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靶向CD99的CAR-T细胞扩增优化研究
1
作者 王伊玄 于淼 +6 位作者 赵家旋 赵芬芳 曾毅 王友湧 祝海川 张同存 史江舟 《中国癌症杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期639-649,共11页
背景与目的:嵌合抗原受体T(chimeric antigen receptor T,CAR-T)细胞疗法对血液和淋巴系统肿瘤的治疗效果显著,但对实体瘤效果较差,这与靶点选择的因素有关。针对尤因肉瘤(Ewing sarcoma,ES),CD99可作为CAR-T细胞潜在的靶点。由于T细胞... 背景与目的:嵌合抗原受体T(chimeric antigen receptor T,CAR-T)细胞疗法对血液和淋巴系统肿瘤的治疗效果显著,但对实体瘤效果较差,这与靶点选择的因素有关。针对尤因肉瘤(Ewing sarcoma,ES),CD99可作为CAR-T细胞潜在的靶点。由于T细胞自身表达CD99蛋白,靶向CD99的CAR-T细胞存在体外扩增能力有限的问题。本研究旨在通过增加CD99敲低的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)、优化慢病毒转导的感染复数(multiplicity of infection,MOI)、筛选培养CAR-T细胞的培养基及培养容器,以获得CD99 CAR-T细胞制备的最优条件。方法:筛选shRNA序列,提高CD99 CAR-T细胞的扩增能力。采用不同的MOI、培养基和培养容器,分别检测在不同条件下CAR-T细胞的转导效率、细胞存活率、增殖能力、特异性杀伤能力及干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)释放水平等,筛选出最优的细胞制备条件。结果:通过shRNA敲低得到的KO-CD99 CAR-T细胞扩增水平显著高于CD99 CAR-T细胞[(16.40±0.40)vs(6.33±1.53),P<0.01]。转导MOI为0.25~1.0、培养基为OptiVitro时细胞的扩增效果最优。在透气瓶中培养的CAR-T细胞扩增倍数显著高于在培养袋中培养的细胞[MOI=0.25:(50.23±3.32)vs(13.02±4.82);MOI=0.50:(49.96±0.83)vs(18.25±2.88);MOI=1.00:(48.27±5.08)vs(13.16±6.26);P<0.01],且细胞分型更优、特异性杀伤更高。结论:通过shRNA技术得到的KO-CD99 CAR-T细胞可实现稳定扩增。从扩增条件优化结果看,MOI为0.25~1.00,培养基为OptiVitro,培养容器为透气瓶的条件下,KO-CD99 CAR-T细胞可获得更优的扩增能力、更多比例的记忆T细胞,为后续开展CD99 CAR-T细胞治疗ES的临床试验奠定了坚实基础。 展开更多
关键词 CD99 嵌合抗原受体T细胞 扩增优化 KO-CD99
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新型冠状病毒及其临床检测方法研究进展 被引量：15
2
作者 李家俊 郑潇 +1 位作者 盛杰 徐瑶 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第4期282-292,共11页
2019年底新型冠状病毒肺炎在国内武汉爆发、流行,并迅速扩散至全球,主要通过呼吸道飞沫和密切接触传播,传染能力极强,部分患者无症状却具备感染他人的能力。新冠肺炎的确诊对于疫情的防控、病患的早发现、早隔离、早治疗尤为关键。新冠... 2019年底新型冠状病毒肺炎在国内武汉爆发、流行,并迅速扩散至全球,主要通过呼吸道飞沫和密切接触传播,传染能力极强,部分患者无症状却具备感染他人的能力。新冠肺炎的确诊对于疫情的防控、病患的早发现、早隔离、早治疗尤为关键。新冠病毒的检测以核酸及特异性抗体检测为主。综述了新型冠状病毒的病原学特点与检测方法的研究进展,介绍了检测技术的原理和应用现状,以期为新冠肺炎的临床准确诊断及疫情防控提供一些帮助。 展开更多
关键词 新型冠状病毒 病原学 核酸 抗体 检测
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不同信号肽对嵌合抗原受体T细胞杀伤作用的影响研究 被引量：3
3
作者 李帆 张琴星 +3 位作者 童祥文 田高辉 顾力行 徐瑶 《中国癌症杂志》 CAS CSCD 北大核心 2022年第2期142-151,共10页
