目的头发是一类重要的皮肤附属物,主要由角蛋白和角蛋白相关蛋白等组成。不同种族及性别样本的头发蛋白质组成和占比存在差异,且目前缺乏高效率提取头发蛋白的方法。本文探究基于定量头发蛋白质组学方法,旨在探索该方法区分不同个体的...目的头发是一类重要的皮肤附属物,主要由角蛋白和角蛋白相关蛋白等组成。不同种族及性别样本的头发蛋白质组成和占比存在差异,且目前缺乏高效率提取头发蛋白的方法。本文探究基于定量头发蛋白质组学方法,旨在探索该方法区分不同个体的可能性。方法以3例头发样本,对样品处理方法和裂解缓冲液进行探究,发展一种名为PLEE(PTM lab for protein extraction from hair with high efficiency)的稳定、高效的头发蛋白质提取方法,对7例人发样本,以PLEE法进行提取,结合胶内消化方法进行蛋白质组学实验,产出蛋白质组学数据,分析个体间的头发蛋白质组成及占比。结果共鉴定274种蛋白质,共有的蛋白质107种,非共有蛋白质种类在57~119,部分样本存在独特鉴定蛋白。使用共鉴定107种蛋白质进行定量蛋白质组分析,通过聚类和主成分分析,可将各样本进行区分,且技术重复样本可聚在一起,表明流程的稳定性。另外,筛选出10个关键蛋白(KRT33A、KRTAP9-6、KRT83、KRTAP7-1、KRT32、BLMH、KRT38、KRTAP11-1、NPAS1、KRTAP4-3)在不同个体之间差异比较大且在同个体中蛋白质鉴定稳定。结论不同个体的头发蛋白质组成存在差异,筛选出的10个蛋白质有望作为区分个体特质的关键蛋白,在个体识别、刑侦方面具有重大的应用潜力。展开更多
目的建立一种针对微量样本(1×10^(4)细胞)的蛋白质组前处理流程,用于衰老小鼠单个窦卵泡的蛋白质组图谱绘制,并对窦卵泡的衰老图谱进行解析。方法利用293T细胞,通过对比不同的裂解液、酶切条件、超声处理方式等,建立针对1×10^...目的建立一种针对微量样本(1×10^(4)细胞)的蛋白质组前处理流程,用于衰老小鼠单个窦卵泡的蛋白质组图谱绘制,并对窦卵泡的衰老图谱进行解析。方法利用293T细胞,通过对比不同的裂解液、酶切条件、超声处理方式等,建立针对1×10^(4)数量级细胞样本(约1μg数量级蛋白质)的蛋白质组前处理流程。通过与商业化的样本前处理试剂盒(iST试剂盒和Ex极微量试剂盒)进行对比,从蛋白质和肽段鉴定重叠性、蛋白质整体亲/疏水性、蛋白质理论等电点以及蛋白质分子质量4方面对本研究所建立的样本前处理流程进行评估。以100,1000和100003种数量级小鼠原代脾和肝细胞样本对样本前处理流程的样本适用性进行评估。基于该样本前处理流程,结合timsTOF Pro 2超灵敏质谱仪,绘制青年(2月龄)、中年(12月龄)和老年(22月龄)小鼠的单个窦卵泡的蛋白质组图谱。通过差异表达蛋白质分析与蛋白质表达时间序列分析,寻找与年龄因素显著相关的蛋白质,解析窦卵泡的衰老图谱。结果本研究建立了一套针对1×10^(4)数量级细胞样本的蛋白质组学前处理流程,该流程仅需一步操作完成裂解和还原烷基化,酶切过程无需超声。即对于1×10^(4)数量级细胞样本,将裂解液中的脱氧胆酸钠浓度由1%提升至10%,可以使蛋白质平均鉴定种类从4089种增加到4389种,具有更佳的裂解效果(P<0.05);在裂解液中添加碳酸氢铵缓冲液(50 mmol·L^(-1),90μL),蛋白质平均鉴定种类从2579种显著提升至4389种(P<0.01);单胰蛋白酶与混合酶(Trypsin/Lys-C)具有相似的酶切效果,均能鉴定到约3950种蛋白质;将酶切时间由过夜缩短至0.5 h,蛋白质平均鉴定量由4299种提升至4632种(P<0.05),在节省时间的同时能获得更高的蛋白质鉴定量。与商业化试剂盒相比,本流程鉴定的蛋白质中约92.3%能被iST试剂盒或Ex极微量试剂盒鉴定,且在亲/疏水性、理论等电点和分子质量等理化性质上无明显偏向,显示出良好稳健性。随着样本中细胞数量增加,鉴定的蛋白质种类显著增加(100、1000和10000个细胞样本中,小鼠脾原代细胞分别鉴定到蛋白质525,1650和3210种,小鼠肝原代细胞分别鉴定到蛋白质366、1160和3590种,P<0.05)。