基于成果导向教育理念的实验动物科研项目在大学生综合素质培养中的实践 被引量：6

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作者 鞠吉雨 徐玉梅 +2 位作者 刘琳琳 杜鸿斌 赵春玲 《中国比较医学杂志》 CAS 北大核心 2018年第11期119-122,共4页

高等教育要重视培养学生的创新能力、实践能力和创业精神,普遍提高学生的人文素质和科学素养。我们以成果导向教育理念(outcome-based education,OBE)为指导,以实验动物科研项目为抓手,在大学生创新训练项目中制定预期学习产出,突出能... 高等教育要重视培养学生的创新能力、实践能力和创业精神,普遍提高学生的人文素质和科学素养。我们以成果导向教育理念(outcome-based education,OBE)为指导,以实验动物科研项目为抓手,在大学生创新训练项目中制定预期学习产出,突出能力培养,在项目实施中强化学生学习的主体地位。实践结果表明,学生自主学习能力、创新和实践能力获得了提升;学生科研思路、科研设计得到系统提高;学生实验动物福利观念得到了加强;学生在标准化实验动物的选择、实验操作技术的标准化等方面有了素质养成;对实验动物和动物实验理论知识和关键技术等方面具有正确的认识和科学的应用。 展开更多

关键词 成果导向教育理念 实验动物 创新能力 动物福利

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加强医学研究生实验动物福利教育的思考 被引量：24

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作者 鞠吉雨 徐玉梅 +4 位作者 耿云峰 王伟龙 徐晓琳 杜鸿斌 赵春玲 《中国比较医学杂志》 CAS 北大核心 2018年第10期94-97,共4页

实验动物为医学研究作出了巨大的贡献。但在医学研究生培养中,实验动物福利教育的缺乏导致研究生实验动物伦理意识淡薄,缺乏对实验动物福利的科学认知,缺乏实验动物福利的相关知识,从而不能正确认识和对待实验动物的生命,不能科学、合... 实验动物为医学研究作出了巨大的贡献。但在医学研究生培养中,实验动物福利教育的缺乏导致研究生实验动物伦理意识淡薄,缺乏对实验动物福利的科学认知,缺乏实验动物福利的相关知识,从而不能正确认识和对待实验动物的生命,不能科学、合理、人道地使用实验动物进行医学研究。为进一步提升医学研究生的伦理素养,高等医学院校应规范课程设置,加强实验动物福利知识教育;探索从业资格证书,规范持证研究制度;遵循3R原则,医学研究贯彻实验动物福利观;加强实践监督,伦理审查优先。从而更好地规范医学研究生在使用实验动物时的行为。 展开更多

关键词 实验动物 实验动物伦理学 动物福利 医学研究生

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mOX40-Ig的表达及其生物学活性的初步研究

3

作者 刘艳菲 林志娟 +3 位作者 冯永堂 许传武 史琳 苗乃法 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第2期126-129,共4页

目的:构建pcDNA3.1-mOX40-Ig真核表达载体,转染CHO细胞进行稳定表达,获得有生物学活性的mOX40-Ig融合蛋白。方法:RT-PCR法扩增获得hIgG1Fc段基因,构建pcDNA3.1-hIgG1Fc重组质粒并经测序证实。从本室保存的pIRES2-EGFP-mOX40重组质粒中PC... 目的:构建pcDNA3.1-mOX40-Ig真核表达载体,转染CHO细胞进行稳定表达,获得有生物学活性的mOX40-Ig融合蛋白。方法:RT-PCR法扩增获得hIgG1Fc段基因,构建pcDNA3.1-hIgG1Fc重组质粒并经测序证实。从本室保存的pIRES2-EGFP-mOX40重组质粒中PCR扩增mOX40胞外段,将其插入pcDNA3.1-hIgG1Fc重组质粒中构建pcDNA3.1-mOX40-Ig真核表达载体。脂质体法转染CHO细胞获得稳定表达,用RT-PCR与ELISA法检测其表达,蛋白A亲和纯化后,SDS-PAGE进行鉴定。3H-TdR掺入法研究OX40信号对B细胞的体外促增殖作用。结果:测序证实hIgG1Fc段、mOX40胞外段及mOX40-Ig基因序列正确,RT-PCR与ELISA证实mOX40-Ig的表达,SDS-PAGE证实其为mOX40-Ig融合蛋白,3H-TdR掺入法显示mOX40-Ig在体外能有效地促进B细胞增殖。结论:成功地构建pcDNA3.1-mOX40-Ig真核表达载体,并获得有生物学活性的mOX40-Ig融合蛋白的稳定表达,为进一步开展OX40相关领域的横向应用研究奠定了基础。 展开更多

关键词 OX40 mOX40-Ig CHO细胞 真核表达

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以hsa-miR-491-3p为靶标的反义寡核苷酸对NCI-H446细胞生物学特性的影响 被引量：3

4

作者 官士珍 付玉荣 +3 位作者 伊正君 李猛 裴景亮 高昆山 《中国癌症杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期171-176,共6页

