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不稳定型心绞痛患者血浆蛋白标记物的蛋白质组学筛选 被引量:8
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作者 胡水旺 沈安娜 +2 位作者 郑德仲 黄敬 胡兆霆 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第6期532-537,共6页
目的分析冠心病不稳定型心绞痛(UAP)与稳定型心绞痛(SAP)患者血浆中的差异蛋白质,筛选可能与UAP早期诊断密切相关的血浆蛋白标记物。方法分别收集2014年6月-2015年4月南方医科大学第三附属医院UAP及SAP血浆标本各60例,另收集体检科收集... 目的分析冠心病不稳定型心绞痛(UAP)与稳定型心绞痛(SAP)患者血浆中的差异蛋白质,筛选可能与UAP早期诊断密切相关的血浆蛋白标记物。方法分别收集2014年6月-2015年4月南方医科大学第三附属医院UAP及SAP血浆标本各60例,另收集体检科收集的血浆标本作为正常对照组(n=60)。随机取对照组(n=10)、UAP组(n=10)与SAP组(n=10)空腹血浆标本各100μl,分别等量混合成3组样本,去除血浆高丰度蛋白后,利用双向差异凝胶电泳(DIGE)技术进行蛋白分离,经差异软件分析后,采集UAP和SAP之间变化2倍以上的差异蛋白质点,利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间/飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF MS)对差异蛋白点进行鉴定。每组随机选取40份血浆样本,选取UAP特异性差异蛋白进行ELISA验证。结果 UAP与SAP组患者血浆相比较,共筛选出10个表达量差异2倍以上的差异蛋白点,包括9个上调蛋白点,1个下调蛋白点。经质谱鉴定后,表达上调的蛋白包括纤维蛋白原γ链(FGG)、补体C4-B(C4B)、免疫球蛋白κ链C结构域(IGKC)和血红蛋白α亚基(HBA1);表达下调的蛋白是结合珠蛋白(HP)。与对照组比较后,在这些差异蛋白中共找到2个UAP特异性相关蛋白,即IGKC和HP。选取IGKC进行ELISA验证,结果表明,与对照组和SAP组相比较,UAP组样本中IGKC特异性表达上调(P<0.05),与DIGE验证结果一致。结论筛选到UAP特异性相关蛋白IGKC和HP,IGKC有可能成为UAP早期筛查及诊断的特异性生物标记物。 展开更多
关键词 心绞痛 不稳定型 血浆 生物学标记 蛋白质组学 双向差异凝胶电泳
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小鼠肝脏细胞质膜蛋白质组的提取和二维液相色谱分离
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作者 李红梅 陈丽 +3 位作者 夏高晓 赵明哲 胡水旺 姜勇 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第11期1947-1949,1953,共4页
目的提取小鼠肝脏细胞质膜蛋白并建立一种利用二维液相色谱法分离细胞质膜蛋白质组的方法。方法采用差速离心结合蔗糖密度梯度离心分离和富集分小鼠肝脏细胞质膜蛋白,样品经脱盐及用起始缓冲液置换后,进行一维色谱聚焦分离,然后收集pH8.... 目的提取小鼠肝脏细胞质膜蛋白并建立一种利用二维液相色谱法分离细胞质膜蛋白质组的方法。方法采用差速离心结合蔗糖密度梯度离心分离和富集分小鼠肝脏细胞质膜蛋白,样品经脱盐及用起始缓冲液置换后,进行一维色谱聚焦分离,然后收集pH8.5~4.0之间的组分进行二维反相高效液相色谱分离,最后将获得的二维UV图通过ProteoVue软件转换成UV/pI图谱。结果成功提取了肝脏细胞质膜蛋白,并通过二维液相色谱成功建立了小鼠肝脏细胞质膜蛋白的二维UV/pI图谱,收集了一维色谱聚焦分离的pH8.5~4.0区间的16个组分,并将每个组分分进行二维色谱分离后转换为UV/pI图谱。结论为进一步全面研究小鼠肝脏细胞质膜蛋白功能和疾病差异蛋白质组研究打下了基础。 展开更多
关键词 细胞质膜蛋白质 二维液相色谱 蛋白质组 肝脏
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小鼠肝细胞线粒体磷酸化蛋白质组的初步研究
3
作者 陈丽 李红梅 +7 位作者 夏高晓 赵明哲 胡水旺 王继刚 徐佳 刘靖华 邓鹏 姜勇 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期163-165,共3页
