江苏省2010年O1群霍乱疫情分离株病原学特征分析 被引量：4

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作者 董晨 张雪峰 +6 位作者 谈忠鸣 钱慧敏 顾玲 刘文东 崔志刚 汤奋扬 朱叶飞 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2015年第9期1317-1323,共7页

目的 :分析2010年江苏省O1群霍乱疫情分离株病原学特征,为霍乱疫情分析及临床治疗提供实验室依据。方法 :对2010年江苏省O1群霍乱疫情分离株进行毒力基因检测、ctx B基因序列分析、抗生素敏感性实验、脉冲场凝胶电泳分子分型分析。结果:... 目的 :分析2010年江苏省O1群霍乱疫情分离株病原学特征,为霍乱疫情分析及临床治疗提供实验室依据。方法 :对2010年江苏省O1群霍乱疫情分离株进行毒力基因检测、ctx B基因序列分析、抗生素敏感性实验、脉冲场凝胶电泳分子分型分析。结果:2010年江苏省O1群霍乱疫情分离株均携带毒力基因ctx A、ace、zot、tox R、tcp I、omp U、rtx C、tcp AEL、hly AEL,且CTXB氨基酸序列为古典型;对庆大霉素、诺氟沙星、环丙沙星100%敏感,对复方新诺明、链霉素100%耐药,且均为多重耐药株;除VC201014外,其余14株菌脉冲场凝胶电泳图谱相似度达100%。结论:2010年9月初至10月初,发生在江苏省徐州、淮安、宿迁、南京4个地市的O1群霍乱疫情可能是有关联的暴发流行,2010年8月底发生在连云港的O1群霍乱疫情是一起散发疫情,与上述四地的霍乱疫情可能没有流行病学关联,所有疫情的病原均为非典型埃尔托型霍乱弧菌,庆大霉素、诺氟沙星、环丙沙星可作为临床治疗的首选药物。 展开更多

关键词 非典型埃尔托霍乱弧菌 毒力基因 耐药性 CTX B 脉冲场凝胶电泳

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2008-2009年江苏省肠道病毒71型分子流行病学研究 被引量：4

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作者 单军 李显 +5 位作者 唐震 郭喜玲 赵康辰 崔仑标 葛以跃 史智扬 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第10期979-981,985,共4页

目的探讨2008-2009年江苏省肠道病毒71型（EV71）分离株的病毒基因特征。方法选取18份EV71分离株,用一对特异引物进行VP1全基因核苷酸序列扩增,在ABI3130型自动测序仪上测序,序列结果用DNA Star和MEGA4软件进行分析,并与各型参考株进行... 目的探讨2008-2009年江苏省肠道病毒71型（EV71）分离株的病毒基因特征。方法选取18份EV71分离株,用一对特异引物进行VP1全基因核苷酸序列扩增,在ABI3130型自动测序仪上测序,序列结果用DNA Star和MEGA4软件进行分析,并与各型参考株进行比较。结果 18株病毒与安徽省阜阳市和山东省临沂市分离的C4a基因型参考株最为相近,核苷酸同源性在96.3%~99.6%之间,氨基酸同源性在99.0%~99.7%之间;而与A、B基因型参考株比较差异较大,核苷酸同源性只在81.8%~84.4%之间,氨基酸同源性在94.3%~97.0%之间;说明本文的18株病毒均属于EV71型C4a基因型。结论 2008-2009年江苏省分离的18株EV71可能与安徽省和山东省分离的EV71有相同的起源,均属于C4a亚型;目前C4a亚型病毒在中国大陆可能有较广泛的分布和传播。 展开更多

关键词 EV71 基因型 分子流行病学

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一种基于NASBA技术的新型快速肠道病毒检测方法的应用研究 被引量：3

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作者 唐震 李显 +2 位作者 郭喜玲 吴涛 史智扬 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2010年第12期1729-1731,1759,共4页

目的:基于核酸等温扩增技术(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)荧光分子信标探针检测技术,进行肠道病毒的快速检测与辅助诊断。方法:根据Genebank上肠道病毒5′端非编码区序列,设计特异性引物与捕获探针,应用纳米技术... 目的:基于核酸等温扩增技术(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)荧光分子信标探针检测技术,进行肠道病毒的快速检测与辅助诊断。方法:根据Genebank上肠道病毒5′端非编码区序列,设计特异性引物与捕获探针,应用纳米技术对商品化磁珠进行偶联,NASBA方法进行扩增,NucliSens读数仪检测,荧光定量RT-PCR方法进行验证,同时验证NASBA方法的特异性、灵敏度和重复性。结果:该方法对肠道病毒具有高度特异性,与RSV等呼吸道相关病毒均无交叉反应,反应体系具有很高的稳定性。结论:本研究应用的肠道病毒NASBA检测方法特异、灵敏、快速简便,适用于肠道病毒的日常监测和爆发疫情的应急诊断。 展开更多