背景与目的:miRNAs是一类小分子RNA,参与转录后调控。前期研究结果显示,hsa-miR-491-3p在肺癌和肾癌组织中高表达,目前鲜见其功能研究的报道。本研究旨在探讨以hsa-miR-491-3p为靶标的反义寡核苷酸对人小细胞肺癌NCI-H446细胞生物学特... 背景与目的:miRNAs是一类小分子RNA,参与转录后调控。前期研究结果显示,hsa-miR-491-3p在肺癌和肾癌组织中高表达,目前鲜见其功能研究的报道。本研究旨在探讨以hsa-miR-491-3p为靶标的反义寡核苷酸对人小细胞肺癌NCI-H446细胞生物学特性的影响。方法:合成以hsa-miR-491-3p为靶标的反义寡核苷酸和随机对照序列,转染NCI-H446细胞。实验分4组:空白对照组(组1)、空白转染组(组2)、随机对照组(组3)和反义寡核苷酸组(组4)。用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法筛选最佳作用浓度,Hoechst33258染色检测细胞核的形态变化,流式细胞术检测细胞凋亡和周期变化,划痕实验检测细胞的迁移能力。结果:转染反义寡核苷酸后细胞生长受到抑制,最佳作用浓度为0.5μmol/L。Hoechst33258染色各组的凋亡率分别为(6.67±0.58)%、(7.00±1.00)%、(6.67±1.53)%和(26.33±1.53)%,组4的凋亡率明显高于前3组,差异有统计学意义(P<0.001)。流式细胞仪检测各组的凋亡率分别为(2.44±0.60)%、(2.59±0.85)%、(2.62±1.11)%和(5.22±0.40)%,组4的凋亡率明显高于前3组,差异有统计学意义(P<0.01),且G1期细胞增多,S期细胞减少。划痕实验显示各组细胞24 h的迁移距离分别为(196.88±39.13)、(163.06±21.28)、(225.49±23.42)和(77.41±6.07)μm,组4细胞的迁移距离小于前3组(P<0.05),迁移能力减弱。结论:以hsa-miR-491-3p为靶标的反义寡核苷酸能够抑制NCI-H446细胞增殖,诱导其凋亡,并降低其侵袭能力。 展开更多

关键词 hsa-miR-491-3p 反义寡核苷酸 细胞凋亡 NCI-H446细胞

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肝癌细胞特异性IL-1β反义RNA对小鼠移植肝癌的抑制 被引量：6

5

作者 刘艳艳 梁淑娟 +3 位作者 王焕芹 张素华 肖伟玲 吴慧娜 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期253-257,共5页

目的:构建肝癌细胞特异性小鼠IL-1β反义RNA表达载体,观察其对H22肝癌细胞小鼠移植瘤生长的影响及其相关机制。方法:构建由AFP最小启动子和CMV增强子嵌合序列调控的携IL-1β反义RNA表达载体pafpIRES2-antiIL-1β1和pafpIRES2-antiIL-1... 目的:构建肝癌细胞特异性小鼠IL-1β反义RNA表达载体,观察其对H22肝癌细胞小鼠移植瘤生长的影响及其相关机制。方法:构建由AFP最小启动子和CMV增强子嵌合序列调控的携IL-1β反义RNA表达载体pafpIRES2-antiIL-1β1和pafpIRES2-antiIL-1β2,经质粒PCR、限制性酶谱分析、序列测定进行鉴定。反义RNA表达载体转染小鼠H22肝癌细胞,分H22/mock组、H22/antiIL-1β1组、H22/antiIL-1β2三组,RT-PCR检测IL-1β的表达水平。以转染后的H22细胞皮下接种建立荷肝癌小鼠模型,观察移植瘤体积和重量,MTT法检测荷瘤小鼠脾脏中分离的NK细胞对H22细胞的杀伤活性。结果:经质粒PCR、限制性酶谱分析、序列测定证实成功构建能够在肝癌细胞中特异性表达IL-1β反义RNA的表达载体pafpIRES2-anti-IL-1β1和pafpIRES2-antiIL-1β2,转染H22细胞后细胞中IL-1β表达水平明显下降,以pafpIRES2-antiIL-1β2更为显著。成功建立荷肝癌小鼠模型,与H22/mock组小鼠相比,H22/antiIL-1β2组小鼠移植瘤体积较小,生长显著减慢(P<0.05)。H22/anti-IL-1β1、H22/antiIL-1β2组荷瘤小鼠的NK细胞对H22细胞的杀伤活性明显增强(P<0.05或P<0.01)。结论:成功构建的肝癌细胞特异性IL-1β反义RNA表达载体可有效抑制小鼠移植肝癌的生长,其机制与靶向阻断IL-1β表达、上调NK细胞的杀伤活性有关。 展开更多

关键词 肝癌 白细胞介素1Β 反义RNA NK细胞

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内皮抑素在兔VX2肝移植瘤介入治疗中的应用价值 被引量：4

