目的克隆人CD45 c DNA并导入Hela细胞中表达,建立研究CD45功能的细胞模型。方法采用RT-PCR方法从人外周血单个核细胞中扩增CD45基因PTPRC的c DNA,将其克隆至p MD-18T载体。构建重组真核表达载体Pc DNA3.1-3xflag-CD45,经HindⅢ和XhoⅠ...目的克隆人CD45 c DNA并导入Hela细胞中表达,建立研究CD45功能的细胞模型。方法采用RT-PCR方法从人外周血单个核细胞中扩增CD45基因PTPRC的c DNA,将其克隆至p MD-18T载体。构建重组真核表达载体Pc DNA3.1-3xflag-CD45,经HindⅢ和XhoⅠ双酶切及测序验证。将其转染至Hela细胞,以流式细胞术(FCM)和免疫印迹(WB)分析CD45在Hela细胞中的表达情况,碱性磷酸酶试剂盒检测CD45的活性。结果分离到长约3900 bp的人PTPRC c DNA片段,将其插入p MD-18T载体获得了c DNA克隆。酶切和测序结果证实重组表达载体Pc DNA3.1-3xflag-CD45构建成功,FCM和WB分析表明CD45能在Hela细胞中有效表达,且表达的重组CD45蛋白具有生物学活性。结论成功获得人PTPRC c DNA克隆并在Hela细胞中有效表达,为进一步研究CD45功能奠定了基础。展开更多
目的:利用噬菌体肽库技术筛选抗广谱革兰氏阴性菌与LPS单克隆抗体3A8的识别表位,以获得来源于不同LPS的保守表位。方法:用广谱抗G-菌、LPS的单克隆抗体3A8为靶,筛选噬菌体环七肽库,ELISA鉴定阳性噬菌体克隆并测序。根据阳性保守序列合...目的:利用噬菌体肽库技术筛选抗广谱革兰氏阴性菌与LPS单克隆抗体3A8的识别表位,以获得来源于不同LPS的保守表位。方法:用广谱抗G-菌、LPS的单克隆抗体3A8为靶,筛选噬菌体环七肽库,ELISA鉴定阳性噬菌体克隆并测序。根据阳性保守序列合成短肽A2及A5,并与KLH载体交联,ELISA鉴定A2-KLH、A5-KLH与3A8单抗的结合。结果:随机挑选的33个噬菌体克隆中有15个可特异性与3A8结合,该结合可被LPS2630所抑制。根据阳性克隆DNA序列推导氨基酸序列,共有7种序列,均以疏水氨基酸为主,且包含保守序列Ser Pro Pro/Pro X Pro;选择所获阳性序列经设计与改造合成延长的两个环肽;经ELISA鉴定表明这些环肽可特异地与3A8结合。结论:得到可被3A8单抗特异性识别并含保守残基Ser Pro Pro/ProX Pro的阳性序列,据此合成的短肽可特异性结合3A8,提示该短肽可能模拟LPS共同表位的抗原性,有望成为疫苗候选表位。展开更多
文摘目的拟通过单细胞转录组测序技术(single-cell RNA sequencing,scRNA-seq)解析移植前体外培养人胸腺组织切片的残余细胞类型和功能,并利用培养上清液分子标志物的水平特征建立胸腺组织切片质量评估方法。方法收集2023年5月至2024年1月在重庆医科大学附属儿童医院心胸外科接受心脏外科手术的18例先天心脏病患者废弃的胸腺制备成胸腺组织切片。体外培养14 d后,通过scRNA-seq鉴定残余的细胞类型,联合基因本体论(gene ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析残余细胞的功能,并查阅胸腺组织切片培养的相关文献筛选出指示胸腺细胞功能的分子标志物。采用ELISA检测上清液分子标志物的蛋白水平变化,绘制受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC),以曲线下面积(area under the curve,AUC)判定上清液分子标志物对胸腺组织切片质量的评估价值。