高亲和力抗Met人源基因工程抗体scFv的筛选与特性分析 被引量：6

1

作者 朱进 王辛 +3 位作者 焦永军 冯振卿 曹伯良 管晓虹 《中国肿瘤生物治疗杂志》 CAS CSCD 2006年第6期417-422,共6页

目的应用噬菌体展示技术制备抗HGF受体Met特异性、高亲和力的全人抗体scFv片段。方法以从天然抗体库中筛选出的Fab基因可变区VH和VL为模板,分别在CDR区引入有限突变和随机突变,扩增出scFv基因库,克隆于pComb3XSS中,构建scFv次级突变抗体... 目的应用噬菌体展示技术制备抗HGF受体Met特异性、高亲和力的全人抗体scFv片段。方法以从天然抗体库中筛选出的Fab基因可变区VH和VL为模板,分别在CDR区引入有限突变和随机突变,扩增出scFv基因库,克隆于pComb3XSS中,构建scFv次级突变抗体库,筛选高亲和力克隆。结果经5轮细胞筛选和2轮抗原固相筛选,选取60个克隆进行ELISA检测,选择较高亲和力的噬菌体抗体,克隆于原核表达载体pBAD-gIII/A中,经诱导表达、SDS-PAGE和Westernblotting分析,在相对分子质量30000处出现预期大小的蛋白条带。单链抗体经表达、变性与复性和IMAC亲和纯化后,用于流式细胞术、免疫沉淀分析,结果表明,scFv能够与S114细胞表达Met的胞外区特异性结合,其亲和常数Kd值为4.76×10-8mol/L,与突变前抗体的亲和力(Kd值为5.24×10-6mol/L)相比,抗体的亲和力提高约100倍。竞争ELISA结果显示,亲和力成熟后抗体的抗原结合表位未变。结论经过CDR突变和抗体库筛选,有效提高了抗体的亲和力,该抗体有望成为临床肿瘤诊断或治疗的候选分子。 展开更多

关键词 噬菌体抗体库 抗Met单链抗体 亲和力成熟 抗肿瘤

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人源抗滋养层细胞表面抗原-2基因工程抗体Fab的制备及特性分析 被引量：5

2

作者 林红 梁洁 +5 位作者 张慧林 唐奇 苏亦平 Brian Cao 朱进 管晓虹 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2010年第10期1101-1107,共7页

应用噬菌体抗体库技术制备全人源抗滋养层细胞表面抗原-2(Trop-2)特异性Fab抗体片段.抗体库经细胞筛选和固相抗原筛选,获得特异性的阳性克隆.阳性载体经核酸序列分析后,构建工程菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析,呈现28ku... 应用噬菌体抗体库技术制备全人源抗滋养层细胞表面抗原-2(Trop-2)特异性Fab抗体片段.抗体库经细胞筛选和固相抗原筛选,获得特异性的阳性克隆.阳性载体经核酸序列分析后,构建工程菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析,呈现28ku和32ku大小的两条蛋白质条带.Fab分子经流式细胞术、细胞免疫荧光检测,结果表明,Fab能够与BxPc3细胞膜蛋白特异性结合,而与NIH3T3细胞不结合.免疫共沉淀与质谱分析结果表明,该Fab分子能够与Trop-2蛋白特异性结合.免疫组化显示,该抗体可结合胰腺癌细胞膜蛋白,在细胞培养液中加入Fab,能够抑制BxPc3细胞的生长.以上研究结果提示,该抗体有望成为胰腺癌临床影像诊断或治疗的候选分子. 展开更多

关键词 噬菌体抗体库 胰腺癌 人源抗Trop-2抗体

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H5N1型禽流感病毒广谱中和单克隆抗体的筛选及其中和机制初步研究 被引量：3

3

作者 张晓 曾晓燕 +4 位作者 刘哲 金秋 徐言 冯振卿 焦永军 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2011年第6期519-527,共9页