6

作者 蹇兆成 孙业全 +4 位作者 王滨 梁淑娟 刘艳 白旭明 宁厚法 《介入放射学杂志》 CSCD 北大核心 2009年第4期285-289,共5页

目的探讨内皮抑素在兔VX2肝移植瘤介入治疗中的应用价值。方法建立兔肝移植瘤模型,随机分为对照组(NS,10只),TACE组(Lipiodol+ADM,10只)和内皮抑素组(Lipiodol+ADM+ES,10只),多排螺旋CT测量肿瘤大小,计算肿瘤增长率(GR);术后1周取出病... 目的探讨内皮抑素在兔VX2肝移植瘤介入治疗中的应用价值。方法建立兔肝移植瘤模型,随机分为对照组(NS,10只),TACE组(Lipiodol+ADM,10只)和内皮抑素组(Lipiodol+ADM+ES,10只),多排螺旋CT测量肿瘤大小,计算肿瘤增长率(GR);术后1周取出病理标本,利用免疫组化染色及半定量RT-PCR法分别检测残瘤组织微血管密度(MVD)和血管内皮生长因子(VEGF)表达。结果3组肿瘤增长率分别为对照组(270.86±148.94)%,TACE组(-8.91±21.77)%,内皮抑素组(-20.40±36.07)%,3组间相互比较,对照组呈明显正增长,与其余2组比较差异均有统计学意义(P<0.01),而TACE组与内皮抑素组之间差异无统计学意义(P>0.05);各组的MVD值分别为80.00±17.14(对照组)、84.22±16.45(TACE组)和57.00±13.26(内皮抑素组),内皮抑素组MVD值最低,与另外2组比较差异均有统计学意义(P<0.05),对照组和TACE组之间差异性不明显(P>0.05);VEGF165mRNA:对照组为(0.85±0.056),TACE组为(1.10±0.087),内皮抑素组为(0.72±0.065),TACE组表达水平最高,与其余2组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论兔VX2肝移植瘤的介入治疗中应用内皮抑素后,肿瘤明显缩小,肿瘤组织VEGF的表达减低,MVD的分布减少,提高了肿瘤的治疗效果。 展开更多

关键词 肝肿瘤 实验性 化学栓塞 治疗性 新生血管化 病理性 动物 实验

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人caspase-1基因在肝癌细胞中的表达及对IL-1β水平的影响 被引量：4

7

作者 林志娟 肖伟玲 +2 位作者 王雪净 李青春 梁淑娟 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期29-33,共5页

目的:将人caspase-1基因真核表达载体转染肝癌细胞后观察其表达水平及对IL-1β水平的影响,为研究cas-pase-1与IL-1β的关系及其在慢性炎症与肿瘤中的作用提供依据。方法:利用阳离子聚合物(jetPEI)将pIRES2-EGFP-caspase-1重组表达载体和... 目的:将人caspase-1基因真核表达载体转染肝癌细胞后观察其表达水平及对IL-1β水平的影响,为研究cas-pase-1与IL-1β的关系及其在慢性炎症与肿瘤中的作用提供依据。方法:利用阳离子聚合物(jetPEI)将pIRES2-EGFP-caspase-1重组表达载体和pIRES2-EGFP对照载体转染人肝癌细胞HepG2(HepG2/caspase-1、HepG2/mock),48小时后倒置相差荧光显微镜下观察表达情况,利用RT-PCR、Western blot方法检测两组细胞caspase-1表达水平,采用caspase-1底物显色分析研究的方法检测两组细胞中caspase-1的活性。夹心ELISA法检测细胞培养上清以及细胞裂解液中IL-1β的表达水平。结果:转染48小时后倒置相差显微镜下可见,pIRES2-EGFP-caspase-1和pIRES2-EGFP重组表达载体均能在HepG2细胞中高效表达;HepG2/caspase-1细胞中caspase-1 mRNA表达水平显著提高;经LPS刺激后,HepG2/caspase-1细胞中caspase-1总蛋白的水平明显升高;caspase-1的生物活性水平与对照组相比具有显著性差异(t=25.679,P<0.05);HepG2/caspase-1细胞培养上清中IL-1β的水平明显高于HepG2/mock组细胞(t=3.417,P<0.05),胞浆裂解液中的变化相对不显著(t=2.396,P>0.05)。结论:人caspase-1基因真核表达载体pIRES2-EGFP-caspase-1能够在肝癌细胞中高效表达caspase-1,且该重组表达载体在HepG2细胞中能提高活性IL-1β的表达。 展开更多

关键词 CASPASE-1 肝癌细胞 IL-1Β 炎症

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小鼠IL-1β在H22细胞的表达及对NK细胞杀伤活性的影响 被引量：4

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作者 肖伟玲 梁淑娟 +2 位作者 牟东珍 王雪净 吴慧娜 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第12期1130-1132,1135,共4页

目的:重组表达小鼠IL-1β全长基因,转染H22肝癌细胞,分析对NK细胞杀伤活性的影响。方法:构建小鼠IL-1β重组表达载体pIRES2-EGFP-mIL-1β,利用jetPEI转染H22肝癌细胞,RT-PCR和激光扫描共聚焦显微镜分析IL-1β重组载体的表达,MTT方法分... 目的:重组表达小鼠IL-1β全长基因,转染H22肝癌细胞,分析对NK细胞杀伤活性的影响。方法:构建小鼠IL-1β重组表达载体pIRES2-EGFP-mIL-1β,利用jetPEI转染H22肝癌细胞,RT-PCR和激光扫描共聚焦显微镜分析IL-1β重组载体的表达,MTT方法分析转染前后,野生型小鼠脾脏NK细胞对H22细胞杀伤活性的变化。结果:RT-PCR扩增出小鼠IL-1β,长度约843bp。纯化的PCR产物与pIRES2-EG-FP同时经XhoI和EcoRI双酶切,在T4连接酶作用下连接,转化大肠杆菌,提取质粒经PCR、限制性酶谱分析(XhoI+EcoRI)和DNA序列测定后,确认获得重组表达载体pIRES2-EGFP-mIL-1β。将该质粒转染至H22小鼠肝癌细胞中,RT-PCR和荧光观察证实,H22细胞能表达高水平IL-1β重组表达载体,与转染空载体的对照组细胞相比,IL-1β转基因后H22细胞对NK92细胞杀伤抵抗性明显增强,同时野生型小鼠脾脏NK细胞对pIRES2-EGFP-mIL-1β转基因细胞的杀伤活性明显下降,效靶比40:1时下降了约10%。结论:IL-1β能够明显增强H22肝癌细胞对NK细胞杀伤的抵抗性,可能是肝癌细胞借以逃逸天然免疫应答的重要机制。 展开更多