目的提取小鼠肝细胞线粒体磷酸化蛋白并利用双向凝胶电泳技术对其进行分离。方法提取小鼠肝细胞线粒体蛋白并利用金属磷酸盐亲和层析树脂富集磷酸化蛋白后,进行一维等电聚焦分离和二维聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,质谱鉴定感兴趣的蛋白点。... 目的提取小鼠肝细胞线粒体磷酸化蛋白并利用双向凝胶电泳技术对其进行分离。方法提取小鼠肝细胞线粒体蛋白并利用金属磷酸盐亲和层析树脂富集磷酸化蛋白后,进行一维等电聚焦分离和二维聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,质谱鉴定感兴趣的蛋白点。结果成功提取了小鼠肝细胞线粒体磷酸化蛋白,并通过双向凝胶电泳分离技术成功建立了小鼠肝细胞线粒体磷酸化蛋白质组图谱。结论磷酸化蛋白纯化技术与二维凝胶电泳分离技术的结合是研究亚细胞器磷酸化蛋白质组的有效方法,为进一步全面鉴定和研究线粒体磷酸化蛋白的功能打下了基础。 展开更多
关键词 线粒体 磷酸化蛋白质组 电泳 凝胶 双向
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一种基于HIV-1TAT蛋白质转导结构域细胞内转导系统的成功改建 被引量:8
4
作者 郭爱华 刘志锋 +3 位作者 孙学刚 李海玉 邓鹏 姜勇 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第5期545-548,共4页
目的探索本室构建的pET14b-His-TAT-Flag重组载体表达的融合蛋白在细胞中转导效率低的原因,建立高效的细胞内转导系统。方法通过PCR方法去除原有载体中的Flag序列,在改建正确的pET14b-His-TAT重组载体基础上插入EGFP编码序列,将经酶切、... 目的探索本室构建的pET14b-His-TAT-Flag重组载体表达的融合蛋白在细胞中转导效率低的原因,建立高效的细胞内转导系统。方法通过PCR方法去除原有载体中的Flag序列,在改建正确的pET14b-His-TAT重组载体基础上插入EGFP编码序列,将经酶切、DNA测序鉴定正确的pET14b-His-TAT-EGFP质粒转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导表达、SDS-PAGE鉴定正确,再经蛋白透析、过滤处理。将His-TAT-EGFP融合蛋白加入ECV304细胞中,用荧光显微镜观察。结果重组质粒pET14b-His-TAT融合表达载体和pET14b-His-TAT-EGFP重组载体经酶切、DNA测序鉴定证实构建成功。表达纯化出了高纯度His-TAT-EGFP融合蛋白并具有较高细胞内转导活性。结论成功改建pET14b-His-TAT-Flag重组载体,正确构建pET14b-His-TAT-EGFP载体,His-TAT-EGFP融合蛋白高效表达,并具有明确的细胞内转导活性。 展开更多
关键词 HIV-1反式激活因子 蛋白质转导结构域 融合蛋白 细胞内转导
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组蛋白的制备及其对巨噬细胞的影响
5
作者 付晓霞 叶萍 +6 位作者 李雪 钟玙沄 崔航 陈小欢 蔡军伟 姜勇 刘靖华 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期883-888,共6页
目的:用不同方法制备组蛋白并观察组蛋白在体外对巨噬细胞活力及细胞因子释放的影响。方法:用基因克隆的方法构建组蛋白H3和H4的原核表达质粒,分别表达和纯化带谷胱甘肽S-转移酶(GST)和组氨酸(His)标签的组蛋白(GST-H3、GST-H4、His-H3... 目的:用不同方法制备组蛋白并观察组蛋白在体外对巨噬细胞活力及细胞因子释放的影响。方法:用基因克隆的方法构建组蛋白H3和H4的原核表达质粒,分别表达和纯化带谷胱甘肽S-转移酶(GST)和组氨酸(His)标签的组蛋白(GST-H3、GST-H4、His-H3和His-H4);用高盐法提取真核细胞(RAW264.7和293F细胞)组蛋白;用上述不同来源组蛋白(7.5~50 mg/L)刺激巨噬细胞4 h,利用MTT和流式细胞术检测巨噬细胞活力;用液相芯片方法检测不同来源组蛋白对巨噬细胞释放在培养上清中的细胞因子白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的浓度。结果:His-H3/H4和真核细胞来源的组蛋白明显降低细胞活性,诱导RAW264.7细胞发生晚期凋亡和坏死;不同来源组蛋白对RAW264.7细胞释放IL-6和TNF-α均有不同程度的促进作用。结论:原核表达His-H3、His-H4及真核细胞提取的组蛋白均可抑制巨噬细胞活力,诱导巨噬细胞发生晚期凋亡和坏死。组蛋白可能通过促进炎症细胞因子的释放参与了炎症反应过程。 展开更多
关键词 原核蛋白表达 组蛋白类 巨噬细胞