利用杆状病毒-昆虫细胞表达H5N1型禽流感病毒的血凝素蛋白(HA),纯化后的重组蛋白HA免疫小鼠并制备杂交瘤单克隆抗体,用H5N1型禽流感病毒的全病毒进行筛选,成功地获得了抗H5N1型禽流感病毒血凝素蛋白HA的单抗.MDCK细胞微量中和试验表明,... 利用杆状病毒-昆虫细胞表达H5N1型禽流感病毒的血凝素蛋白(HA),纯化后的重组蛋白HA免疫小鼠并制备杂交瘤单克隆抗体,用H5N1型禽流感病毒的全病毒进行筛选,成功地获得了抗H5N1型禽流感病毒血凝素蛋白HA的单抗.MDCK细胞微量中和试验表明,单抗8G10D7可对clade2和clade9的H5N1型禽流感病毒起中和作用.Western-blot及血凝抑制实验进一步证明了该单抗的结合位点位于HA蛋白的HA1亚基上.鸡胚感染病毒预防试验结果表明,8G10D7对禽来源的和人来源的H5N1型禽流感病毒均可达到100%的保护率;在治疗试验组中,8G10D7对禽来源的病毒感染具有较高的保护率,可达100%,对人来源的H5N1型禽流感病毒最高也可达87.5%的保护率.该抗体的获得不仅为H5N1型高致病性禽流感病毒的预防和治疗带来了希望,同时其中和位点的发现也为以后亚单位疫苗的研制提供新的思路. 展开更多

关键词 H5N1型禽流感病毒 杆状病毒.昆虫细胞表达系统 单克隆抗体 微量中和 半数细胞培养物感染量 血凝抑制

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单克隆抗体S2C4对2型志贺毒素及其亚型毒性的中和作用(英文) 被引量：3

4

作者 焦永军 曾晓燕 +3 位作者 郭喜玲 史智扬 冯振卿 汪华 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2009年第6期736-742,共7页

纯化的2型志贺毒素(Shiga toxin2,Stx2)经福尔马林脱毒后免疫BALB/c小鼠制备Stx2单克隆抗体,用体外中和试验对具有中和活性的阳性抗体克隆进行初筛,对所获得的中和抗体的重、轻链同种型及结合特异性进行鉴定,其中和保护作用通过体内、... 纯化的2型志贺毒素(Shiga toxin2,Stx2)经福尔马林脱毒后免疫BALB/c小鼠制备Stx2单克隆抗体,用体外中和试验对具有中和活性的阳性抗体克隆进行初筛,对所获得的中和抗体的重、轻链同种型及结合特异性进行鉴定,其中和保护作用通过体内、体外中和试验加以验证,最后,中和抗体对Stx2亚型Stx2c和Stx2vha的中和谱用体内中和试验验证.结果显示,12株抗Stx2的阳性抗体克隆中,只有1株具有中和活性,命名为S2C4,其重、轻链同种型为G1/κ,其靶分子为Stx2的A亚单位,与Stx2的B亚单位或Stx1不结合.在体外中和试验中S2C4可有效中和Stx2对Vero细胞的杀伤作用,同样,S2C4可中和致死量的Stx2及其亚型Stx2c和Stx2vha对小鼠的毒性作用.该抗体有望成为治疗产志贺毒素大肠杆菌感染的候选分子. 展开更多

关键词 单克隆抗体S2C4 2型志贺毒素 中和作用 产志贺毒素大肠杆菌

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全人源抗狂犬病病毒G蛋白单链抗体制备及中和活性鉴定 被引量：5

5

作者 张倩倩 赵茜 +7 位作者 张晓 丁贵鹏 金秋 高畅 熊四平 陈玉平 朱进 冯振卿 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第7期927-931,共5页

目的:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,筛选针对狂犬病病毒G蛋白不同表位的单链抗体(scFv)并鉴定其中和活性。方法:分离130例经狂犬病疫苗免疫接种志愿者的外周血淋巴细胞,提取总RNA,逆转录制备cDNA,构建全人源抗狂犬病病毒scF... 目的:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,筛选针对狂犬病病毒G蛋白不同表位的单链抗体(scFv)并鉴定其中和活性。方法:分离130例经狂犬病疫苗免疫接种志愿者的外周血淋巴细胞,提取总RNA,逆转录制备cDNA,构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库。以纯化的狂犬病病毒G蛋白包板筛选,对阳性克隆进行可溶性表达,并鉴定中和活性。结果:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,库容为5.0×107,经核酸序列分析,证实插入片段为scFv。经过5轮筛选,从富集的次级抗体库中随机挑出140个克隆,通过phage-ELISA鉴定得到4株核酸序列不同的scFv抗体。经His-Trap纯化后进行中和活性鉴定,获得1株有中和活性的scFv,其中和效价为0.13 IU/mg。结论:构建全人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,获得1株具有中和活性的抗狂犬病病毒G蛋白scFv抗体,为进一步研发狂犬病治疗性抗体药物奠定了基础。 展开更多