背景与目的:信号肽(signal peptide,SP)是一段存在于前体蛋白N-端的短肽链,能够调节前体蛋白的折叠和转移,在蛋白质的分泌过程中扮演着极其重要的角色。近年来,靶向CD19的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)T细胞在白血病治... 背景与目的:信号肽(signal peptide,SP)是一段存在于前体蛋白N-端的短肽链,能够调节前体蛋白的折叠和转移,在蛋白质的分泌过程中扮演着极其重要的角色。近年来,靶向CD19的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)T细胞在白血病治疗中取得了重大突破,关于CAR结构的胞内域改造方面也有诸多研究,而对单链可变片段(scFv)的N端SP研究进展缓慢。探讨4种不同SP的CD19-CAR在T细胞表面表达及对CD19+靶细胞的杀伤作用。方法:通过基因合成和分子克隆技术,构建含4种不同SP(SP1、SP2、SP3、SP4)的靶向CD19抗原的CAR载体,进行慢病毒包装,将得到的慢病毒转染T细胞,利用流式细胞术检测细胞转染效率,采用钙黄绿素释放法检测该细胞对靶细胞的杀伤作用,采用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测细胞因子IFN-γ和TNF-α的分泌水平。结果:成功构建4种不同SP的重组慢病毒载体,将4种慢病毒转导T细胞后,结果显示,分别有20.9%、22.6%、31.5%、38.6%的T细胞表面能够表达CD19-CAR(分别命名为SP1-CD19、SP2-CD19、SP3-CD19和SP4-CD19细胞),进一步杀瘤实验证明,SP4-CD19细胞对CD19+肿瘤细胞的杀伤作用显著高于SP1-CD19、SP2-CD19和SP3-CD19细胞(P<0.01),并且当效靶比为10∶1共培养24 h后,与SP1-CD19、SP2-CD19和SP3-CD19细胞相比,SP4-CD19细胞的IFN-γ和TNF-α的分泌水平显著升高(P<0.05)。此外,4种不同SP的CAR-T对CD19-肿瘤细胞K562的杀伤作用差异无统计学意义(P>0.05)。结论:SP4-CD19细胞的转染效率、细胞因子分泌水平及对CD19+肿瘤细胞的杀伤作用均显著高于SP1-CD19、SP2-CD19和SP3-CD19细胞,该研究成果为CAR-T优化改造及其高效的临床应用奠定了科学基础。 展开更多
关键词 信号肽 嵌合抗原受体 靶向CD19的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor CAR)T细胞 体外杀瘤 细胞因子
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靶向CD30的CAR-T细胞慢病毒转导条件优化研究 被引量：1
4
作者 田高辉 张琴星 +5 位作者 史江舟 赵芬芳 王宁 赵家旋 卢玉琳 徐瑶 《中国癌症杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期646-654,共9页
背景与目的:嵌合抗原受体T(chimeric antigen receptor T,CAR-T)细胞技术在血液肿瘤治疗领域已被广泛应用,慢病毒转导是CAR-T细胞制备的关键环节,与CAR-T细胞的质量密切相关,因此慢病毒转导过程涉及的各项参数仍需进一步优化。本研究旨... 背景与目的:嵌合抗原受体T(chimeric antigen receptor T,CAR-T)细胞技术在血液肿瘤治疗领域已被广泛应用,慢病毒转导是CAR-T细胞制备的关键环节,与CAR-T细胞的质量密切相关,因此慢病毒转导过程涉及的各项参数仍需进一步优化。本研究旨在探讨携带CD30抗体序列的慢病毒转导T细胞的感染复数(multiplicity of infection,MOI)、温育密度、转导前活化时间和转导体系高度对抗CD30 CAR-T细胞的影响,优化CAR-T细胞的转导条件,提高转导效率和CAR-T细胞功能。方法:采用不同的MOI、温育密度、转导前活化时间和转导体系高度等对人外周血来源的T细胞进行转导优化,转导后分别检测抗CD30 CAR-T细胞的增殖能力、转导效率、细胞存活率和体外杀伤效率等,以确定最优的T细胞转导条件。结果:MOI为1.00、1.50和3.00时转导效率和有效细胞数显著高于0.00、0.25和0.50组。在温育密度大于1.0×10^(7)个/mL时,温育密度对T细胞转导效率无影响。活化时间为72 h组细胞存活率低于80%,显著低于其他组;24、48 h的转导效率显著高于0、8、16 h组;48 h组CAR-T细胞的增殖速率显著高于24 h组。转导体系高度为0.16 mm时转导效率和增殖倍数都显著高于0.53 mm组,但对CAR-T细胞的体外杀伤效率无影响。结论:通过对CAR-T细胞功能的综合评估,确定慢病毒的最佳转导条件为MOI=1、温育密度为1.0×10^(7)个/mL、转导前活化48h、转导体系高度为0.16mm。 展开更多
关键词 慢病毒载体 抗CD30嵌合抗原受体T细胞 转导条件
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m6A RNA甲基化在肿瘤发生发展中的作用 被引量：8
5
作者 龙文林 郭辉 +2 位作者 盛杰 宋如晦 徐瑶 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期178-186,共9页