关键词 IL-1Β NK细胞 天然免疫 肝癌

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AFP启动子调控的小鼠IL-1β重组载体的构建及其在肝癌H22细胞中的表达 被引量：3

9

作者 李青春 梁淑娟 +3 位作者 王雪净 刘艳艳 王焕芹 张素华 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第7期603-605,共3页

目的:构建小鼠甲胎蛋白(AFP)启动子调控的小鼠IL-1β(mIL-1β)重组真核表达载体pafpIRES2-EGFP-mIL-1β,并检测其在真核细胞内的表达。方法:重叠延伸PCR技术(SOE-PCR)获得含小鼠AFP最小启动子及巨细胞病毒(CMV)增强子区(ECMV)的嵌合基因... 目的:构建小鼠甲胎蛋白(AFP)启动子调控的小鼠IL-1β(mIL-1β)重组真核表达载体pafpIRES2-EGFP-mIL-1β,并检测其在真核细胞内的表达。方法:重叠延伸PCR技术(SOE-PCR)获得含小鼠AFP最小启动子及巨细胞病毒(CMV)增强子区(ECMV)的嵌合基因,将其克隆至pIRES2-EGFP载体,构建肝癌细胞特异性表达载体pafpIRES2-EGFP。RT-PCR扩增小鼠IL-1β基因,克隆至pafpIRES2-EGFP,进行酶谱分析及DNA序列测定。利用jetPEI法将其分别转染H22细胞和YAC-1细胞,倒置相差荧光显微镜下观察,RT-PCR分析mIL-1β表达水平的变化。结果:SOE-PCR方法获得长度为537bp的AFP和ECMV嵌合基因,克隆后经限制性酶切和DNA序列分析确认成功构建了小鼠肝癌细胞特异性表达载体pafpIRES2-EGFP。PCR扩增小鼠IL-1β基因后将其克隆至pafpIRES2-EGFP,获得AFP启动子调控的小鼠IL-1β重组真核表达载体pafpIRES2-EGFP-mIL-1β,细胞转染分析证实,该载体能够在小鼠肝癌细胞中特异性高效表达,RT-PCR检测可见转染细胞中mIL-1β水平明显升高。结论:成功构建真核表达载体pafpIRES2-EGFP-mIL-1β,该载体能够在小鼠肝癌细胞中特异性表达IL-1β。 展开更多

关键词 IL-1Β AFP启动子 组织特异性 肝癌

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人IL-1β重组表达载体在肝癌细胞的表达及对其NK细胞杀伤敏感性的影响 被引量：2

10

作者 梁淑娟 潘继红 +2 位作者 牟东珍 肖伟玲 鞠吉雨 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第8期688-692,共5页

目的:构建全长人IL-1β真核表达载体,转染H7402肝癌细胞,分析对其NK细胞杀伤敏感性的影响。方法:RT-PCR法扩增人IL-1β基因全长编码序列,经T-A克隆,构建pIRES2-EGFP-IL-1β重组表达载体,采用阳离子聚合物jetPEI的方法转染H7402肝癌细胞,... 目的:构建全长人IL-1β真核表达载体,转染H7402肝癌细胞,分析对其NK细胞杀伤敏感性的影响。方法:RT-PCR法扩增人IL-1β基因全长编码序列,经T-A克隆,构建pIRES2-EGFP-IL-1β重组表达载体,采用阳离子聚合物jetPEI的方法转染H7402肝癌细胞,G418筛选获得稳定表达的细胞克隆,RT-PCR分析IL-1β的表达水平,MTT方法分析转染前后NK细胞对肝癌细胞杀伤活性的变化。结果:从LPS处理的人外周PBMCs总RNA中扩增出IL-1β(大小约829 bp),先构建pMD18-IL-1β克隆载体,DNA序列鉴定正确后,利用Pfu DNA聚合酶将IL-1β基因亚克隆到pIRES2-EGFP中,构建真核表达载体pIRES2-EGFP-IL-1β,经PCR、限制性酶谱分析(BamHⅠ和EcoRⅠ)和DNA序列测定正确后,将其转染H7402肝癌细胞,G418筛选获得稳定表达IL-1β的细胞,与转染空载体的细胞相比,该细胞对NK-92细胞杀伤的敏感性显著降低,效靶比10∶1时下降了约30%。结论:促炎性细胞因子IL-1β能够显著增强肝癌细胞对NK细胞杀伤的抵抗性,可能是导致肝癌细胞发生天然免疫逃逸的重要机制。 展开更多

关键词 IL-1Β 肝癌细胞 NK细胞 天然免疫逃逸 促炎性细胞因子

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颗粒蛋白前体调控胃癌细胞增殖与衰老的效应研究 被引量：3

11

作者 李媛媛 王红艳 +2 位作者 吴晓燕 宋瑞卉 李敬 《中国癌症杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第3期173-178,共6页