关键词 狂犬病病毒G蛋白 噬菌体抗体库 单链抗体(scFv) 中和活性

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抗人生长转化因子15单克隆抗体制备及鉴定 被引量：5

6

作者 詹峰 曾晓燕 +4 位作者 张晓 周顺 徐言 张建平 焦永军 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期539-541,544,共4页

目的:制备抗人生长转化因子15(GDF15)单克隆抗体(mAb)并鉴定其特性。方法:构建GDF15原核表达载体pGEX-4T-2-gdf15,诱导表达并纯化GST-GDF15融合蛋白。以该融合蛋白免疫BALB/c小鼠,取小鼠的脾细胞与同系小鼠Sp2/0骨髓瘤细胞常规融合,依... 目的:制备抗人生长转化因子15(GDF15)单克隆抗体(mAb)并鉴定其特性。方法:构建GDF15原核表达载体pGEX-4T-2-gdf15,诱导表达并纯化GST-GDF15融合蛋白。以该融合蛋白免疫BALB/c小鼠,取小鼠的脾细胞与同系小鼠Sp2/0骨髓瘤细胞常规融合,依次进行阳性杂交瘤细胞株的筛选及亚克隆,最终获得稳定分泌抗GDF15 mAb杂交瘤细胞株。以间接ELISA法检测抗体效价;Western blot鉴定抗体特异性;免疫共沉淀法初步检测在肝癌患者血清中GDF15表达水平。结果:获得1株稳定分泌抗人GDF15 mAb杂交瘤细胞株,命名为9G3;抗体免疫球蛋白亚类为IgG1,轻链为κ型;免疫共沉淀及质谱分析证实抗GDF15 mAb9G3能与肝癌患者血清中GDF15蛋白特异性结合并且GDF15水平在肝癌患者血清中较正常人显著升高。结论:成功制备了抗人GDF15mAb,为后期肝癌早期诊断试剂盒的开发奠定了良好的基础。 展开更多

关键词 GDF15 单克隆抗体 HCC

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人源抗Trop-2抗体Fab的制备及条件优化 被引量：5

7

作者 王小英 林红 +8 位作者 张慧林 仇金荣 丁贵鹏 唐小军 陈汐敏 唐甜 刘琼琼 冯振卿 朱进 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期35-39,共5页

目的 :探讨人源抗Trop-2抗体片段Fab在大肠杆菌中的诱导表达,优化蛋白表达及纯化的条件。方法 :将含有抗Trop-2 Fab抗体基因的质粒转化宿主菌E.coli TOP10F′大肠杆菌,比较诱导前培养液更换对抗Trop-2 Fab片段表达量的影响;比较不同诱... 目的 :探讨人源抗Trop-2抗体片段Fab在大肠杆菌中的诱导表达,优化蛋白表达及纯化的条件。方法 :将含有抗Trop-2 Fab抗体基因的质粒转化宿主菌E.coli TOP10F′大肠杆菌,比较诱导前培养液更换对抗Trop-2 Fab片段表达量的影响;比较不同诱导温度、诱导时间及诱导前加入葡萄糖对蛋白表达的影响;大量表达的抗Trop-2 Fab经亲和层析纯化后,用免疫荧光和流式细胞术检测其免疫学特性。结果:在培养液中加入5 g/L的葡萄糖,人源抗Trop-2抗体Fab片段的表达产量明显增加;16℃的诱导温度比其它温度能表达更多的Fab分子;加诱导剂12 h,目的蛋白的表达量至峰值。结论:本实验结果为在原核系统中大量制备抗Trop-2抗体片段及后续的肿瘤靶向治疗提供了基础。 展开更多

关键词 人源抗Trop-2抗体片段 原核表达 免疫学检测

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鼻息肉患者血清抗EBV-LMP1抗体的检测及其临床意义 被引量：2

8

作者 陈仁杰 马俊 +3 位作者 张大为 毛圆 朱进 冯振卿 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第4期526-528,556,共4页