关键词 NASBA 磁珠 捕获探针 肠道病毒

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多重PCR结合核酸侵入反应及纳米金显色技术检测病毒性脑炎脑膜炎病原体 被引量：4

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作者 樊欢 戚宇华 +5 位作者 朱政 崔仑标 葛以跃 赵康程 吴涛 史智扬 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第11期991-995,1001,共6页

目的建立一种病毒性脑炎脑膜炎病原体多重PCR结合核酸侵入反应及纳米金显色的检测方法。方法针对几种重要的脑炎脑膜炎病毒(东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、流行性乙型脑炎病毒、西尼罗病毒和尼帕病毒)保守区基因设计引物,进行多重PC... 目的建立一种病毒性脑炎脑膜炎病原体多重PCR结合核酸侵入反应及纳米金显色的检测方法。方法针对几种重要的脑炎脑膜炎病毒(东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、流行性乙型脑炎病毒、西尼罗病毒和尼帕病毒)保守区基因设计引物,进行多重PCR反应、核酸侵入反应及纳米金显色反应,对多种脑炎脑膜炎病毒同时进行检测,以森林脑炎病毒、圣路易脑炎病毒、基孔肯雅病毒和登革病毒4种病原核酸评价其检测特异性,以体外转录的病毒RNA或扩增的PCR片段评价其检测敏感性,并对流行性乙型脑炎患者临床标本进行检测。结果成功建立了一种脑炎脑膜炎病毒多重PCR结合核酸侵入反应及纳米金显色的检测技术。建立的检测方法可特异的检测目的病原体,且与森林脑炎病毒、圣路易脑炎病毒、基孔肯雅病毒和登革病毒无交叉反应。该方法对不同靶标的检测灵敏度均为103拷贝/μL,临床标本检测结果均为阳性。结论建立的脑炎脑膜炎病毒多重PCR结合核酸侵入反应及纳米金显色技术的检测方法,具有较高的检测特异性及灵敏度,检测通量高,肉眼即可观察结果,在传染病病原体检测方面具有广阔的应用前景。 展开更多

关键词 病毒性脑炎脑膜炎 多重PCR 核酸侵入反应 纳米金显色

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江苏省一起急性胃肠炎爆发的疫情调查(英文) 被引量：10

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作者 付建光 姚萍 +7 位作者 闻栋 艾静 祁贤 朱叶飞 鲍昌俊 汤奋扬 祖荣强 周明浩 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第5期509-513,共5页

目的调查和分析一起发生在江苏省常州市某小学急性胃肠炎爆发疫情,明确流行病学特征和基因型特征。方法根据统一设计的流行病学调查表,对病例和对照的饮食、饮水和卫生习惯等情况开展病例对照研究。对病例的排毒情况进行跟踪调查,明确... 目的调查和分析一起发生在江苏省常州市某小学急性胃肠炎爆发疫情,明确流行病学特征和基因型特征。方法根据统一设计的流行病学调查表,对病例和对照的饮食、饮水和卫生习惯等情况开展病例对照研究。对病例的排毒情况进行跟踪调查,明确排毒期长短。采集病例和对照的标本,进行荧光定量PCR方法检测,对部分阳性结果标本进行测序以明确基因型。结果 11月22日起出现首例病例,11月22日至12月2日为主要发病阶段。此期共发病269例,其中学生发病264例,罹患率17.4%,教师发病5例,罹患率4.4%,两者存在统计学差异(χ2=13,P<0.01);排毒期调查结果显示,本起暴发疫情最短排毒期为发病后3d,最长为14d,中位时间为7d。共采集172份标本,其中82份检测结果为诺如病毒GII型阳性,未检测到轮状病毒及腺病毒,18份诺如病毒GII型阳性标本测序分析显示均为GII.12基因型。结论结合病例临床特征、流行病学调查及实验室检测结果综合分析,判定本起疫情为诺如病毒GII.12型感染导致的急性胃肠炎爆发疫情,该型别在我省尚为首次发现。爆发原因可能为呕吐物-口引起的大范围传播。 展开更多