背景与目的:颗粒蛋白前体(progranulin,PGRN)是一种新型生长因子,在细胞迁移、细胞周期进展及肿瘤形成过程中发挥着重要作用。PGRN在多种恶性肿瘤细胞中高表达,不仅参与肿瘤的生长过程,还与肿瘤的发生、演变过程关系密切。本研究旨在探... 背景与目的:颗粒蛋白前体(progranulin,PGRN)是一种新型生长因子,在细胞迁移、细胞周期进展及肿瘤形成过程中发挥着重要作用。PGRN在多种恶性肿瘤细胞中高表达,不仅参与肿瘤的生长过程,还与肿瘤的发生、演变过程关系密切。本研究旨在探讨PGRN在胃癌组织中的表达,及其对胃癌BGC823细胞增殖与衰老的影响。方法:利用免疫组化方法检测胃癌组织及癌旁组织中PGRN的表达;利用实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)干扰胃癌细胞株BGC823中PGRN的表达;通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法、细胞克隆形成和细胞衰老检测实验,探讨PGRN对BGC823细胞增殖与衰老的影响。结果:PGRN在胃癌组织中高表达。PGRN表达降低后,胃癌细胞的增殖与克隆形成能力均显著降低。PGRN-siRNA细胞的克隆形成率为(25.3±3.1)%,对照组细胞的克隆形成率为(72.1±5.7)%,正常组细胞的克隆形成率为(80.3±4.0)%。两两比较,对照组与正常组间差异无统计学意义(P>0.05),实验组与其他两组间差异均有统计学意义(P均<0.05)。干扰PGRN表达能够明显促进BGC823细胞衰老。PGRN-siRNA细胞衰老阳性率为(27.6±2.1)%,对照组细胞衰老阳性率为(3.2±1.3)%,正常组细胞衰老阳性率为(1.9±1.2)%。两两比较,对照组与正常组间差异无统计学意义(P>0.05),实验组与其他两组间差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论:PGRN可作为新的胃癌标志物,为临床胃癌的靶向治疗提供新的思路。 展开更多

关键词 胃肿瘤 颗粒蛋白前体 SIRNA 细胞衰老

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小鼠OX40稳定表达细胞株的构建及其对B细胞促分化作用的研究 被引量：2

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作者 原江水 冯永堂 +4 位作者 王菲 宫伟雁 邸大琳 任杰 苗乃法 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第6期767-770,共4页

目的:构建稳定表达小鼠OX40的细胞株HUVEC,并探讨其对B细胞的促增殖作用。方法:从ConA活化的小鼠胸腺淋巴细胞中提取总RNA,应用RT-PCR法扩增小鼠OX40的cDNA,并将其克隆到pUCm-T载体中,经PCR、酶切和测序分析,进而构建pIRES2-EGFP-OX40... 目的:构建稳定表达小鼠OX40的细胞株HUVEC,并探讨其对B细胞的促增殖作用。方法:从ConA活化的小鼠胸腺淋巴细胞中提取总RNA,应用RT-PCR法扩增小鼠OX40的cDNA,并将其克隆到pUCm-T载体中,经PCR、酶切和测序分析,进而构建pIRES2-EGFP-OX40重组真核表达载体。以脂质体法转染HUVEC,经G418筛选后,用流式细胞术检测OX40分子的表达。采用3H-TdR掺入法,研究OX40信号对体外培养的B细胞的促分化作用。结果:构建了OX40基因的真核表达载体。经PCR、酶切和测序证实,插入的目的片段与GenBank登录的小鼠OX40cDNA序列完全一致。用G418筛选后,获得能稳定表达小鼠OX40蛋白的HUVEC细胞。3H-TdR掺入法结果显示,小鼠OX40稳定表达的细胞HUVEC对体外培养的B细胞具有促增殖、分化的作用。OX40/OX40L信号与CD40/CD40L信号具有协同作用。结论:成功地构建小鼠OX40稳定表达地细胞,OX40对B细胞具有促增殖、分化作用。 展开更多

关键词 OX40 绿荧光蛋白表达载体 稳定表达 增殖

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抗人骨桥蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 被引量：5

13

作者 周群芳 鞠吉雨 郎景和 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第1期62-64,共3页

目的:制备抗人骨桥蛋白(hOPN)的单克隆抗体(mAb),用于其功能研究。方法:构建OPN的原核表达载体pTriEx-1-hONP载体,转化Tuner(DE3)placI感受态大肠杆菌,用IPTG进行诱导表达。利用镍柱亲和层析纯化OPN蛋白,纯化蛋白经超滤浓缩洗涤后即为... 目的:制备抗人骨桥蛋白(hOPN)的单克隆抗体(mAb),用于其功能研究。方法:构建OPN的原核表达载体pTriEx-1-hONP载体,转化Tuner(DE3)placI感受态大肠杆菌,用IPTG进行诱导表达。利用镍柱亲和层析纯化OPN蛋白,纯化蛋白经超滤浓缩洗涤后即为免疫原。以重组纯化的OPN蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠的骨髓瘤细胞Sp2/0进行常规融合,通过有限稀释法进行克隆和间接ELISA筛选,获得分泌鼠抗人OPN蛋白mAb的杂交瘤细胞株,通过ELISA、Western blot等方法检测其特异性,并用免疫组化方法检测了正常月经周期子宫内膜OPN的表达。结果:pTriEx-1-hONP表达的OPN蛋白主要为可溶性形式,经镍柱纯化后,蛋白纯度可达85%以上。纯化的OPN重组蛋白免疫小鼠后经融合筛选,得到2株稳定分泌抗人OPN的mAb杂交瘤细胞株,分别命名为1E7和5B7,两株mAb的免疫球蛋白亚类分别IgG1和IgG2a。通过ELISA和Western blot等方法鉴定,抗OPN的mAb能与OPN蛋白特异性结合。通过免疫组织化学方法对不同时期的正常子宫内膜的OPN的检测表明,子宫内膜腺上皮在增生期、分泌早期,OPN呈弱阳性表达;分泌中、晚期OPN呈强阳性表达。结论:以纯化的重组hOPN为免疫原成功制备了鼠抗hOPN的mAb,并初步进行了应用,为研究hOPN的功能打下了良好基础。 展开更多