目的:检测鼻息肉患者血清抗Epstain-Barr病毒(EBV)潜伏膜蛋白1(LMP1)抗体并探讨其临床意义。方法:行功能性鼻内镜手术治疗的鼻息肉患者20例为实验组,健康自愿者20例为对照组。以谷胱甘肽-EBV-LMP1胞外区融合蛋白(GST-LMP1)为检测抗原,EL... 目的:检测鼻息肉患者血清抗Epstain-Barr病毒(EBV)潜伏膜蛋白1(LMP1)抗体并探讨其临床意义。方法:行功能性鼻内镜手术治疗的鼻息肉患者20例为实验组,健康自愿者20例为对照组。以谷胱甘肽-EBV-LMP1胞外区融合蛋白(GST-LMP1)为检测抗原,ELISA和Western blot检测健康自愿者和鼻息肉患者手术治疗前、治疗后第15、30、90、180天血清抗EBV-LMP1抗体。结果:ELISA检测鼻息肉患者和健康自愿者血清抗EBV-LMP1抗体水平分别为0.976±0.131、0.400±0.102,两组比较有统计学差异(P<0.01)。鼻息肉患者术前和术后第15、30、90、180天血清抗EBV-LMP1抗体水平分别为:0.976±0.131、0.921±0.138、0.899±0.168、0.576±0.144、0.521±0.117,术后第90、180天与术前比较,差异有统计学意义(P<0.01);但是术后第15、30天与术前比较,无统计学差异。Western blot检测鼻息肉患者术前血清抗体水平与术后第15、30天比较无统计学差异;但是与术后第90、180天比较有统计学差异(P<0.01)。结论:鼻息肉和EBV感染有关,鼻息肉患者血清抗EBV-LMP1抗体水平随着疾病的有效治疗而下降,可作为评价临床疗效的有效指标。 展开更多

关键词 鼻息肉 Epstain-Barr病毒 潜伏膜蛋白1 抗体 检测

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维甲酸纳米颗粒混悬剂的制备及对实验性增殖性玻璃体视网膜病变的预防作用 被引量：3

9

作者 段磊 夏强 +3 位作者 张晓佳 吴玉龙 许宁 顾宁 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第12期857-860,共4页

目的:制备维甲酸药物的纳米颗粒混悬剂,并探讨其对兔眼实验性增殖性玻璃体视网膜病变(PVR)的预防作用。方法:采用溶剂分散法制备了维甲酸纳米颗粒混悬剂并对制备条件及配方进行了优化;对维甲酸纳米颗粒混悬剂进行了冷冻干燥;用光子相关... 目的:制备维甲酸药物的纳米颗粒混悬剂,并探讨其对兔眼实验性增殖性玻璃体视网膜病变(PVR)的预防作用。方法:采用溶剂分散法制备了维甲酸纳米颗粒混悬剂并对制备条件及配方进行了优化;对维甲酸纳米颗粒混悬剂进行了冷冻干燥;用光子相关光谱(PCS)测定了冷冻干燥前后混悬剂中纳米粒子的平均粒径;透射电镜(TEM)观察其微观形貌;建立了兔眼PVR模型,并考察了维甲酸纳米颗粒混悬剂对PVR的预防作用。结果:混悬剂中维甲酸纳米粒子(RA-NP)的粒径保持在300～400nm之间,大都为完整的球形;PVR预防实验显示,在术后28天,用药组的视网膜脱离发生率较对照组明显减少,且有统计学差异(χ2=19.798,P<0.01),表明维甲酸纳米颗粒混悬剂能够有效的预防PVR的发生。结论:维甲酸纳米颗粒混悬剂有望成为一种新型的PVR治疗用药物载体。 展开更多

关键词 维甲酸 纳米颗粒混悬剂 增殖性玻璃体视网膜病变

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可内化的人源抗Met基因工程抗体Fab的亲和力成熟与特性分析 被引量：1

10

作者 朱进 赵萍 +4 位作者 焦永军 王昕 曹伯良 冯振卿 管晓虹 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2007年第1期73-79,共7页