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小G蛋白Rho家族与药物成瘾突触重塑
6
作者 薛涛 张璐 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2024年第11期2145-2150,共6页
神经元突触重塑是神经系统结构与功能的适应性改变的能力,分为结构性突触重塑和功能性突触重塑,在脑功能生理状态和病理状态中起着重要作用。神经精神疾病的核心致病机制之一就是神经元突触重塑。小G蛋白Rho家族对神经元突触重塑具有重... 神经元突触重塑是神经系统结构与功能的适应性改变的能力,分为结构性突触重塑和功能性突触重塑,在脑功能生理状态和病理状态中起着重要作用。神经精神疾病的核心致病机制之一就是神经元突触重塑。小G蛋白Rho家族对神经元突触重塑具有重要的调控作用,其中Rac1、Cdc42和RhoA最为人熟知。本文总结了小G蛋白Rho家族在药物成瘾中对突触重塑的调控作用,以期加深对药物成瘾分子机制的理解。 展开更多
关键词 药物成瘾 小G蛋白Rho家族 突触可塑性
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高迁移率族蛋白与真核基因表达调控 被引量:19
7
作者 徐佳 刘志锋 姜勇 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2005年第5期397-402,共6页
高迁移率族蛋白(high mobility group protein,HMG)是一系列的染色质相关蛋白,广泛存在于真核生物细胞中,含量丰富,因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的高迁移率而得名.HMG蛋白家族可分为HMGB、HMGA和HMGN三类亚家族,各亚家族有其特征的结构域... 高迁移率族蛋白(high mobility group protein,HMG)是一系列的染色质相关蛋白,广泛存在于真核生物细胞中,含量丰富,因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的高迁移率而得名.HMG蛋白家族可分为HMGB、HMGA和HMGN三类亚家族,各亚家族有其特征的结构域,这些结构域介导了HMG和DNA或染色质相关区域的相互作用.现已发现这些蛋白质具有多种重要生物学功能,其中几乎所有HMG都可以通过修饰、弯曲或改变染色质/DNA的结构,促进各种蛋白质因子形成大分子复合物来调节基因转录. 展开更多
关键词 基因表达调控 迁移率 聚丙烯酰胺凝胶电泳 mobility 真核生物细胞 group 生物学功能 分子复合物 染色质 相关蛋白 相互作用 基因转录 结构域 蛋白质 DNA 家族 G蛋白 BMG HMG
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妊娠期糖尿病合并妊娠期高血压疾病血清差异蛋白的鉴定 被引量:22
8
作者 王硕石 胡水旺 钟梅 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第7期1224-1227,共4页
目的寻找妊娠期糖尿病合并妊娠期高血压疾病的分子标记物,为筛查及防治该类疾病提供分子生物学基础。方法收集妊娠期高血压疾病、妊娠期糖尿病、妊娠期糖尿病合并妊娠期高血压疾病患者的静脉血清标本各4份,去除高丰度的免疫球蛋白和白... 目的寻找妊娠期糖尿病合并妊娠期高血压疾病的分子标记物,为筛查及防治该类疾病提供分子生物学基础。方法收集妊娠期高血压疾病、妊娠期糖尿病、妊娠期糖尿病合并妊娠期高血压疾病患者的静脉血清标本各4份,去除高丰度的免疫球蛋白和白蛋白。应用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术将可溶性血清总蛋白分离。切取在不同样品中显示明显差异的蛋白条带,酶解后使用质谱技术对所得的差异蛋白进行鉴别。运用生物信息学分析差异蛋白的生物学功能。结果将上述去除高丰度蛋白的标本进行3次重复的SDS-PAGE,确定了显示显著差异的蛋白条带。质谱分析结果表明这些差异性蛋白分别为:结合珠蛋白、SMG8蛋白和凋亡诱导因子-1。结论为建立妊娠期代谢性疾病的蛋白质数据库提供了基础性数据。鉴定了与该疾病显著相关的部分蛋白,为进一步预防该疾病、改善妊娠结局以及阐明该疾病的分子机制提供了可参考的实验依据。 展开更多
关键词 妊娠期糖尿病合并妊娠期高血压疾病 妊娠期高血压疾病 妊娠期糖尿病 差异蛋白 质谱
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丝裂原活化的蛋白激酶在高迁移率族蛋白1诱导内皮细胞释放炎性细胞因子中的作用 被引量:5
9