关键词 胃肠炎 爆发 诺如病毒 基因型

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H5N1型禽流感病毒广谱中和单克隆抗体的筛选及其中和机制初步研究 被引量：3

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作者 张晓 曾晓燕 +4 位作者 刘哲 金秋 徐言 冯振卿 焦永军 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2011年第6期519-527,共9页

利用杆状病毒-昆虫细胞表达H5N1型禽流感病毒的血凝素蛋白(HA),纯化后的重组蛋白HA免疫小鼠并制备杂交瘤单克隆抗体,用H5N1型禽流感病毒的全病毒进行筛选,成功地获得了抗H5N1型禽流感病毒血凝素蛋白HA的单抗.MDCK细胞微量中和试验表明,... 利用杆状病毒-昆虫细胞表达H5N1型禽流感病毒的血凝素蛋白(HA),纯化后的重组蛋白HA免疫小鼠并制备杂交瘤单克隆抗体,用H5N1型禽流感病毒的全病毒进行筛选,成功地获得了抗H5N1型禽流感病毒血凝素蛋白HA的单抗.MDCK细胞微量中和试验表明,单抗8G10D7可对clade2和clade9的H5N1型禽流感病毒起中和作用.Western-blot及血凝抑制实验进一步证明了该单抗的结合位点位于HA蛋白的HA1亚基上.鸡胚感染病毒预防试验结果表明,8G10D7对禽来源的和人来源的H5N1型禽流感病毒均可达到100%的保护率;在治疗试验组中,8G10D7对禽来源的病毒感染具有较高的保护率,可达100%,对人来源的H5N1型禽流感病毒最高也可达87.5%的保护率.该抗体的获得不仅为H5N1型高致病性禽流感病毒的预防和治疗带来了希望,同时其中和位点的发现也为以后亚单位疫苗的研制提供新的思路. 展开更多

关键词 H5N1型禽流感病毒 杆状病毒.昆虫细胞表达系统 单克隆抗体 微量中和 半数细胞培养物感染量 血凝抑制

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2012年江苏部分地区动物中发热伴血小板减少综合征病毒携带状况调查 被引量：3

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作者 彭海燕 崔岚 +7 位作者 崔仑标 胡建利 鲍倡俊 李燕 焦永军 卞倩 史智扬 周明浩 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2015年第2期235-238,共4页

目的了解江苏部分地区动物中发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）携带状况,探讨其可能的传播媒介和自然宿主。方法 2012年3月-12月在江苏省发现发热伴血小板减少综合征病例的7个市/县,采集鼠、牛、羊、刺猬、鸟类和蜱等动物标本,提取... 目的了解江苏部分地区动物中发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）携带状况,探讨其可能的传播媒介和自然宿主。方法 2012年3月-12月在江苏省发现发热伴血小板减少综合征病例的7个市/县,采集鼠、牛、羊、刺猬、鸟类和蜱等动物标本,提取总核酸后,应用实时荧光RT-PCR法对标本进行布尼亚病毒S基因核酸的检测,阳性标本采用Vero细胞进行病毒分离。结果采集761只（管）动物,43只（管）检出SFTSV核酸阳性,阳性率为5.65%。采集3 728份标本,阳性49份,阳性率为1.31%。鼠的病毒携带率最高（6.84%）,蜱标本阳性率最高（4.94%）。除蜱标本外的3 647份标本中检出阳性45份,阳性率为1.23%,不同器官阳性率分别为淋巴结（50.00%）、血清（2.34%）、脾（1.64%）、心（1.64%）、肝（1.28%）、肺（1.09%）、脑（0.94%）、肾（0.73%）、血块（0.41%）。5月标本阳性率最高（4.01%）。从1份羊血清及其体表1份蜱标本中各分离出1株SFTSV病毒。结论鼠、牛、羊和蜱均可携带SFTSV,可能是其自然宿主或传播媒介。 展开更多

关键词 发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV) 实时荧光RT-PCR 宿主 媒介 监测

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一起皮肤炭疽疫情中炭疽杆菌分子特征分析 被引量：4

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作者 谈忠鸣 张忠献 +4 位作者 董晨 胡建利 鲍倡俊 汤奋扬 朱叶飞 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2015年第3期436-438,共3页