应用噬菌体展示技术制备抗Met(HGF受体,一个与肿瘤发生、侵袭和转移相关原癌基因产物)特异性、高亲和力的全人Fab片段.Fab基因分三步合成,以从错配PCR突变库中筛选出的Fab基因可变区为模板,扩增VH和VL基因,分别与CH1、CL基因融合,合成Fd... 应用噬菌体展示技术制备抗Met(HGF受体,一个与肿瘤发生、侵袭和转移相关原癌基因产物)特异性、高亲和力的全人Fab片段.Fab基因分三步合成,以从错配PCR突变库中筛选出的Fab基因可变区为模板,扩增VH和VL基因,分别与CH1、CL基因融合,合成Fd和L基因,再拼接合成Fab基因,克隆于pComb3XSS中,构建Fab次级抗体库.经细胞筛选和固相筛选,获得高亲和力阳性克隆.工程菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和蛋白质印迹分析,在25ku和27ku出现预期大小蛋白质条带.Fab分子经流式细胞术、免疫沉淀、细胞免疫荧光检测,结果表明,Fab能够与S114和MKN45细胞膜上的Met胞外区特异性结合,而与阴性细胞NIH3T3不结合.抗体内化分析显示,Fab能够与标记肥皂草毒素(ZAP)的抗人IgG结合,并进入细胞内,抑制Met阳性细胞的生长,揭示该抗体能够与Met特异性结合,并且被细胞内化.该抗体有望成为肿瘤临床诊断或治疗的候选分子. 展开更多

关键词 肝细胞生长因子受体 噬菌体抗体库 亲和力成熟 内化抗体

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全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc融合抗体的制备及活性分析 被引量：2

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作者 高畅 张倩倩 +4 位作者 熊四平 唐小军 仇镇宁 冯振卿 朱进 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期741-744,749,共5页

目的:制备全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc融合抗体,并分析其结合活性。方法:构建全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc融合抗体原核表达载体,优化表达并纯化全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc融合抗体。以纯化的灭活狂犬病病毒包板,对纯化的抗体进行结合活性... 目的:制备全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc融合抗体,并分析其结合活性。方法:构建全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc融合抗体原核表达载体,优化表达并纯化全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc融合抗体。以纯化的灭活狂犬病病毒包板,对纯化的抗体进行结合活性分析。结果:构建全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc-pColdⅡ原核表达载体,经测序分析正确后,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,在加入浓度为0.5 mmol/L IPTG时,scFv-Fc融合抗体的表达较高,其分子量大小为57 000。纯化后的scFv-Fc融合抗体在1∶512的条件下仍可以较好地结合狂犬病病毒。结论:构建全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc-pColdⅡ原核表达载体,表达并纯化了scFv-Fc融合抗体,为研发狂犬病暴露后预防治疗性抗体药物奠定了基础。 展开更多

关键词 狂犬病病毒 全人源 scFv-Fc抗体

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抗人胰岛素样生长因子-1单克隆抗体的制备与鉴定 被引量：1

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作者 毕立清 刘莉 +3 位作者 程蕴琳 施有为 仇镇宁 姜苏蓉 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2008年第6期712-716,741,共6页

目的:制备稳定分泌抗人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞系,并对其分泌的mAb进行鉴定。方法:用纯化后的hIGF-1重组蛋白免疫Balb/c小鼠,利用杂交瘤细胞融合技术制备抗hIGF-1的mAb,用Western blot法鉴定mAb的特异性... 目的:制备稳定分泌抗人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞系,并对其分泌的mAb进行鉴定。方法:用纯化后的hIGF-1重组蛋白免疫Balb/c小鼠,利用杂交瘤细胞融合技术制备抗hIGF-1的mAb,用Western blot法鉴定mAb的特异性,用间接ELISA法检测mAb腹水效价及mAb的亲和力,杂交瘤细胞染色体分析,鉴定Ig亚类。结果:获得2株能稳定分泌抗hIGF-1的mAb杂交瘤细胞系,Western blot分析显示,该mAb能与具有生物学活性的成熟IGF-1蛋白结合。腹水mAb效价可达6×104。mAb相对亲和力为2.1×109/mol～7.8×109/mol。2株单抗属IgM亚类。染色体分析符合杂交瘤细胞特征。结论:成功制备出抗hIGF-1的2株mAb杂交瘤细胞,为进一步用于hIGF-1的临床检测和实验研究创造了条件。 展开更多

关键词 人胰岛素样生长因子-1 单克隆抗体 重组蛋白

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全人源抗狂犬病病毒糖蛋白抗体的制备及鉴定 被引量：2

13

作者 王晓蕾 朱进 +6 位作者 哈卓 张晓萍 杨岚 杨晓明 刘云成 Mason Lu 冯振卿 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2017年第2期160-164,共5页