作者 钟田雨 唐靖 +6 位作者 刘亚伟 李志杰 陈登宇 赵明哲 王蔚 刘靖华 姜勇 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期1517-1520,共4页
目的研究重组人高迁移率族蛋白1(HMGB1)诱导内皮细胞释放趋化因子白介素-8(IL-8)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的规律及其与脂多糖(LPS)的协同作用;探讨丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK)信号通路在上述作用中的地位。方法用LiquiChip液相蛋白... 目的研究重组人高迁移率族蛋白1(HMGB1)诱导内皮细胞释放趋化因子白介素-8(IL-8)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的规律及其与脂多糖(LPS)的协同作用;探讨丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK)信号通路在上述作用中的地位。方法用LiquiChip液相蛋白芯片系统检测不同浓度重组HMGB1(0~75ng/ml),或者HMGB1(15ng/ml)刺激后不同时间点人脐静脉内皮细胞(HUVEC)分泌IL-8、MCP-1的水平变化以及HMGB1(15ng/ml)与LPS(10ng/ml)共同刺激后IL-8、MCP-1的水平变化;探讨MAPK信号通路在HMGB1诱导内皮细胞释放趋化因子中的作用时首先加入抑制剂SB203580(20mol/L)、PD98059(20mol/L)和JNKinhibitorII(50nmol/L)预处理细胞1h,再加入HMGB1和LPS刺激。结果在HMGB1蛋白刺激后3~6h,IL-8和MCP-1水平开始增加,12~24h持续增高(P<0.01);随着HMGB1浓度的增加,IL-8和MCP-1水平也明显升高,与基础值相比差异有统计学意义(P<0.01)。如果用LPS(10ng/ml)和... 展开更多
关键词 人高迁移率族蛋白1 脂多糖 趋化因子 白介素-8 单核细胞趋化蛋白-1 人脐静脉内皮细胞 丝裂原活化的蛋白激酶
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C反应蛋白真核表达载体的构建与表达 被引量:3
10
作者 陈腾祥 李红梅 +2 位作者 胡水旺 刘靖华 姜勇 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期514-517,共4页
目的构建人C反应蛋白(CRP)真核表达载体,并观察其在NIH3T3细胞中的表达定位情况。方法利用带HA反向互补序列碱基的特异性引物,从p91023/CRP载体上将编码人CRP的基因序列亚克隆到真核表达载体pcDNA3上;对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定... 目的构建人C反应蛋白(CRP)真核表达载体,并观察其在NIH3T3细胞中的表达定位情况。方法利用带HA反向互补序列碱基的特异性引物,从p91023/CRP载体上将编码人CRP的基因序列亚克隆到真核表达载体pcDNA3上;对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,利用脂质体转染方法转染NIH3T3细胞;并使用Westernblot和细胞免疫化学技术对重组质粒pcDNA3/HA-CRP在NIH3T3细胞中的表达及其蛋白定位进行分析。结果PCR、双酶切和测序鉴定表明,pcDNA3/HA-CRP真核表达质粒构建正确;转染实验发现,该质粒能够在NIH3T3细胞中表达,表达产物主要定位在细胞膜和核周边内质网的区域。结论成功构建了带HA标签的人CRP真核表达载体,该载体能够在哺乳动物细胞NIH3T3中表达,为进一步研究CRP的细胞内生物学功能提供了一个重要的工具。 展开更多
关键词 C反应蛋白 载体构建 基因表达 蛋白定位
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人高迁移率族蛋白1的原核细胞表达及其功能研究 被引量:5
11
作者 赵雷 刘靖华 +4 位作者 唐靖 李志杰 刘亚伟 邓鹏 姜勇 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期1119-1123,共5页