将分子标志物判定为质量检测合格与质量检测不合格的胸腺组织切片移植至6~8周龄Balb/c-nude雄性小鼠(体质量14~17 g)皮下(对照组不移植胸腺组织切片),通过流式细胞术和组织学检测分析移植后免疫重建效果。结果(1)scRNA-seq数据显示,胸腺组织切片中含有11种细胞,主要细胞为上皮细胞、成纤维细胞和T细胞。GO和KEGG富集分析显示,上皮细胞与趋化作用、上皮细胞发育、细胞基质粘附、紧密连接等条目相关;成纤维细胞主要与细胞外基质组织、上皮细胞增殖、负向调控细胞迁移、肌动蛋白细胞骨架调节等条目相关;T细胞主要与T细胞分化、T细胞活化的调控、T细胞凋亡、T细胞受体信号等条目相关。(2)筛选出CCL19、CCL21、CXCL12、CXCL16、IL16、SELL作为指示胸腺细胞功能的分子标志物,与第1天相比,CCL19、CCL21、CXCL12和CXCL16蛋白分泌量伴随体外培养显著增加(P<0.05),IL16和L-selectin(SELL表达分泌的蛋白)蛋白分泌量伴随体外培养显著下降(P<0.05)。联合IL16和L-selectin生成预测因子Pre1评估体外培养1 d的胸腺组织切片质量的价值最高,ROC曲线下面积为0.883。联合CCL19、CCL21、CXCL12、CXCL16生成预测因子Pre2评估体外培养14 d的胸腺组织切片质量的价值最高,ROC曲线下面积为0.948。(3)裸鼠移植实验证实:与对照组相比,质量检测合格的胸腺组织切片能在体内发育成胸腺结构,并有效提升裸鼠外周血中T细胞的比例(P<0.01),而质量检测不合格的胸腺组织切片移植到裸鼠体内无法重建裸鼠的T细胞发育。结论移植前胸腺组织切片残留的组成细胞主要为上皮细胞、成纤维细胞和T细胞;IL16和L-selectin可作为判定胸腺原料质量的潜在指标。CCL19、CCL21、CXCL12和CXCL16可有效评估胸腺组织切片成品的质量。
文摘目的克隆人CD45 c DNA并导入Hela细胞中表达,建立研究CD45功能的细胞模型。方法采用RT-PCR方法从人外周血单个核细胞中扩增CD45基因PTPRC的c DNA,将其克隆至p MD-18T载体。构建重组真核表达载体Pc DNA3.1-3xflag-CD45,经HindⅢ和XhoⅠ双酶切及测序验证。将其转染至Hela细胞,以流式细胞术(FCM)和免疫印迹(WB)分析CD45在Hela细胞中的表达情况,碱性磷酸酶试剂盒检测CD45的活性。结果分离到长约3900 bp的人PTPRC c DNA片段,将其插入p MD-18T载体获得了c DNA克隆。酶切和测序结果证实重组表达载体Pc DNA3.1-3xflag-CD45构建成功,FCM和WB分析表明CD45能在Hela细胞中有效表达,且表达的重组CD45蛋白具有生物学活性。结论成功获得人PTPRC c DNA克隆并在Hela细胞中有效表达,为进一步研究CD45功能奠定了基础。
文摘目的:利用噬菌体肽库技术筛选抗广谱革兰氏阴性菌与LPS单克隆抗体3A8的识别表位,以获得来源于不同LPS的保守表位。方法:用广谱抗G-菌、LPS的单克隆抗体3A8为靶,筛选噬菌体环七肽库,ELISA鉴定阳性噬菌体克隆并测序。根据阳性保守序列合成短肽A2及A5,并与KLH载体交联,ELISA鉴定A2-KLH、A5-KLH与3A8单抗的结合。结果:随机挑选的33个噬菌体克隆中有15个可特异性与3A8结合,该结合可被LPS2630所抑制。根据阳性克隆DNA序列推导氨基酸序列,共有7种序列,均以疏水氨基酸为主,且包含保守序列Ser Pro Pro/Pro X Pro;选择所获阳性序列经设计与改造合成延长的两个环肽;经ELISA鉴定表明这些环肽可特异地与3A8结合。结论:得到可被3A8单抗特异性识别并含保守残基Ser Pro Pro/ProX Pro的阳性序列,据此合成的短肽可特异性结合3A8,提示该短肽可能模拟LPS共同表位的抗原性,有望成为疫苗候选表位。