目的:利用重组狂犬病病毒糖蛋白(RVG)免疫人源Ig M转基因小鼠,制备全人源抗重组RVG蛋白单克隆抗体,并对其免疫学特性进行初步鉴定。方法:以重组RVG蛋白作为抗原免疫人源Ig M转基因小鼠,采用杂交瘤技术制备筛选全人源抗重组RVG蛋白杂交... 目的:利用重组狂犬病病毒糖蛋白(RVG)免疫人源Ig M转基因小鼠,制备全人源抗重组RVG蛋白单克隆抗体,并对其免疫学特性进行初步鉴定。方法:以重组RVG蛋白作为抗原免疫人源Ig M转基因小鼠,采用杂交瘤技术制备筛选全人源抗重组RVG蛋白杂交瘤细胞株,双抗体夹心ELISA实验鉴定单抗的人源性及抗体类型,并对其特异性及与灭活狂犬病病毒CVS-11株的结合能力进行鉴定。结果:建立了5株稳定分泌抗重组RVG的全人源单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为5D1、6H11、9A3、15D6、19E6,均为人源Ig M免疫球蛋白,5株单抗均能特异性识别重组RVG蛋白,其中3株能与灭活狂犬病病毒CVS-11株特异性结合。结论:筛选制备了特异性全人源抗重组RVG蛋白的单克隆抗体,能与灭活狂犬病病毒CVS-11株特异性结合,为进一步研制用于狂犬病防治的抗体药物奠定了基础。 展开更多

关键词 人源Ig M转基因小鼠 狂犬病病毒糖蛋白 全人源单克隆抗体

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人高尔基体蛋白GP73基因的克隆、表达、单克隆抗体的制备及鉴定 被引量：1

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作者 徐言 曾晓燕 +3 位作者 张晓 金秋 张建平 焦永军 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2012年第3期301-305,共5页

目的:高尔基体蛋白73(Golgi protein 73,GP73)是新近发现的肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的重要血清学标志物。通过克隆、表达人GP73,制备抗GP73单克隆抗体并鉴定其特性。方法:克隆GP73基因,构建GP73原核表达载体pComb3XS... 目的:高尔基体蛋白73(Golgi protein 73,GP73)是新近发现的肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的重要血清学标志物。通过克隆、表达人GP73,制备抗GP73单克隆抗体并鉴定其特性。方法:克隆GP73基因,构建GP73原核表达载体pComb3XSS-GP73,诱导表达,以HisFF Trap亲和层析柱纯化GP73-6×His重组融合蛋白。以该融合蛋白免疫BALB/c小鼠,制备抗GP73单克隆抗体。以间接法ELISA检测抗体效价;Western blot鉴定抗体特异性;免疫共沉淀法初步检测肝癌患者血清中GP73表达水平。结果:成功表达并纯化了GP73-6×His重组蛋白;获得5株稳定分泌抗人GP73单克隆抗体杂交瘤细胞株;免疫共沉淀证实抗GP73单克隆抗体能与肝癌患者血清中GP73蛋白特异性结合,GP73水平在肝癌患者血清中较正常人显著升高。结论:成功制备了抗人GP73单克隆抗体,为后期建立检测人GP73的双抗体夹心ELISA方法打下基础。 展开更多

关键词 GP73 单克隆抗体 肝细胞性肝癌 肿瘤标志物

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人源抗EB病毒潜伏膜蛋白1特异性基因工程抗体Fab的筛选与特性 被引量：1

15

作者 毛圆 张大为 +5 位作者 曹清 唐小军 林红 陈仁杰 徐凛峰 冯振卿 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2012年第12期1646-1651,共6页