关键词 骨桥蛋白 原核表达 单克隆抗体

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IL-1β对Hepa1-6细胞增殖、迁移及IFN应答的影响 被引量：1

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作者 林志娟 梁淑娟 +2 位作者 王焕芹 李艳平 肖伟玲 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第2期139-142,共4页

目的:构建应用于小鼠肝脏内表达和研究的IL-1β肝癌细胞特异性表达载体,观察其对小鼠Hepa1-6细胞体外增殖活性、迁移能力及干扰素增殖抑制效应等体外生物学行为的影响。方法:由C57BL/6小鼠腹腔液巨噬细胞扩增IL-1β基因,构建肝脏特异性p... 目的:构建应用于小鼠肝脏内表达和研究的IL-1β肝癌细胞特异性表达载体,观察其对小鼠Hepa1-6细胞体外增殖活性、迁移能力及干扰素增殖抑制效应等体外生物学行为的影响。方法:由C57BL/6小鼠腹腔液巨噬细胞扩增IL-1β基因,构建肝脏特异性pLIVE-IL-1β重组表达载体。利用transIT-LT1将鉴定后的pLIVE-IL-1β转染至Hepa1-6肝癌细胞,RT-PCR及双抗体夹心ELISA法分析转染前后IL-1表达水平,MTT法分析IL-1对细胞体外增殖活性的影响;利用细胞划痕实验分析对其迁移能力的影响,并确定对IFN-α诱导的细胞增殖抑制效应的作用。结果:重组载体经限制性酶谱分析酶解出822bp的条带,其序列与GenBank登录的小鼠IL-1β基因一致;转染后的Hepa1-6细胞培养上清中IL-1β的表达明显增高,细胞体外增殖速度明显加快;给予IFN-α作用后,IL-1β的表达使细胞对干扰素的抵抗性明显增强。结论:小鼠IL-1β肝癌组织特异性表达载体pLIVE-IL-1β能够在小鼠肝癌细胞中高效表达IL-1β,并能够显著促进肿瘤的体外增殖和迁移能力,削弱IFN-α对Hepa1-6细胞的增殖抑制作用。 展开更多

关键词 IL-1Β 肝癌 NK细胞 促炎性细胞因子 干扰素

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带有人红细胞生成素信号肽序列的IL-1β基因在HepG2细胞中的表达 被引量：1

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作者 李娜 邸大琳 +2 位作者 肖伟玲 付晓燕 梁淑娟 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第5期493-496,共4页

目的构建由经典分泌途径和非经典途径表达人IL-1β的慢病毒载体,制备慢病毒后,感染HepG2肝癌细胞,比较肝癌细胞中IL-1β表达的水平。方法分别以表达人IL-1β前体蛋白基因和人红细胞生成素(EPO)信号肽序列与IL-1β成熟蛋白融合基因的pIRE... 目的构建由经典分泌途径和非经典途径表达人IL-1β的慢病毒载体,制备慢病毒后,感染HepG2肝癌细胞,比较肝癌细胞中IL-1β表达的水平。方法分别以表达人IL-1β前体蛋白基因和人红细胞生成素(EPO)信号肽序列与IL-1β成熟蛋白融合基因的pIRES2-EGFP-proIL-1β和pIRES2-EGFP-epoIL-1β质粒为模板,PCR扩增获得人IL-1β全长基因和含有EPO信号肽与IL-1β成熟蛋白融合基因的序列,将其分别克隆入pLenti6/V5慢病毒载体中,构建由非经典途径和经典途径分泌IL-1β的pLenti6/V5-proIL-1β和pLenti6/V5-epoIL-1β慢病毒表达载体。利用三质粒包装体系在HEK293T细胞中包装生产慢病毒,随后感染HepG2肝癌细胞,双抗体夹心ELISA和Western blot法检测细胞质和培养上清中IL-1β的表达水平。结果构建了含有人IL-1β全长基因和含有EPO信号肽与IL-1β成熟蛋白融合基因的pLenti6/V5-proIL-1β和pLenti6/V5-epoIL-1β慢病毒载体,经双酶切和DNA测序证实与基因库中登录的人IL-1β以及EPO信号肽序列一致。利用三质粒系统包装制备经不同途径表达IL-1β的慢病毒,研究证实经由2条不同途径分泌表达人IL-1β的慢病毒感染HepG2细胞后,与转染空载体的对照细胞相比,细胞培养液上清和胞质中IL-1β的水平均显著升高(P<0.01),其中HepG2/epoIL-1β细胞培养液上清中成熟蛋白IL-1β的水平明显高于HepG2/proIL-1β细胞,而胞质中总IL-1β的水平HepG2/proIL-1β高于HepG2/epoIL-1β。结论构建的带有EPO信号肽序列的IL-1β基因的慢病毒载体,在HepG2细胞表达后,分泌成熟IL-1β的水平明显高于非经典途径分泌的表达载体。 展开更多

关键词 慢病毒 人IL-1β HEPG2细胞 经典和非经典分泌途径

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IL-21在肝癌细胞株H22细胞中的表达及其活性 被引量：1

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作者 王丽娜 鞠吉雨 +4 位作者 梁淑娟 牟东珍 邸大琳 孙萍 苗乃法 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 北大核心 2010年第2期174-178,共5页