目的:构建带His标记的人高迁移率族蛋白1(HMGB1)融合蛋白原核细胞表达质粒,表达并纯化人HMGB1重组蛋白,观察其对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)释放细胞因子的影响。方法:首先将目的片段HMGB1亚克隆到改造的载体pET14b上,经鉴定、测序证实序... 目的:构建带His标记的人高迁移率族蛋白1(HMGB1)融合蛋白原核细胞表达质粒,表达并纯化人HMGB1重组蛋白,观察其对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)释放细胞因子的影响。方法:首先将目的片段HMGB1亚克隆到改造的载体pET14b上,经鉴定、测序证实序列正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达His-HMGB1融合蛋白,用Ni-NTA亲和树脂纯化。将纯化得到的HMGB1蛋白经透析和过滤除菌后,刺激人脐静脉内皮细胞,24h后收集培养上清,经LiquiChip液相蛋白芯片系统检测细胞因子。结果:构建的pET14b/HMGB1表达质粒经酶切和测序验证正确;表达的目的蛋白经Western blotting验证能被His抗体识别;检查了纯化的HMGB1蛋白对HUVEC产生细胞因子的影响,发现重组的HMGB1可诱导白细胞介素8(IL-8)上调,并且呈剂量依赖性关系。结论:成功构建了His-HMGB1原核细胞表达质粒并纯化得到重组的HMGB1;在HUVEC模型上证实所得到的HMGB1蛋白具有生物学活性。本实验为进一步研究HMGB1的功能提供了重要的实验材料。 展开更多
关键词 高迁移率族蛋白质类 原核表达 细胞因子类 脐静脉内皮细胞
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转甲状腺素蛋白真核表达载体的构建及其细胞内定位 被引量:3
12
作者 胡水旺 孙明晶 +3 位作者 夏高晓 陈丽 赵明哲 姜勇 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期722-724,共3页
目的构建转甲状腺素蛋白(TTR)的真核表达载体,观察其在NIH3T3细胞中的表达及定位。方法提取BALB/c小鼠肝脏组织的总RNA,通过RT-PCR扩增得到TTR编码序列,将该编码序列克隆到带有血凝素(HA)标记的载体pcDNA3-HA上,构建质粒pcDNA3-TTR-HA... 目的构建转甲状腺素蛋白(TTR)的真核表达载体,观察其在NIH3T3细胞中的表达及定位。方法提取BALB/c小鼠肝脏组织的总RNA,通过RT-PCR扩增得到TTR编码序列,将该编码序列克隆到带有血凝素(HA)标记的载体pcDNA3-HA上,构建质粒pcDNA3-TTR-HA。重组质粒通过PCR、酶切测序等证明构建正确后经脂质体转染NIH3T3细胞,固定并染色后通过荧光显微镜观察该融合蛋白的表达及定位。结果重组质粒经鉴定证明构建正确。转染实验发现,该质粒能够在NIH3T3细胞中表达,表达产物主要分布在细胞质中。结论成功构建带HA标签的TTR真核表达载体,该载体能在哺乳动物细胞中有效表达并正确定位,为深入研究TTR在细胞内的相关生物学功能奠定了基础。 展开更多
关键词 前白蛋白 克隆 分子 基因表达
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髓样分化蛋白-2在识别和转导内毒素信号中的作用 被引量:7
13
作者 钟田雨 刘靖华 姜勇 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2007年第5期460-464,共5页
脂多糖(LPS)通过TLR4介导细胞炎症反应.研究表明,髓样分化蛋白-2(MD-2)通过与TLR4形成复合物参与LPS诱导的细胞信号过程.TLR4/MD-2复合物中的MD-2结合LPS后,引起TLR4低聚化,进而激发下游信号.MD-2合成后,大部分在内质网/高尔基体和TLR4... 脂多糖(LPS)通过TLR4介导细胞炎症反应.研究表明,髓样分化蛋白-2(MD-2)通过与TLR4形成复合物参与LPS诱导的细胞信号过程.TLR4/MD-2复合物中的MD-2结合LPS后,引起TLR4低聚化,进而激发下游信号.MD-2合成后,大部分在内质网/高尔基体和TLR4结合,然后以TLR4/MD-2复合物的形式在细胞表面表达.这既能调节TLR4的胞内分布,又能辅助TLR4识别LPS.还有一部分MD-2释放到血浆中,形成可溶性的MD-2(sMD-2).sMD-2在CD14参与下,能结合血浆中的LPS,形成LPS-sMD-2复合物从而辅助只表达TLR4而不表达MD-2的细胞识别LPS,但过度表达的sMD-2又能抑制LPS信号.MD-2在TLR4介导的内毒素识别和信号转导过程中发挥了重要的调控作用. 展开更多
关键词 髓样分化蛋白-2(MD-2) TLR4 脂多糖(LPS) 信号转导
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带FLAG标签小鼠HuR真核表达载体的构建及其生物学功能的鉴定 被引量:3
14
作者 李涛 于文燕 +3 位作者 欧小利 刘爱华 梅柱中 姜勇 《解放军医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期352-355,共4页