目的 :对引起2012年江苏省一起皮肤炭疽疫情的炭疽杆菌进行分子特征分析。方法 :采用聚合酶链式反应对患者焦痂标本和病牛组织标本进行炭疽杆菌多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)和保护性抗原(protective antigen,PA)基... 目的 :对引起2012年江苏省一起皮肤炭疽疫情的炭疽杆菌进行分子特征分析。方法 :采用聚合酶链式反应对患者焦痂标本和病牛组织标本进行炭疽杆菌多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)和保护性抗原(protective antigen,PA)基因扩增并测序分析。结果:4例患者焦痂标本和病牛组织标本中的炭疽杆菌具有相同的多位点序列和保护性抗原基因序列,分别为ST1型和PAⅠ型,并与国际参考株str.Ames Ancestor具有相同的基因型。结论:此次皮肤炭疽疫情中通过牛感染人的炭疽杆菌为ST1型和PA基因Ⅰ型菌株。 展开更多

关键词 炭疽疫情 炭疽杆菌 多位点序列分型 保护性抗原基因

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高通量测序H7N9禽流感病毒基因组模板制备方法的优化及应用 被引量：4

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作者 赵康辰 郭喜玲 +9 位作者 祁贤 葛以跃 朱政 陈银 樊欢 朱叶飞 史智扬 汪华 崔仑标 周明浩 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第7期1002-1006,共5页

目的:建立一种较优的高通量测序H7N9禽流感病毒基因组模板制备方法,用于H7N9禽流感病毒基因组监测。方法:分别以6碱基随机引物反转录生成单链cDNA,合成双链cDNA;流感病毒通用反转录引物U12反转录生成单链cDNA,6碱基随机引物合成双链cDNA... 目的:建立一种较优的高通量测序H7N9禽流感病毒基因组模板制备方法,用于H7N9禽流感病毒基因组监测。方法:分别以6碱基随机引物反转录生成单链cDNA,合成双链cDNA;流感病毒通用反转录引物U12反转录生成单链cDNA,6碱基随机引物合成双链cDNA;U12引物反转录生成单链cDNA,通用流感病毒全基因扩增引物混合物生成双链cDNA制备高通量测序模板、构建测序文库、测序并分析数据,比较3种方法对高通量测序效率的影响,并与传统Sanger测序方法比较其测序的准确性,选择其中较优的方法用于高通量测序。结果:以U12引物反转录cDNA,通用流感病毒全基因扩增引物混合物生成双链cDNA制备的高通量测序模板,在测序族生成数、覆盖率、单核苷酸多态性及读长等方面均优于另外两种方法。结论:本研究建立的H7N9禽流感病毒基因组模板制备方法用于高通量测序具有准确性高,周期短,成本相对较低,可同时检测多个样本等特点,可用于大规模H7N9禽流感病毒基因组监测。 展开更多

关键词 禽流感病毒 H7N9 模板制备 高通量测序

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单克隆抗体S2C4对2型志贺毒素及其亚型毒性的中和作用(英文) 被引量：3

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作者 焦永军 曾晓燕 +3 位作者 郭喜玲 史智扬 冯振卿 汪华 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2009年第6期736-742,共7页

纯化的2型志贺毒素(Shiga toxin2,Stx2)经福尔马林脱毒后免疫BALB/c小鼠制备Stx2单克隆抗体,用体外中和试验对具有中和活性的阳性抗体克隆进行初筛,对所获得的中和抗体的重、轻链同种型及结合特异性进行鉴定,其中和保护作用通过体内、... 纯化的2型志贺毒素(Shiga toxin2,Stx2)经福尔马林脱毒后免疫BALB/c小鼠制备Stx2单克隆抗体,用体外中和试验对具有中和活性的阳性抗体克隆进行初筛,对所获得的中和抗体的重、轻链同种型及结合特异性进行鉴定,其中和保护作用通过体内、体外中和试验加以验证,最后,中和抗体对Stx2亚型Stx2c和Stx2vha的中和谱用体内中和试验验证.结果显示,12株抗Stx2的阳性抗体克隆中,只有1株具有中和活性,命名为S2C4,其重、轻链同种型为G1/κ,其靶分子为Stx2的A亚单位,与Stx2的B亚单位或Stx1不结合.在体外中和试验中S2C4可有效中和Stx2对Vero细胞的杀伤作用,同样,S2C4可中和致死量的Stx2及其亚型Stx2c和Stx2vha对小鼠的毒性作用.该抗体有望成为治疗产志贺毒素大肠杆菌感染的候选分子. 展开更多