采用该处理流程对青、中、老年小鼠的单个窦卵泡(每组3个窦卵泡)进行了蛋白质组鉴定,每个卵泡均可鉴定超过7500种蛋白质。基于该数据,本研究通过主成分分析发现,不同年龄阶段的窦卵泡在蛋白质表达状态上表现出明显差异,证实了年龄是影响卵泡生理状态的关键因素。此外,在衰老小鼠的卵泡中,发现与染色体分离相关的蛋白显著下调(P<0.01),提示衰老卵泡中可能存在染色体分离障碍以及减数分裂的失调。通过进一步分析,本研究共识别出739种与年龄显著相关的蛋白质,其中378种正相关,361种负相关。结论本研究为微量样本提供了一种低成本、易操作、高通量和高灵敏度的蛋白质组样本前处理流程;构建了不同年龄阶段小鼠单个窦卵泡的蛋白质组动态变化图谱,为卵泡衰老基础研究提供了高质量的数据资源,为探索卵巢衰老的潜在治疗靶标和促进生殖力提升的药物开发提供了新的研究思路。展开更多
核糖核酸(RNA)在细胞中并非单独存在,从它们产生到被降解的过程中与大量蛋白质发生相互作用,RNA结合蛋白(RNA-binding proteins,RBPs)能与RNA结合形成RNA-蛋白质复合物(RP复合物),并以这种复合物的形式发挥生理功能。RNAs或RBPs任一组...核糖核酸(RNA)在细胞中并非单独存在,从它们产生到被降解的过程中与大量蛋白质发生相互作用,RNA结合蛋白(RNA-binding proteins,RBPs)能与RNA结合形成RNA-蛋白质复合物(RP复合物),并以这种复合物的形式发挥生理功能。RNAs或RBPs任一组分的异常与缺失都会影响RP复合物的正常生理功能,从而导致疾病的发生,如代谢异常、肌肉萎缩症、自身免疫性疾病和癌症。因此,定性定量分析RBPs及其在正常细胞和肿瘤细胞中与RNAs靶标之间的复杂相互作用网络有助于挖掘RP复合物在肿瘤发生发展中的作用,开发肿瘤生物标志物和新的治疗方式。要深入研究和理解RNAs与RBPs的相互作用网络,须依赖组学技术对RP复合物进行大规模鉴定。而作为在组学层面系统性解析RP复合物组成、含量和功能的第一步,大规模富集RP复合物极具挑战性。为了解决这一难题,研究者们发展了各种富集鉴定策略。该文针对RP复合物富集策略的最新进展进行了综述,包括紫外光交联和免疫沉淀(crosslinking and immunoprecipitation,CLIP)及其衍生技术、基于“点击化学”的富集策略和基于相分离的富集策略,比较分析了它们的技术原理、优缺点,以方便研究者们选择合适的策略来解决感兴趣的生物学问题。该文最后总结了当前的RP复合物富集方法仍然存在富集效率低和操作繁琐等亟需解决的技术挑战,为富集策略的发展提供了研究方向。展开更多
胆管癌是一种起病隐匿、侵袭性强、致死率高的原发性恶性肿瘤。多聚嘧啶区结合蛋白1(polypyrimidine tract-binding protein 1,PTBP1)已被报道,在多种类型肿瘤组织中异常高表达并参与癌症进展,但其在胆管癌中的作用仍未见报道。该研究...胆管癌是一种起病隐匿、侵袭性强、致死率高的原发性恶性肿瘤。多聚嘧啶区结合蛋白1(polypyrimidine tract-binding protein 1,PTBP1)已被报道,在多种类型肿瘤组织中异常高表达并参与癌症进展,但其在胆管癌中的作用仍未见报道。该研究旨在探讨PTBP1在胆管癌中的生物学功能,并初步解析其分子机制。本文利用公开的癌症基因组图谱(the cancer genome atlas,TCGA)数据,分析了胆管癌及癌旁组织中的PTBP1 mRNA表达水平。结果显示,PTBP1在胆管癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织(P<0.05)。随后,在胆管癌细胞系RBE和HuH28中,通过CCK-8和细胞平板克隆实验,评价了PTBP1对胆管癌细胞生长能力的影响。结果显示,过表达PTBP1可显著促进胆管癌细胞的生长(P<0.01),而敲低PTBP1显著抑制胆管癌细胞的生长(P<0.001)。Transwell和Invasion实验结果显示,过表达PTBP1可显著促进胆管癌细胞的迁移和侵袭(P<0.001),而敲低PTBP1显著抑制胆管癌细胞的迁移和侵袭(P<0.001)。转录物组测序和通路富集分析结果显示,在胆管癌细胞中,敲低PTBP1后上调表达的基因显著富集于p53信号通路;而下调表达的基因显著富集于胆固醇代谢、Rho GTPase和TGF-β等信号通路。基于上述转录物组测序数据,本文还分析发现,敲低PTBP1可导致一系列基因发生异常的mRNA可变剪接事件,例如参与TGF-β调控的TGIF1及与p53活性相关的GNAS基因等。综上所述,PTBP1可能通过调控一系列基因的可变剪接而影响多个癌症相关的信号通路,从而促进胆管癌的进展。展开更多