目的:构建小鼠IL-21(mIL-21)真核表达载体mIL-21-pcDNA3.1,转染肝癌H22细胞,探讨其生物学活性。方法:RT-PCR法扩增mIL-21基因,构建mIL-21真核表达载体mIL-21-pcDNA3.1,并经DNA测序证实。脂质体法介导mIL-21-pcDNA3.1转染H22细胞,RT-PCR... 目的:构建小鼠IL-21(mIL-21)真核表达载体mIL-21-pcDNA3.1,转染肝癌H22细胞,探讨其生物学活性。方法:RT-PCR法扩增mIL-21基因,构建mIL-21真核表达载体mIL-21-pcDNA3.1,并经DNA测序证实。脂质体法介导mIL-21-pcDNA3.1转染H22细胞,RT-PCR和Western boltting鉴定其表达,MTT法检测mIL-21-pcDNA3.1对T细胞增殖和NK细胞杀伤活性的影响。结果:DNA序列分析证实构建的mIL-21-pcDNA3.1正确无误,RT-PCR和Western boltting证实转染的H22细胞中有mIL-21的表达。MTT法显示,转染mIL-21的H22细胞培养上清刺激T细胞增殖的刺激指数(stimulation index,SI)为3.412±0.312,联合ConA的刺激指数为4.673±0.450,均显著高于转染空质粒组的1.465±0.103和未转染组的1.447±0.245,(P<0.01)。转染mIL-21的H22细胞培养上清NK细胞杀伤率为(81.66±4.26)%,显著高于转染空质粒组的(34.74±5.52)%和未转染对照组的(33.61±1.42)%。结论:mIL-21-pcDNA3.1载体在H22细胞中的表达可显著增强T细胞增殖及NK细胞的杀伤功能,为其在抗肝癌治疗中的应用奠定了基础。 展开更多

关键词 肝肿瘤 mIL-21基因 H22细胞株 真核表达

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小鼠分泌型IL-1β真核表达载体的构建及其表达

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作者 肖伟玲 王雪净 +3 位作者 牟东珍 林志娟 王焕芹 梁淑娟 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第7期744-746,共3页

目的:构建小鼠经典分泌途径IL-1β真核表达载体,转染至Hepa1-6细胞,并测定其分泌表达水平。方法:引物延伸获得小鼠AFP信号肽序列(sAFP),RT-PCR扩增获得小鼠IL-1β成熟蛋白基因序列(mIL-1β),SOE方法将两段序列拼接形成融合基因,与pIRES2... 目的:构建小鼠经典分泌途径IL-1β真核表达载体,转染至Hepa1-6细胞,并测定其分泌表达水平。方法:引物延伸获得小鼠AFP信号肽序列(sAFP),RT-PCR扩增获得小鼠IL-1β成熟蛋白基因序列(mIL-1β),SOE方法将两段序列拼接形成融合基因,与pIRES2-EGFP质粒重组构建分泌型真核表达载体pIRES2-EGFP-smIL-1β,并将其转染至Hepa1-6细胞,RT-PCR检测融合基因的表达水平,Western blot检测细胞内mIL-1β蛋白的表达,ELISA法测定培养上清及细胞裂解液中mIL-1β水平。结果:经SOE法拼接获得的融合基因与GenBank中登录的序列一致,RT-PCR检测显示该载体能够在Hepa1-6细胞中表达融合基因mRNA,细胞培养上清中mIL-1β的分泌水平明显上升,而胞质中的mIL-1β无明显变化。结论:成功地构建了经典途径分泌的mIL-1β重组表达载体,该载体可以在Hepa1-6细胞培养上清中有效分泌具有生物活性的mIL-1β。 展开更多

关键词 鼠白细胞介素1β 信号肽 分泌表达 肝癌细胞

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IL-1β反义RNA在HepG2细胞的表达及对NK细胞杀伤活性的影响

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作者 梁淑娟 肖伟玲 +2 位作者 牟东珍 吴慧娜 王雪净 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第8期719-722,共4页

目的:构建IL-1β反义RNA真核表达载体,转染HepG2细胞,探讨阻断IL-1β作用后对其NK细胞杀伤敏感性的作用。方法:RT-PCR方法扩增两段基因序列IL-1β1(17-331,315bp)和IL-1β2(246-505,260bp),经T-A克隆后构建反义RNA表达载体pcDNA3.0-anti... 目的:构建IL-1β反义RNA真核表达载体,转染HepG2细胞,探讨阻断IL-1β作用后对其NK细胞杀伤敏感性的作用。方法:RT-PCR方法扩增两段基因序列IL-1β1(17-331,315bp)和IL-1β2(246-505,260bp),经T-A克隆后构建反义RNA表达载体pcDNA3.0-antiIL1β1和pcDNA3.0-anti-IL1β2。采用阳离子聚合物(jetPEI)的方法转染HepG2肝癌细胞,RT-PCR方法检测反义RNA的表达水平,胞内因子染色的方法分析IL-1的表达水平,MTT方法分析NK-92细胞对HepG2杀伤活性的变化。结果:以LPS刺激的人PBMC总RNA为模板,RT-PCR扩增得到两个约315bp和260bp的基因片段,先构建克隆载体pMD18T-IL-1β1和pMD18T-IL-1β2,质粒PCR、XhoI酶切和DNA序列分析正确后,利用PfuDNA聚合酶进行PCR,产物纯化后经EcoRI、XhoI双酶切,反向插入pcDNA3.0,获得人IL-1β反义RNA真核表达载体pcDNA3.0-antiIL-1β1和pcDNA3.0-antiIL-1β2。PCR、PstI酶切和DNA序列分析正确后,将其分别转染HepG2细胞,RT-PCR检测显示HepG2细胞能够高水平表达两种反义RNA,胞内因子染色发现IL-1β的表达水平明显下降,同时该细胞对NK-92杀伤的敏感性明显升高,其中IL-1β1反义RNA的作用更为显著,效靶比10∶1时,NK细胞对HepG2的杀伤活性提高了约20%。结论:以促炎性细胞因子IL-1β为靶点进行干预,能够有效地下调肝癌细胞对NK细胞杀伤的抵抗能力。 展开更多