关键词 单克隆抗体S2C4 2型志贺毒素 中和作用 产志贺毒素大肠杆菌

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2013-2022年江苏省柯萨奇病毒A6型全基因组序列特征分析 被引量：3

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作者 樊欢 鲍倡俊 +2 位作者 朱立国 胡建利 嵇红 《中国人兽共患病学报》 CSCD 北大核心 2023年第12期1165-1173,共9页

目的 研究江苏省2013-2022年分离到的柯萨奇病毒A6型(CV-A6)全基因组序列特征及对全基因组各编码区进行遗传进化分析,以期从分子流行病学特征的角度解释CV-A6取代肠道病毒A71和柯萨奇病毒A16成为江苏省引起手足口病(HFMD)主要病原的原... 目的 研究江苏省2013-2022年分离到的柯萨奇病毒A6型(CV-A6)全基因组序列特征及对全基因组各编码区进行遗传进化分析,以期从分子流行病学特征的角度解释CV-A6取代肠道病毒A71和柯萨奇病毒A16成为江苏省引起手足口病(HFMD)主要病原的原因。方法 选取2013-2022年间江苏省地区流行的35株CV-A6毒株进行全基因组测序,采用DNASTAR、MEGA7.0和Similarity plots3.5.1等软件对获取的全基因组序列进行比对、相似性分析、系统进化分析和基因重组分析,对P1编码区和3D区主要氨基酸变异位点进行分析。结果 35株CV-A6江苏毒株的全基因组核苷酸和氨基酸序列相似性分别为87.5%~99.6%和97.0%~99.8%,与CV-A6原型株Gdula/USA/1949的全基因组核苷酸序列相似性仅为80.3%~81.0%,氨基酸序列相似性为94.7%~95.3%。基于VP1序列的系统进化树结果显示,2013-2022年江苏省有34株CV-A6分离毒株分属于D3a基因亚型,1株分属于D2基因亚型;基于3D区进化树划分不同重组模式,2013-2022年江苏省流行的CV-A6出现过4个重组进化分支:RF-A、RF-L、RF-K和RF-C型。重组分析结果显示:江苏省流行的CV-A6毒株与CV-A6原型株Gdula/USA/1949在结构蛋白序列上具有较高的相似性。而在非结构蛋白和非编码区则与其他EV-A原型株序列相似性更高。而氨基酸突变位点分析结果显示,与原型株Gdula/USA/1949相比,P1区和3D区多个氨基酸位点变异频繁,可能会使得衣壳蛋白的结构、潜在的受体结合位点产生变化。结论 通过对2013-2022年江苏省CV-A6的全基因组序列分析,有助于了解江苏省CV-A6基因重组及遗传进化关系,解释了近年来CV-A6成为手足口病的主要病原体的可能原因,对CV-A6的防控工作提供了基础资料。 展开更多

关键词 手足口病 柯萨奇病毒A组6型 基因重组 遗传特征

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抗人生长转化因子15单克隆抗体制备及鉴定 被引量：5

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作者 詹峰 曾晓燕 +4 位作者 张晓 周顺 徐言 张建平 焦永军 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期539-541,544,共4页

目的:制备抗人生长转化因子15(GDF15)单克隆抗体(mAb)并鉴定其特性。方法:构建GDF15原核表达载体pGEX-4T-2-gdf15,诱导表达并纯化GST-GDF15融合蛋白。以该融合蛋白免疫BALB/c小鼠,取小鼠的脾细胞与同系小鼠Sp2/0骨髓瘤细胞常规融合,依... 目的:制备抗人生长转化因子15(GDF15)单克隆抗体(mAb)并鉴定其特性。方法:构建GDF15原核表达载体pGEX-4T-2-gdf15,诱导表达并纯化GST-GDF15融合蛋白。以该融合蛋白免疫BALB/c小鼠,取小鼠的脾细胞与同系小鼠Sp2/0骨髓瘤细胞常规融合,依次进行阳性杂交瘤细胞株的筛选及亚克隆,最终获得稳定分泌抗GDF15 mAb杂交瘤细胞株。以间接ELISA法检测抗体效价;Western blot鉴定抗体特异性;免疫共沉淀法初步检测在肝癌患者血清中GDF15表达水平。结果:获得1株稳定分泌抗人GDF15 mAb杂交瘤细胞株,命名为9G3;抗体免疫球蛋白亚类为IgG1,轻链为κ型;免疫共沉淀及质谱分析证实抗GDF15 mAb9G3能与肝癌患者血清中GDF15蛋白特异性结合并且GDF15水平在肝癌患者血清中较正常人显著升高。结论:成功制备了抗人GDF15mAb,为后期肝癌早期诊断试剂盒的开发奠定了良好的基础。 展开更多