文摘目的头发是一类重要的皮肤附属物,主要由角蛋白和角蛋白相关蛋白等组成。不同种族及性别样本的头发蛋白质组成和占比存在差异,且目前缺乏高效率提取头发蛋白的方法。本文探究基于定量头发蛋白质组学方法,旨在探索该方法区分不同个体的可能性。方法以3例头发样本,对样品处理方法和裂解缓冲液进行探究,发展一种名为PLEE(PTM lab for protein extraction from hair with high efficiency)的稳定、高效的头发蛋白质提取方法,对7例人发样本,以PLEE法进行提取,结合胶内消化方法进行蛋白质组学实验,产出蛋白质组学数据,分析个体间的头发蛋白质组成及占比。结果共鉴定274种蛋白质,共有的蛋白质107种,非共有蛋白质种类在57~119,部分样本存在独特鉴定蛋白。使用共鉴定107种蛋白质进行定量蛋白质组分析,通过聚类和主成分分析,可将各样本进行区分,且技术重复样本可聚在一起,表明流程的稳定性。另外,筛选出10个关键蛋白(KRT33A、KRTAP9-6、KRT83、KRTAP7-1、KRT32、BLMH、KRT38、KRTAP11-1、NPAS1、KRTAP4-3)在不同个体之间差异比较大且在同个体中蛋白质鉴定稳定。结论不同个体的头发蛋白质组成存在差异,筛选出的10个蛋白质有望作为区分个体特质的关键蛋白,在个体识别、刑侦方面具有重大的应用潜力。
文摘目的建立一种针对微量样本(1×10^(4)细胞)的蛋白质组前处理流程,用于衰老小鼠单个窦卵泡的蛋白质组图谱绘制,并对窦卵泡的衰老图谱进行解析。方法利用293T细胞,通过对比不同的裂解液、酶切条件、超声处理方式等,建立针对1×10^(4)数量级细胞样本(约1μg数量级蛋白质)的蛋白质组前处理流程。通过与商业化的样本前处理试剂盒(iST试剂盒和Ex极微量试剂盒)进行对比,从蛋白质和肽段鉴定重叠性、蛋白质整体亲/疏水性、蛋白质理论等电点以及蛋白质分子质量4方面对本研究所建立的样本前处理流程进行评估。以100,1000和100003种数量级小鼠原代脾和肝细胞样本对样本前处理流程的样本适用性进行评估。基于该样本前处理流程,结合timsTOF Pro 2超灵敏质谱仪,绘制青年(2月龄)、中年(12月龄)和老年(22月龄)小鼠的单个窦卵泡的蛋白质组图谱。通过差异表达蛋白质分析与蛋白质表达时间序列分析,寻找与年龄因素显著相关的蛋白质,解析窦卵泡的衰老图谱。结果本研究建立了一套针对1×10^(4)数量级细胞样本的蛋白质组学前处理流程,该流程仅需一步操作完成裂解和还原烷基化,酶切过程无需超声。即对于1×10^(4)数量级细胞样本,将裂解液中的脱氧胆酸钠浓度由1%提升至10%,可以使蛋白质平均鉴定种类从4089种增加到4389种,具有更佳的裂解效果(P<0.05);在裂解液中添加碳酸氢铵缓冲液(50 mmol·L^(-1),90μL),蛋白质平均鉴定种类从2579种显著提升至4389种(P<0.01);单胰蛋白酶与混合酶(Trypsin/Lys-C)具有相似的酶切效果,均能鉴定到约3950种蛋白质;将酶切时间由过夜缩短至0.5 h,蛋白质平均鉴定量由4299种提升至4632种(P<0.05),在节省时间的同时能获得更高的蛋白质鉴定量。与商业化试剂盒相比,本流程鉴定的蛋白质中约92.3%能被iST试剂盒或Ex极微量试剂盒鉴定,且在亲/疏水性、理论等电点和分子质量等理化性质上无明显偏向,显示出良好稳健性。随着样本中细胞数量增加,鉴定的蛋白质种类显著增加(100、1000和10000个细胞样本中,小鼠脾原代细胞分别鉴定到蛋白质525,1650和3210种,小鼠肝原代细胞分别鉴定到蛋白质366、1160和3590种,P<0.05)。