关键词 肝癌细胞 IL-1Β 反义RNA NK细胞 天然免疫

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分泌型小鼠IL-1β表达载体促进Hepa1-6肝癌细胞的增殖和迁移 被引量：2

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作者 田叶 林志娟 +3 位作者 孙萍 刘艳菲 鞠吉雨 梁淑娟 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第5期488-491,共4页

目的:构建小鼠经典途径分泌型IL-1β真核表达载体,转染Hepa1-6细胞后,检测胞质及上清中IL-1β分泌表达水平,并考察其对肝癌细胞体外增殖活性、迁移能力的影响。方法:利用特异性上下游引物将小鼠AFP信号肽序列和小鼠IL-1β成熟蛋白编码... 目的:构建小鼠经典途径分泌型IL-1β真核表达载体,转染Hepa1-6细胞后,检测胞质及上清中IL-1β分泌表达水平,并考察其对肝癌细胞体外增殖活性、迁移能力的影响。方法:利用特异性上下游引物将小鼠AFP信号肽序列和小鼠IL-1β成熟蛋白编码基因进行拼接后,再与pLIVETM载体进行连接,DNA测序鉴定阳性克隆;jetPEI法将重组载体、pLIVETM空载体、pLIVE-lacZ转染小鼠肝癌细胞株Hepa1-6后,经β-gal染色监测转染效率;各转染组经LPS及monesin处理后双抗体夹心ELISA法分析细胞培养上清及细胞裂解液中IL-1β的表达水平;通过MTT方法分析经典途径分泌型IL-1β对细胞体外增殖活性的影响。结果:成功构建出了小鼠分泌型IL-1β真核重组表达载体pLIVE-smIL-1β;β-gal染色后,显示外源基因在3 d左右时转染效率最高;双抗体夹心ELISA法表明转染后与Hepa1-6/mock组细胞相比,Hepa1-6/smIL-1β组细胞胞质和上清中IL-1β的表达明显增高;MTT及细胞迁移实验分析证实,转染Hepa1-6/smIL-1β组细胞体外增殖速度明显加快。结论:该表达载体可以通过经典途径分泌促炎性因子IL-1β且高效表达成熟肽IL-1β,并能够显著促进肿瘤细胞的体外增殖和迁移能力。 展开更多

关键词 IL-1Β 肝癌细胞 信号肽 经典分泌途径 迁移

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敲低肝癌细胞STAT3抑制IFN1诱导的HepG2肝癌细胞增殖和迁移 被引量：2

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作者 李潇芳 王玉琦 +5 位作者 闫奔 房佩佩 马超 徐宁 付晓燕 梁淑娟 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2018年第2期115-122,共8页

目的筛选并制备信号转导子与转录激活子3短发夹RNA(STAT3 shRNA)慢病毒,感染Hep G2肝癌细胞抑制其STAT3表达,观察对1型干扰素(IFN1)诱导的肝癌细胞增殖和迁移的影响及机制。方法设计并合成4段人STAT3基因的干扰序列(STAT3 shRNA 1~STAT3... 目的筛选并制备信号转导子与转录激活子3短发夹RNA(STAT3 shRNA)慢病毒,感染Hep G2肝癌细胞抑制其STAT3表达,观察对1型干扰素(IFN1)诱导的肝癌细胞增殖和迁移的影响及机制。方法设计并合成4段人STAT3基因的干扰序列(STAT3 shRNA 1~STAT3 shRNA 4)以及对照序列(Ctrl shRNA),与p LKO.1-sp6-pgk-GFP连接构建慢病毒表达载体,随后与骨架质粒ps PAX2、p MD2.G共转染HEK293T细胞制备慢病毒并感染Hep G2细胞。Western blot法检测STAT3的蛋白水平,筛选有效序列。敲低STAT3水平后,CCK-8法检测Hep G2细胞的增殖,TranswellTM迁移和划痕实验检测Hep G2细胞的迁移。同时观察2000 U/m L重组人IFNα2b诱导的肝癌细胞增殖、迁移能力的变化,Western blot法检测IFN相关STAT1信号的磷酸化水平。结果筛选对STAT3敲低效果最显著的STAT3 shRNA1和STAT3 shRNA2,敲低STAT3水平后,肝癌细胞增殖和迁移降低。2000 U/m L IFNα2b对细胞的增殖抑制作用更显著,迁移细胞的数量显著下降。敲低STAT3水平后,肝癌细胞STAT1的磷酸化水平升高,在IFNα2b处理后STAT1磷酸化水平进一步升高。结论敲低肝癌细胞STAT3通过上调STAT1信号通路活化,抑制细胞的迁移、增殖,恢复IFN在肝癌细胞中的应答。 展开更多

关键词 1型干扰素(IFN1) 信号转导子与转录激活子3短发夹RNA(STAT3 shRNA) STAT1 SHRNA 肝癌

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