m6A 甲基化是于1974 年首次被发现的一种RNA 分子上的甲基化修饰,近年来已成为生命科学领域的研究热点。m6A 修饰在哺乳动物细胞中是动态可逆的,是类似于DNA 和组蛋白修饰的另一种表观遗传调控。这种RNA 化学标记是由m6A“Writers”的... m6A 甲基化是于1974 年首次被发现的一种RNA 分子上的甲基化修饰,近年来已成为生命科学领域的研究热点。m6A 修饰在哺乳动物细胞中是动态可逆的,是类似于DNA 和组蛋白修饰的另一种表观遗传调控。这种RNA 化学标记是由m6A“Writers”的蛋白质产生,可以被m6A“Erasers”(即去甲基酶)逆转。此外,“Readers”可以识别含m6A 的mRNA,并相应地调节下游基因的表达。m6A RNA 甲基化参与了RNA 生命周期的各个阶段,从RNA 加工、核输出、翻译调控到RNA 降解,表明m6A 具有影响RNA 代谢相关多方面的功能。最近的研究表明,在不同的组织、细胞系和时空模型中,m6A 的修饰是一个复杂的调控网络,m6A 甲基化与肿瘤的发生和发展密切相关。主要围绕m6A 的分子调控机制、生理意义及其在几种人类肿瘤中的研究进展进行综述,旨在为癌症的早期临床诊断和靶向治疗提供新的思路。 展开更多
关键词 RNA 甲基化 m6A 甲基化 肿瘤
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水凝胶负载干细胞来源的外泌体用于皮肤伤口修复 被引量：4
6
作者 陶苏皖 朱链 许娜 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第8期1024-1031,共8页
皮肤伤口愈合是临床医学中的难题之一。长期的伤口不愈给患者带来较大的影响,造成巨大的社会经济负担。水凝胶因具有良好的生物相容性、可降解性及可塑性等特点,并具有止血、抗菌和保水的优良性能,被广泛用作皮肤损伤修复敷料。干细胞... 皮肤伤口愈合是临床医学中的难题之一。长期的伤口不愈给患者带来较大的影响,造成巨大的社会经济负担。水凝胶因具有良好的生物相容性、可降解性及可塑性等特点,并具有止血、抗菌和保水的优良性能,被广泛用作皮肤损伤修复敷料。干细胞被认为是组织工程中最具潜力的种子细胞,具有强大的再生修复能力。而干细胞来源的外泌体含有干细胞特有的内含物和膜成分,具有与干细胞相似的修复功能,同时可以避免干细胞治疗可能造成的畸胎瘤、移植物免疫排斥等生物相容性问题,成为无细胞修复的研究热点。然而,外泌体在治疗过程中会面临着清除率高、半衰期较短和规模化制备难度大等问题,限制了外泌体的治疗效果。水凝胶负载干细胞外泌体既可避免外泌体被快速清除,又可同时发挥外泌体和水凝胶促进伤口修复的作用,充分发挥治疗效果,协同促进皮肤修复,在伤口修复研究方面具有潜在的应用价值。本文对外泌体的产生和特点、常用的水凝胶材料、不同来源的干细胞外泌体、外泌体常用提取和鉴定方法、干细胞外泌体在伤口修复的相关作用机制、水凝胶对外泌体的保护和缓释作用,以及水凝胶和外泌体的协同作用进行现阶段研究成果的综述,为今后皮肤修复领域的研究提供参考。 展开更多
关键词 皮肤伤口修复 干细胞 外泌体 水凝胶 无细胞修复
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敲降WDR1抑制STAT3的核转移调控平滑肌细胞的增殖和迁移
7
作者 胡继盛 黄霞 安冉 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第4期533-542,共10页
信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)的核转运是其发挥生物学功能的前提。WD重复结构域1(WD repeat domain 1,WDR1)作为细胞骨架的调节因子可能影响STAT3的核转运。然而,有关WDR1影响ST... 信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)的核转运是其发挥生物学功能的前提。WD重复结构域1(WD repeat domain 1,WDR1)作为细胞骨架的调节因子可能影响STAT3的核转运。然而,有关WDR1影响STAT3核转运的分子机制仍不清楚。平滑肌细胞的增殖和迁移是动脉狭窄的主要原因。为了探究在平滑肌细胞中WDR1对STAT3核转运的影响,本研究构建了WDR1稳定敲降的人主动脉血管平滑肌细胞(human aortic vascular smooth muscle cells,HAVSMCs)模型。RT-qPCR和Western印迹结果显示,敲降WDR1,STAT3的活化和表达未见明显改变(P>0.05);核质分离结果表明,与对照组相比,敲降WDR1后STAT3的核质分布受到显著影响。随后的研究结果表明,与对照组相比,STAT3核转运相关的核输入蛋白β(importinβ)表达受到抑制(P<0.05),Ras相关核蛋白(Ras-related nuclear protein,Ran)的核质比显著下降。CCK8和Transwell结果表明,过表达importinβ能够挽救由WDR1敲降引起的HAVSMCs增殖和迁移的抑制。进一步研究结果表明,敲降WDR1导致与Ran核苷酸循环有关的核转运相关因子2(nuclear transport factor 2,NTF2)的表达显著下降(P<0.05)。过表达NTF2后,CCK8和Transwell结果表明,HAVSMCs的增殖和迁移能力得到显著提升(P<0.05)。总结上述结果可见,敲降WDR1通过抑制核输入蛋白β和核转运相关因子2的表达,改变Ran的核质分布,降低STAT3的核转运,进而调控平滑肌细胞的增殖和迁移。 展开更多
关键词 WD重复结构域1 信号转导和转录激活因子3 核转运 平滑肌细胞 增殖 迁移
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