采用该处理流程对青、中、老年小鼠的单个窦卵泡(每组3个窦卵泡)进行了蛋白质组鉴定,每个卵泡均可鉴定超过7500种蛋白质。基于该数据,本研究通过主成分分析发现,不同年龄阶段的窦卵泡在蛋白质表达状态上表现出明显差异,证实了年龄是影响卵泡生理状态的关键因素。此外,在衰老小鼠的卵泡中,发现与染色体分离相关的蛋白显著下调(P<0.01),提示衰老卵泡中可能存在染色体分离障碍以及减数分裂的失调。通过进一步分析,本研究共识别出739种与年龄显著相关的蛋白质,其中378种正相关,361种负相关。结论本研究为微量样本提供了一种低成本、易操作、高通量和高灵敏度的蛋白质组样本前处理流程;构建了不同年龄阶段小鼠单个窦卵泡的蛋白质组动态变化图谱,为卵泡衰老基础研究提供了高质量的数据资源,为探索卵巢衰老的潜在治疗靶标和促进生殖力提升的药物开发提供了新的研究思路。
文摘核糖核酸(RNA)在细胞中并非单独存在,从它们产生到被降解的过程中与大量蛋白质发生相互作用,RNA结合蛋白(RNA-binding proteins,RBPs)能与RNA结合形成RNA-蛋白质复合物(RP复合物),并以这种复合物的形式发挥生理功能。RNAs或RBPs任一组分的异常与缺失都会影响RP复合物的正常生理功能,从而导致疾病的发生,如代谢异常、肌肉萎缩症、自身免疫性疾病和癌症。因此,定性定量分析RBPs及其在正常细胞和肿瘤细胞中与RNAs靶标之间的复杂相互作用网络有助于挖掘RP复合物在肿瘤发生发展中的作用,开发肿瘤生物标志物和新的治疗方式。要深入研究和理解RNAs与RBPs的相互作用网络,须依赖组学技术对RP复合物进行大规模鉴定。而作为在组学层面系统性解析RP复合物组成、含量和功能的第一步,大规模富集RP复合物极具挑战性。为了解决这一难题,研究者们发展了各种富集鉴定策略。该文针对RP复合物富集策略的最新进展进行了综述,包括紫外光交联和免疫沉淀(crosslinking and immunoprecipitation,CLIP)及其衍生技术、基于“点击化学”的富集策略和基于相分离的富集策略,比较分析了它们的技术原理、优缺点,以方便研究者们选择合适的策略来解决感兴趣的生物学问题。该文最后总结了当前的RP复合物富集方法仍然存在富集效率低和操作繁琐等亟需解决的技术挑战,为富集策略的发展提供了研究方向。
文摘胆管癌是一种起病隐匿、侵袭性强、致死率高的原发性恶性肿瘤。多聚嘧啶区结合蛋白1(polypyrimidine tract-binding protein 1,PTBP1)已被报道,在多种类型肿瘤组织中异常高表达并参与癌症进展,但其在胆管癌中的作用仍未见报道。该研究旨在探讨PTBP1在胆管癌中的生物学功能,并初步解析其分子机制。本文利用公开的癌症基因组图谱(the cancer genome atlas,TCGA)数据,分析了胆管癌及癌旁组织中的PTBP1 mRNA表达水平。结果显示,PTBP1在胆管癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织(P<0.05)。随后,在胆管癌细胞系RBE和HuH28中,通过CCK-8和细胞平板克隆实验,评价了PTBP1对胆管癌细胞生长能力的影响。结果显示,过表达PTBP1可显著促进胆管癌细胞的生长(P<0.01),而敲低PTBP1显著抑制胆管癌细胞的生长(P<0.001)。Transwell和Invasion实验结果显示,过表达PTBP1可显著促进胆管癌细胞的迁移和侵袭(P<0.001),而敲低PTBP1显著抑制胆管癌细胞的迁移和侵袭(P<0.001)。转录物组测序和通路富集分析结果显示,在胆管癌细胞中,敲低PTBP1后上调表达的基因显著富集于p53信号通路;而下调表达的基因显著富集于胆固醇代谢、Rho GTPase和TGF-β等信号通路。基于上述转录物组测序数据,本文还分析发现,敲低PTBP1可导致一系列基因发生异常的mRNA可变剪接事件,例如参与TGF-β调控的TGIF1及与p53活性相关的GNAS基因等。综上所述,PTBP1可能通过调控一系列基因的可变剪接而影响多个癌症相关的信号通路,从而促进胆管癌的进展。