关键词 GDF15 单克隆抗体 HCC

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2013年3月江苏省禽流感职业暴露人群H5N1抗体水平及影响因素分析 被引量：3

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作者 秦圆方 许可 +8 位作者 祁贤 邓斐 余慧燕 田华 付建光 李志锋 王慎骄 单军 汤奋扬 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期839-843,共5页

目的:调查H7N9流行初始江苏省职业暴露人群H5N1禽流感抗体水平及其影响因素。方法:分别使用香港株、广东株与安徽株抗原,用血清凝集抑制法(hemagglutination inhibition,HI)测定血清样本抗体滴度,计算几何平均滴度(geometric mean titer... 目的:调查H7N9流行初始江苏省职业暴露人群H5N1禽流感抗体水平及其影响因素。方法:分别使用香港株、广东株与安徽株抗原,用血清凝集抑制法(hemagglutination inhibition,HI)测定血清样本抗体滴度,计算几何平均滴度(geometric mean titer,GMT),统计分析影响抗体水平的因素。结果:检测职业暴露人群血清标本416份,性别与抗原株对职业暴露人群抗体滴度有显著影响。结论:江苏省职业暴露人群H5N1禽流感抗体滴度普遍较低。男性抗体滴度低于女性,广东株抗原与禽流感病毒现有流行株较为接近。 展开更多

关键词 禽流感病毒 职业暴露人群 血清凝集抑制试验 流行特征

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禽流感病毒(H5N1)血凝素蛋白真核表达载体的构建与表达 被引量：2

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作者 张文帅 温恬 +2 位作者 迟莹 李燕 焦永军 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期91-93,共3页

目的:构建禽流感病毒(H5N1)血凝素蛋白HA真核表达载体并表达其编码蛋白(转染293T细胞)。方法:从江苏H5N1流感病毒毒株(A/Jiangsu/07-4(H5N1))提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增HA全长基因,将其克隆至pMD18-T Vector中构建pMD18-T-HA质粒,... 目的:构建禽流感病毒(H5N1)血凝素蛋白HA真核表达载体并表达其编码蛋白(转染293T细胞)。方法:从江苏H5N1流感病毒毒株(A/Jiangsu/07-4(H5N1))提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增HA全长基因,将其克隆至pMD18-T Vector中构建pMD18-T-HA质粒,双酶切pMD18-T-HA与PXJ40-MYC后,构建真核表达载体PXJ40-MYC-HA,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过West-ern blot鉴定HA蛋白的表达。结果:经双酶切、测序鉴定证实HA基因的真核表达载体构建成功。Western blot法可见HA基因编码蛋白的成功表达。结论:成功构建了H5N1血凝素真核表达载体,该表达载体的构建为后期建立稳定表达HA蛋白的细胞模型和HA蛋白功能研究奠定了基础。 展开更多

关键词 禽流感病毒 H5N1 HA 真核表达 免疫印迹

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人源天然Fab噬菌体抗体库的构建及抗c-Met抗体的筛选、鉴定 被引量：4

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作者 万佳艺 孙慧 +4 位作者 焦永军 朱晓娟 朱进 刘政 冯振卿 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期697-701,共5页

目的:构建大容量人源天然Fab噬菌体抗体库,筛选抗c-Met特异性抗体并进行初步鉴定。方法:采集20位健康成人的骨髓淋巴细胞,用PCR扩增人Fab片断抗体基因,插入载体pComb3XSS内,构建人源天然Fab抗体库。以固相化的抗原对抗体库进行6轮筛选后... 目的:构建大容量人源天然Fab噬菌体抗体库,筛选抗c-Met特异性抗体并进行初步鉴定。方法:采集20位健康成人的骨髓淋巴细胞,用PCR扩增人Fab片断抗体基因,插入载体pComb3XSS内,构建人源天然Fab抗体库。以固相化的抗原对抗体库进行6轮筛选后,随机挑选60个克隆用Phage ELISA、BstOⅠ酶切片断分析进行检测,阳性克隆作可溶性表达和鉴定。结果:构建的Fab噬菌体抗体库的库容为1.2×109,从中筛选到1株与c-Met特异性结合的人源抗体克隆,命名为AM2-26。DNA序列分析证明为人免疫球蛋白可变区基因,Western blot证实为人源抗c-Met Fab抗体片段,ELISA特异性鉴定阳性。结论:构建了大容量人源天然Fab抗体库,从中获得1株抗c-Met人源Fab抗体片段,有望为抗肿瘤药物的研制提供新的候选分子。 展开更多

