHB组和AHB组比较均有显著性差异,但与LC组比较无统计学意义(P>0.05)。外周血PBMCs内PD-L2的mRNA水平在各实验组中无明显差异(P均>0.05)。在所有检测的CHB患者中,外周血T细胞内PD-1表达水平在高病毒载量组(HBV DNA≥107拷贝/ml)明显高于低病毒载量组(HBV DNA<107拷贝/ml)和正常对照组,且与血清HBV病毒载量成正相关(r=0.41,P<0.01),但与血清ALT水平无明显相关性。结论:外周血T细胞中PD-1基因水平在慢性乙型肝炎患者组,尤其是在HBeAg阳性组和高病毒载量组明显上调,提示T细胞高表达的PD-1可能通过与其配体PD-L1作用而抑制T细胞免疫应答,并导致病毒持续感染。展开更多
目的构建具有免疫学活性的抗小鼠细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)单链抗体ScFv(single chain fragment of variety region),为进一步将其应用到动物体内奠定基础。方法采用RT-PCR技术,从分泌抗小鼠CTLA-4单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细...目的构建具有免疫学活性的抗小鼠细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)单链抗体ScFv(single chain fragment of variety region),为进一步将其应用到动物体内奠定基础。方法采用RT-PCR技术,从分泌抗小鼠CTLA-4单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞中扩增mAb的VH、VL基因,并进一步将其组装成VH-Linker-VL型的ScFv片段。将ScFv片段亚克隆至pGMET载体,测序正确后将其克隆至真核分泌型表达载体pSect2-GFP,将pSect2-GFP-ScFv纯化质粒转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)并进行表达,同时经Zeocin筛选稳定表达株。用Western blot方法检测ScFv融合蛋白的表达,采用ELISA检测ScFv的亲和活性。结果经Zeocin筛选2周后,CHO细胞株可稳定表达GFP-ScFv蛋白。Western blot法证实GFP-ScFv蛋白在细胞上清和细胞裂解液中均有表达,大小约55kD。ELISA检测表明,CHO培养上清中的GFP-ScFv蛋白经浓缩初纯后能与重组小鼠CTLA-4纯化抗原结合,并具有抑制亲本单抗与其结合的能力。结论成功构建了抗小鼠CTLA-4的ScFv真核表达载体,并能有效表达出具有免疫学活性的ScFv融合蛋白。展开更多
文摘目的构建具有免疫学活性的抗小鼠细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)单链抗体ScFv(single chain fragment of variety region),为进一步将其应用到动物体内奠定基础。方法采用RT-PCR技术,从分泌抗小鼠CTLA-4单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞中扩增mAb的VH、VL基因,并进一步将其组装成VH-Linker-VL型的ScFv片段。将ScFv片段亚克隆至pGMET载体,测序正确后将其克隆至真核分泌型表达载体pSect2-GFP,将pSect2-GFP-ScFv纯化质粒转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)并进行表达,同时经Zeocin筛选稳定表达株。用Western blot方法检测ScFv融合蛋白的表达,采用ELISA检测ScFv的亲和活性。结果经Zeocin筛选2周后,CHO细胞株可稳定表达GFP-ScFv蛋白。Western blot法证实GFP-ScFv蛋白在细胞上清和细胞裂解液中均有表达,大小约55kD。ELISA检测表明,CHO培养上清中的GFP-ScFv蛋白经浓缩初纯后能与重组小鼠CTLA-4纯化抗原结合,并具有抑制亲本单抗与其结合的能力。结论成功构建了抗小鼠CTLA-4的ScFv真核表达载体,并能有效表达出具有免疫学活性的ScFv融合蛋白。