目的构建人抗原R(HuR)的真核表达载体,观察其在NIH3T3细胞中的表达并初步分析其生物学功能。方法提取NIH3T3细胞总RNA并反转录为cDNA,以cDNA为模板PCR扩增得到小鼠HuR编码序列,酶切后克隆至pcDNA3.1-FLAG载体;重组载体经PCR、酶切、测... 目的构建人抗原R(HuR)的真核表达载体,观察其在NIH3T3细胞中的表达并初步分析其生物学功能。方法提取NIH3T3细胞总RNA并反转录为cDNA,以cDNA为模板PCR扩增得到小鼠HuR编码序列,酶切后克隆至pcDNA3.1-FLAG载体;重组载体经PCR、酶切、测序鉴定正确后瞬时转染NIH3T3细胞,采用Western blotting分析HuR在细胞中的表达,并采用Real-time PCR检测HuR过表达对DUSP1mRNA水平的影响。结果成功构建了重组质粒pcDNA3.1-HuR-FLAG,Western blotting显示该质粒能在NIH3T3细胞中高效表达,Real-time PCR结果表明HuR过表达可提高细胞内DUSP1基因的mRNA水平。结论成功构建了带FLAG标签的HuR真核表达载体,该载体能在NIH3T3细胞中有效表达,并具有相应的生物学功能,为深入研究肿瘤细胞中HuR对DUSP1基因表达的调控机制奠定基础。 展开更多
关键词 人抗原R 基因表达 基因转录后调控
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人IP-10融合蛋白表达载体的构建和表达及活性鉴定 被引量:4
15
作者 邵紫韫 刘志锋 +4 位作者 彭毅 徐佳 秦清和 邓鹏 姜勇 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第5期898-901,共4页
目的构建人His标记的IP-10(interferon-γ-inducibleprotein10)融合蛋白表达载体并在原核细胞中表达、纯化,获得有活性的IP-10蛋白,为进一步研究其在炎症过程中的作用机制及寻找新的抗炎途径提供基础。方法从人肺cDNA文库中PCR扩增无信... 目的构建人His标记的IP-10(interferon-γ-inducibleprotein10)融合蛋白表达载体并在原核细胞中表达、纯化,获得有活性的IP-10蛋白,为进一步研究其在炎症过程中的作用机制及寻找新的抗炎途径提供基础。方法从人肺cDNA文库中PCR扩增无信号肽的IP-10基因编码序列,构建重组载体pET-14b/IP-10;重组质粒经酶切、测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株;经异丙基β-D-硫代半乳糖(IPTG)诱导后,用镍离子亲和层析柱纯化融合蛋白,以THP-1细胞进行微室跨膜迁移(transwell)实验鉴定融合蛋白活性。结果酶切、测序鉴定重组载体pET-14b/IP-10构建正确,并纯化得到高纯度的IP-10融合蛋白。而且该蛋白具有诱导单核细胞THP-1跨膜迁移活性。结论成功构建了人IP-10融合蛋白表达载体,并纯化得到具有活性的IP-10融合蛋白,为进一步研究IP-10的功能提供了重要的实验材料。 展开更多
关键词 γ干扰素诱导蛋白10 融合蛋白质类 细胞运动
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Rab7蛋白参与了BLP耐受巨噬细胞对细菌清除能力增强的过程 被引量:2
16
作者 赵舒祺 蔡军伟 +7 位作者 李雪 杨勤 黄林 罗海华 项静 乔敏 姜勇 刘靖华 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第5期900-906,共7页
目的:探讨Rab GTP酶是否参与了对细菌脂蛋白(BLP)耐受的骨髓诱导分化巨噬细胞(BMDMs)杀菌能力增强的过程。方法:首先利用real-time PCR比较BLP耐受巨噬细胞和非耐受细胞中Rab5a、Rab5b、Rab7、Rab9、Rab9b、Rab11a、Rab11b、Rab12、Rab3... 目的:探讨Rab GTP酶是否参与了对细菌脂蛋白(BLP)耐受的骨髓诱导分化巨噬细胞(BMDMs)杀菌能力增强的过程。方法:首先利用real-time PCR比较BLP耐受巨噬细胞和非耐受细胞中Rab5a、Rab5b、Rab7、Rab9、Rab9b、Rab11a、Rab11b、Rab12、Rab32和Rab34的表达变化,筛选出水平升高的Rab7分子;进一步用real-time PCR和Western blot实验证实Rab7的mRNA和蛋白表达是否在BLP耐受细胞感染大肠杆菌后继续升高;接下来用RNAi技术下调BLP耐受巨噬细胞Rab7表达,观察细胞对细菌的吞噬能力及杀灭能力的影响。结果:在检测的10个Rab GTP酶中,Rab7在BLP耐受BMDMs的mRNA水平升高,是非耐受细胞的1.4倍;进一步用real-time PCR和Western blot实验证实Rab7的mRNA和蛋白表达在BLP耐受细胞感染大肠杆菌后,随着时间延长均明显升高;下调Rab7表达不影响BLP耐受巨噬细胞对细菌的吞噬能力,但是显著降低其对细菌的杀灭能力。结论:BLP耐受通过上调巨噬细胞Rab7的表达,在增强巨噬细胞对细菌的杀灭过程中发挥重要作用。 展开更多