关键词 C-MET 噬菌体抗体库 FAB片段 肿瘤

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甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1真核表达载体的构建与表达 被引量：2

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作者 张文帅 卞倩 +3 位作者 温恬 迟莹 李燕 焦永军 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第3期287-289,共3页

目的:构建甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1真核表达载体并表达其编码蛋白(转染293T细胞)。方法:从江苏首例甲型H1N1流感病毒毒株(A/Nan jing/1/2009(H1N1))提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增NS1全长基因,将其克隆至pMD18-T Vector中构建pMD... 目的:构建甲型H1N1流感病毒非结构蛋白NS1真核表达载体并表达其编码蛋白(转染293T细胞)。方法:从江苏首例甲型H1N1流感病毒毒株(A/Nan jing/1/2009(H1N1))提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增NS1全长基因,将其克隆至pMD18-T Vector中构建pMD18-T-NS1质粒,双酶切pMD18-T-NS1与PXJ40-HA后,构建真核表达载体PXJ40-HA-NS1,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过Western blot鉴定NS1蛋白的表达。结果:经双酶切、测序鉴定证实NS1基因的真核表达载体构建成功。West-ern blot法可见NS1基因编码蛋白的成功表达。结论:成功克隆NS1全长基因,并构建了其真核表达载体,该表达载体的构建为后期建立稳定表达NS1蛋白的细胞模型和NS1蛋白功能研究提供了材料。 展开更多

关键词 甲型H1N1流感病毒 NS1 真核表达 免疫印迹

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江苏省2012年柯萨奇病毒A组16型基因特征分析 被引量：2

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作者 单军 嵇红 +6 位作者 包林 付建光 王慎骄 祁贤 汤奋扬 周明浩 朱叶飞 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2014年第1期80-83,共4页

目的：了解江苏省2012年柯萨奇病毒A组16型（CA16）分离株VP1区基因特征。方法：选取江苏省2012年14株CA16病毒分离株,用1对特异性引物进行VP1区核苷酸序列扩增,对扩增产物进行测序,利用生物信息学软件对序列进行分析,结果与CA16参考株... 目的：了解江苏省2012年柯萨奇病毒A组16型（CA16）分离株VP1区基因特征。方法：选取江苏省2012年14株CA16病毒分离株,用1对特异性引物进行VP1区核苷酸序列扩增,对扩增产物进行测序,利用生物信息学软件对序列进行分析,结果与CA16参考株序列进行同源性比较并构建基因进化树。结果：14株CA16分离株VP1区核苷酸和氨基酸同源性分别为90.5%~100.0%和98.7%~100.0%,与CA16国际标准株G10的核苷酸和氨基酸同源性分别为75.5%~76.7%和91.6%~92.3%。江苏省2012年的CA16分离株全部属于B1基因亚型,同时包含B1a 和B1b 两条进化分支。结论：江苏省2012年有CA16病毒的B1a与B1b两种进化分支共同存在与循环,且呈现以B1b基因亚型为优势型别。B1a基因亚型为辅助型别的传播模式;无论是优势型别还是辅助型别,均各自呈现密切的亲缘关系。 展开更多

关键词 手足口病 柯萨奇病毒A组16 型 VP1基因 基因型

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慢病毒介导的H7N9禽流感病毒血凝素基因快速真核表达系统的建立 被引量：1

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作者 张黎 彭海燕 +6 位作者 周明浩 余慧燕 曾晓燕 祁贤 崔仑标 焦永军 史智扬 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期630-634,共5页

