目的获得能够过表达OPTN和TAU-P301-L基因的重组腺相关病毒,检测其在体外对293T细胞的感染,并且为阿尔茨海默氏病(AD)研究提供新思路。方法从含有目的基因的大肠杆菌中提取包涵目的基因的质粒,利用PCR扩增获得目的基因,目的基因OPTN构建...目的获得能够过表达OPTN和TAU-P301-L基因的重组腺相关病毒,检测其在体外对293T细胞的感染,并且为阿尔茨海默氏病(AD)研究提供新思路。方法从含有目的基因的大肠杆菌中提取包涵目的基因的质粒,利用PCR扩增获得目的基因,目的基因OPTN构建到pAAV-IRES-ZsGreen1载体,目的基因TAU-P301L-V5构建到pAAV-CMV-mkate-IRES载体。鉴定质粒阳性克隆并测序。重组质粒pAAV-IRES-ZsGreen1-AAV9-OPTN和pAAV-CMV-mkate-IRES-AAV9-TAU-P301L-V5分别与包装质粒pAAV-RC9、辅助质粒pHelper通过Lipofiter^(TM)2000共转染293T细胞,获得AAV9病毒。利用相同方法,不使用目的基因构建对应绿色和红色AAV9对照病毒。qPCR法测定重组腺相关病毒载体滴度,病毒载体感染293T细胞进行病毒有效性及安全性鉴定,Western blotting和RT-PCR进行蛋白表达的鉴定,MTT检测OPTN蛋白与TAU-P301-L蛋白对293T细胞活力的影响。结果测序结果显示成功构建pAAV-IRES-ZsGreen1-AAV9-OPTN和pAAV-CMV-mkate-IRES-AAV9-TAU-P301L-V5腺相关病毒载体,qPCR测得病毒滴度为1.0×10^(12) vg/ml,病毒载体感染293T细胞转染效率为33.6%和20.5%, Western blot和RT-PCR显示蛋白过量表达。MTT结果显示OPTN组挽救了TAU-P301-L组的细胞凋亡。结论成功构建过表达OPTN和TAU-P301-L基因的腺相关病毒。OPTN蛋白可以减弱TAU-P301-L蛋白的细胞毒性。展开更多
文摘胞浆磷蛋白1(stathmin 1,STMN1)是一种微管结合蛋白,可促进微管解聚或抑制微管组装,调控细胞骨架形成、细胞周期进程等过程。STMN1在多种肿瘤中表达上调,主要通过核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、铁死亡等经典途径促进肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移,以及血管生成等恶性行为。STMN1还可通过影响机体免疫细胞功能,干预抗肿瘤免疫。临床数据显示STMN1高表达与肿瘤耐药和预后不良呈正相关,提示STMN1有作为肿瘤生物标志物和治疗分子靶点的潜能,具有重要的临床意义。
文摘目的获得能够过表达OPTN和TAU-P301-L基因的重组腺相关病毒,检测其在体外对293T细胞的感染,并且为阿尔茨海默氏病(AD)研究提供新思路。方法从含有目的基因的大肠杆菌中提取包涵目的基因的质粒,利用PCR扩增获得目的基因,目的基因OPTN构建到pAAV-IRES-ZsGreen1载体,目的基因TAU-P301L-V5构建到pAAV-CMV-mkate-IRES载体。鉴定质粒阳性克隆并测序。重组质粒pAAV-IRES-ZsGreen1-AAV9-OPTN和pAAV-CMV-mkate-IRES-AAV9-TAU-P301L-V5分别与包装质粒pAAV-RC9、辅助质粒pHelper通过Lipofiter^(TM)2000共转染293T细胞,获得AAV9病毒。利用相同方法,不使用目的基因构建对应绿色和红色AAV9对照病毒。qPCR法测定重组腺相关病毒载体滴度,病毒载体感染293T细胞进行病毒有效性及安全性鉴定,Western blotting和RT-PCR进行蛋白表达的鉴定,MTT检测OPTN蛋白与TAU-P301-L蛋白对293T细胞活力的影响。结果测序结果显示成功构建pAAV-IRES-ZsGreen1-AAV9-OPTN和pAAV-CMV-mkate-IRES-AAV9-TAU-P301L-V5腺相关病毒载体,qPCR测得病毒滴度为1.0×10^(12) vg/ml,病毒载体感染293T细胞转染效率为33.6%和20.5%, Western blot和RT-PCR显示蛋白过量表达。MTT结果显示OPTN组挽救了TAU-P301-L组的细胞凋亡。结论成功构建过表达OPTN和TAU-P301-L基因的腺相关病毒。OPTN蛋白可以减弱TAU-P301-L蛋白的细胞毒性。