关键词 细菌脂蛋白 耐受 细菌清除 RAB GTP酶 Rab7蛋白
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SARS-CoV的S蛋白诱导呼吸道上皮细胞合成释放IP-10的信号分子机制研究 被引量:4
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作者 要国华 杨新艳 +1 位作者 姜勇 徐军 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第3期423-426,共4页
目的:研究SARS冠状病毒S蛋白诱导呼吸道上皮细胞合成释放IP-10(interferon-gamma induc-ible protein 10)的信号分子机制。方法:通过基因芯片检测SARS冠状病毒的S蛋白作用于人支气管上皮细胞16HBE后信号通路基因表达谱的变化;采纳RT-PCR... 目的:研究SARS冠状病毒S蛋白诱导呼吸道上皮细胞合成释放IP-10(interferon-gamma induc-ible protein 10)的信号分子机制。方法:通过基因芯片检测SARS冠状病毒的S蛋白作用于人支气管上皮细胞16HBE后信号通路基因表达谱的变化;采纳RT-PCR、EMSA、Western blotting等方法进一步分析JAK-STAT通路中信号分子的磷酸化、IRF-1和IP-10基因表达的变化及其相应信号分子抑制剂对表达水平的影响。结果:S蛋白作用于人支气管上皮细胞16HBE诱导了JAK-STAT信号通路涉及的重要转录因子基因IRF-1的表达,该信号通路的转录因子STAT1在刺激后15 min发生磷酸化,2 h即可检出IP-10基因的表达,IP-10的表达可以完全被STAT1、JAK2抑制剂阻断。EMSA显示:支气管上皮细胞在S蛋白的作用下,其核蛋白能够特异性与ISRE和GASDNA基序相结合,而不能与NF-κB的DNA基序相结合。结论:SARS-CoV的S蛋白通过激活JAK-STAT信号转导通路诱导IP-10在宿主细胞的生成。提示病毒诱导的JAK-STAT信号通路激活在病毒感染相关的急性肺损伤发生中具有重要地位。 展开更多
关键词 严重急性呼吸综合征 冠状病毒属 S蛋白 气道上皮细胞 γ干扰素诱导蛋白10
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重组人CRP的表达纯化及其内化进入HeLa细胞的观察 被引量:2
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作者 陈腾祥 李红梅 +4 位作者 胡水旺 赵明哲 刘亚伟 刘靖华 姜勇 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期1155-1160,共6页
目的:构建人C-反应蛋白(CRP)原核表达载体,表达纯化his-EGFP-CRP蛋白,观察其能否内化进入HeLa肿瘤细胞。方法:利用特异性引物,从p91023/CRP载体上将编码人CRP的基因序列亚克隆到原核表达载体pET14b/MCS-EGFP-(N)36上;对阳性克隆进行PCR... 目的:构建人C-反应蛋白(CRP)原核表达载体,表达纯化his-EGFP-CRP蛋白,观察其能否内化进入HeLa肿瘤细胞。方法:利用特异性引物,从p91023/CRP载体上将编码人CRP的基因序列亚克隆到原核表达载体pET14b/MCS-EGFP-(N)36上;对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,并将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达的重组蛋白通过亲和色谱纯化,梯度透析复性,并与HeLa细胞孵育,利用荧光显微镜观察其内化入胞。结果:PCR、双酶切和测序鉴定表明,pET14b/EGFP-hCRP原核表达质粒构建正确;转化实验发现,该质粒在BL21(DE3)中能够被大量诱导表达;蛋白纯化及荧光显微镜观察结果表明,复性后的表达产物可结合于HeLa细胞膜,孵育一定时间后,可定位于胞质及胞核。结论:成功地构建了带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标签的人CRP原核表达载体,该载体能够在大肠杆菌BL21(DE3)中被诱导表达重组蛋白his-EGFP-CRP,纯化复性后的重组人CRP能与HeLa肿瘤细胞结合,并能内化入胞,移位入核。 展开更多