目的利用慢病毒载体构建新型H7N9禽流感病毒血凝素(HA)基因的快速真核表达体系,在人胚肾细胞(HEK293T)中表达并进行功能鉴定。方法提取H7N9禽流感病毒基因组RNA,采用反转录PCR技术扩增HA读码框全长基因,将HA基因连接pMD18-T载体构建pMD1... 目的利用慢病毒载体构建新型H7N9禽流感病毒血凝素(HA)基因的快速真核表达体系,在人胚肾细胞(HEK293T)中表达并进行功能鉴定。方法提取H7N9禽流感病毒基因组RNA,采用反转录PCR技术扩增HA读码框全长基因,将HA基因连接pMD18-T载体构建pMD18-T-HA重组载体。设计含Kozak序列的引物从pMD18-T-HA质粒中扩增出平末端HA基因,采用Topo克隆构建表达载体pLenti-HA-V5。将表达载体转染HEK293T细胞,通过间接免疫荧光法(IFA)和Western blot法鉴定HA蛋白的表达,通过血凝实验鉴定重组蛋白的生物学活性。结果经反转录PCR获得1 683 bp的HA全长基因,完成真核表达载体的构建并表达出相对分子质量(Mr)为70 000的重组蛋白。IFA和Western blot法结果显示该蛋白与阳性血清具有良好的免疫反应,同时血凝实验证实其具有血凝活性。结论成功利用慢病毒载体建立了HA蛋白的快速真核表达系统,为研制H7N9病毒亚单位疫苗、中和表位研究、假病毒包装奠定基础。 展开更多

关键词 H7N9禽流感病毒 血凝素基因 慢病毒载体 真核表达系统

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H7N9亚型禽流感病毒非结构蛋白-1真核表达载体的构建与表达 被引量：1

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作者 温恬 迟莹 +3 位作者 张黎 张文帅 彭海燕 史智扬 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第10期1339-1343,共5页

目的:构建甲型H7N9亚型禽流感病毒非结构蛋白NS1真核表达载体并转染293T细胞以表达其编码的蛋白。方法:从南京分离株H7N9流感病毒[A/Nanjing/1/2013(H7N9)]提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增NS1全长基因,将其克隆至pMD18-T载体中构建pMD18... 目的:构建甲型H7N9亚型禽流感病毒非结构蛋白NS1真核表达载体并转染293T细胞以表达其编码的蛋白。方法:从南京分离株H7N9流感病毒[A/Nanjing/1/2013(H7N9)]提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增NS1全长基因,将其克隆至pMD18-T载体中构建pMD18-T-NS1质粒,以pMD18-T-NS1质粒为模板扩增NS1基因。双酶切NS1基因PCR产物与PXJ40-MYC后,连接构建真核表达载体PXJ40-MYC-NS1,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过Western blot鉴定NS1蛋白的表达。结果:经双酶切、测序鉴定证实NS1基因的真核表达载体构建成功。Western blot法可见NS1基因编码蛋白的成功表达。结论:成功构建了H7N9非结构蛋白NS1真核表达载体,该表达载体的构建为后期建立稳定表达NS1蛋白的细胞模型和NS1蛋白功能研究奠定基础。 展开更多

关键词 H7N9亚型禽流感病毒 NS1 真核表达 免疫印迹

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H5N1高致病性禽流感病毒HA基因在昆虫细胞中的表达 被引量：1

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作者 金秋 刘哲 +6 位作者 陆敏华 戴望舒 徐言 张晓 曾晓燕 冯振卿 焦永军 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第11期1583-1586,共4页

目的:扩增高致病性禽流感H5N1亚型病毒血凝素(hemagglutinin,HA)基因,并进行真核表达。方法:抽提毒株A/Jiangsu/08-6基因组RNA,反转录为cDNA,用特异性引物扩增HA基因。HA经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切后克隆到pFastBac-GP67B载体上,筛选出阳性... 目的:扩增高致病性禽流感H5N1亚型病毒血凝素(hemagglutinin,HA)基因,并进行真核表达。方法:抽提毒株A/Jiangsu/08-6基因组RNA,反转录为cDNA,用特异性引物扩增HA基因。HA经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切后克隆到pFastBac-GP67B载体上,筛选出阳性重组转座质粒pFastBac-GP67B-HA,并将其进一步转化DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选和PCR鉴定后,获得重组穿梭载体(rBacmid-HA),再通过CellfectinⅡ试剂转染rBacmid-HA至对数生长期的sf9昆虫细胞,进行目的蛋白的真核表达。分别用SDS-PAGE、Western blot、血凝试验以及质谱分析对其进行鉴定。结果:HA基因在sf9细胞表达的蛋白分子量约70 000。血凝试验表明重组HA蛋白可使鸡红细胞发生凝集。质谱分析鉴定该重组蛋白为HA蛋白。结论:重组HA蛋白具有天然HA蛋白的活性,为亚单位疫苗的研制及中和抗体的筛选奠定了基础。 展开更多

关键词 H5N1型禽流感病毒 血凝素 杆状病毒昆虫细胞表达系统 血凝试验

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