关键词 C反应蛋白 载体构建 基因表达 蛋白质复性 HELA细胞
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基于细胞穿透肽技术对p38丝裂原活化蛋白激酶蛋白功能的研究 被引量:3
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作者 杨丽萍 刘志锋 +2 位作者 黎永明 李志杰 姜勇 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第5期553-557,共5页
目的构建基于TAT技术的p38MAPK蛋白转运系统并对导入细胞的融合蛋白的功能进行鉴定。方法采用亚克隆方法构建重组质粒pHis-TAT-p38和pHis-TAT-p38(AF)无活性突变体,并诱导原核表达纯化融合蛋白;将这两种蛋白加入培养的ECV304细胞,在高... 目的构建基于TAT技术的p38MAPK蛋白转运系统并对导入细胞的融合蛋白的功能进行鉴定。方法采用亚克隆方法构建重组质粒pHis-TAT-p38和pHis-TAT-p38(AF)无活性突变体,并诱导原核表达纯化融合蛋白;将这两种蛋白加入培养的ECV304细胞,在高渗刺激下,通过检测p38底物ATF2的磷酸化水平,以观察由TAT转导进入细胞His-TAT-p38及其无活性突变体对内源性p38活性的影响。结果酶切和测序结果表明,载体构建正确;SDS-PAGE凝胶电泳可见原核表达纯化得到高纯度目的蛋白;Westernblot表明,融合蛋白His-TAT-p38及其突变体能够以一种时间和浓度依赖性方式高效转导进入细胞;导入His-TAT-p38蛋白后,结果发现导入的野生型p38可增强内源性p38的功能,而无活性突变体则竞争性抑制了内源性p38MAPK蛋白的功能,从而阻止或抑制其对内源性底物ATF2的磷酸化,使得信号不能传递下去,进而抑制p38MAPK通路的活动。结论成功建立了基于TAT的蛋白转运系统,并证实TAT能够以浓度和时间依赖方式高效转运蛋白进入真核细胞;进入细胞的His-TAT-p38和His-TAT-p38无活性突变体蛋白均具有较高的生物学活性,在高渗刺激作用下前者可以增加p38磷酸化水平,而后者则显著抑制p38信号通路的活性。 展开更多
关键词 Ⅰ型人免疫缺陷病毒转录激活蛋白 P38丝裂原活化蛋白激酶 蛋白转导
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Prdx4蛋白表达改变对HeLa细胞迁移和侵袭的影响 被引量:3
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作者 袁伟燕 张丽 +2 位作者 石红琴 龚小卫 姜勇 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第4期637-643,共7页
目的:观察过氧化物还原酶4(peroxiredoxin 4,Prdx4)蛋白表达的改变对人宫颈癌HeLa细胞迁移和侵袭的影响。方法:采用脂质体瞬时转染法将表达质粒pc DNA3.0-HA-Prdx4转染HeLa细胞;LV-Prdx4 RNAi重组病毒感染HeLa细胞,构建Prdx4 shRNA HeL... 目的:观察过氧化物还原酶4(peroxiredoxin 4,Prdx4)蛋白表达的改变对人宫颈癌HeLa细胞迁移和侵袭的影响。方法:采用脂质体瞬时转染法将表达质粒pc DNA3.0-HA-Prdx4转染HeLa细胞;LV-Prdx4 RNAi重组病毒感染HeLa细胞,构建Prdx4 shRNA HeLa细胞系沉默Prdx4的表达;用蛋白质印迹法证实Prdx4蛋白表达水平的变化;应用划痕愈合实验和Transwell迁移及侵袭实验分别检测细胞迁移及侵袭能力的变化。结果:pc DNA3.0-HA-Prdx4质粒转染组He La细胞的Prdx4蛋白表达水平明显上调(P<0.05),而Prdx4 shRNA HeLa稳定干扰细胞系Prdx4表达水平明显下调(P<0.05)。Prdx4过表达组HeLa细胞的迁移和侵袭能力明显增强,与空白对照组及空载体转染组比较,差异显著(P<0.01)。Prdx4表达干扰组HeLa细胞的迁移和侵袭能力明显受到抑制,与空白对照组及阴性对照组比较,差异显著(P<0.01)。结论:上调Prdx4蛋白表达水平可促进HeLa细胞的迁移和侵袭,在宫颈癌的发生和发展过程中可能起重要作用;下调Prdx4蛋白表达水平可以明显抑制HeLa细胞的迁移和侵袭能力,Prdx4有可能成为临床治疗宫颈癌的一个潜在靶点。 展开更多
关键词 宫颈癌 过氧化物还原酶4 细胞迁移 细胞侵袭
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