目的:应用噬菌体展示技术制备抗EB病毒编码的潜伏膜蛋白1(latert membrare protern 1,LMP1)特异性、高亲和力的全人抗体Fab片段。方法:利用稳定转染表达LMP1的SUNE-1细胞及原核表达的LMP1胞外区蛋白作为抗原对大容量人源Fab抗体库进行... 目的:应用噬菌体展示技术制备抗EB病毒编码的潜伏膜蛋白1(latert membrare protern 1,LMP1)特异性、高亲和力的全人抗体Fab片段。方法:利用稳定转染表达LMP1的SUNE-1细胞及原核表达的LMP1胞外区蛋白作为抗原对大容量人源Fab抗体库进行差减筛选及固相筛选,经过5轮细胞筛选和3轮固相筛选,随机挑选30个克隆经酶联免疫吸附法鉴定,阳性克隆进行可溶性表达,用LMP1阳性表达的人鼻咽癌细胞株HNE2/LMP1鉴定抗LMP1抗体Fab的结合活性。结果:Western blot、免疫荧光结果显示,从大容量人源Fab抗体库中筛选出1株抗LMP1抗体Fab,细胞ELISA、荧光激活细胞分类术、免疫荧光分析、免疫组化检测结果显示Fab与人鼻咽癌细胞表面LMP1分子有较好的结合活性。结论:从人源Fab抗体库中筛选的Fab抗体能够与鼻咽癌细胞表面LMP1分子特异性结合,为研制用于EBV相关肿瘤如鼻咽癌生物治疗的靶向药物,提供了候选分子。 展开更多

关键词 噬菌体抗体库 EB病毒 潜伏膜蛋白1 抗原结合片段 靶向治疗

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NP30/抗体检测试剂盒在云南大山区型血吸虫病流行区的现场应用

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作者 吴玉龙 仇镇宁 管晓虹 《医学研究生学报》 CAS 2008年第9期1006-1008,共3页

关键词 血吸虫病 NP30/抗体检测试剂盒 大山区型血吸虫病流行区 现场应用 免疫诊断

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抗体药物治疗黑色素瘤的现状及进展 被引量：4

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作者 徐婧雯 蒋惠慈 +1 位作者 陈汐敏 丁贵鹏 《中国药科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第3期259-266,共8页

黑色素瘤的抗体药物治疗方兴未艾,其中抗CTLA-4抗体(ipilimumab和tremelimumab)及抗PD-1抗体(nivolumab和lambrolizumab)均已完成或正在进行治疗黑色素瘤的Ⅲ期临床试验,针对其他靶点的多个抗体也处于临床试验或临床前研究阶段。本文就... 黑色素瘤的抗体药物治疗方兴未艾,其中抗CTLA-4抗体(ipilimumab和tremelimumab)及抗PD-1抗体(nivolumab和lambrolizumab)均已完成或正在进行治疗黑色素瘤的Ⅲ期临床试验,针对其他靶点的多个抗体也处于临床试验或临床前研究阶段。本文就抗体药物治疗黑色素瘤的现状及进展做一综述,为黑色素瘤的新药开发和临床治疗提供参考。 展开更多

关键词 黑色素瘤 免疫治疗 抗体药物 抗CTLA-4抗体 易普利单抗 抗PD-1抗体

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人源全分子抗c-Met抗体的制备及对鼻咽癌细胞生物学特性的影响 被引量：4

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作者 白璐月 刘金荣 +6 位作者 唐奇 熊四平 陈雅 杜银娟 周荧 朱进 陈仁杰 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2016年第6期687-692,共6页

目的 :利用基因工程技术制备全分子人源抗c-Met抗体,分析该抗体免疫学特性,并观察该全分子抗体对鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法:设计引物扩增抗c-Met Fab抗体的重轻链可变区序列,将其分别克隆到真核表达载体p FUSECHIg-h G1和... 目的 :利用基因工程技术制备全分子人源抗c-Met抗体,分析该抗体免疫学特性,并观察该全分子抗体对鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法:设计引物扩增抗c-Met Fab抗体的重轻链可变区序列,将其分别克隆到真核表达载体p FUSECHIg-h G1和p FUSE-CLIg-hκ中。转染真核细胞,表达产物用Protein A柱纯化。通过ELISA、Western blot和免疫荧光等方法鉴定该抗体的免疫学特性。CCK-8检测抗体对人鼻咽癌细胞增殖的抑制作用,划痕实验、Transwell侵袭实验分析抗体对人鼻咽癌细胞迁移和侵袭的影响。结果:成功重组全分子人源抗c-Met抗体的表达载体,获得的全分子抗体保留了与抗原的特异性结合活性。CCK-8实验中结果显示全分子抗体能抑制c-Met阳性鼻咽癌细胞CNE2和HONE1的增殖。细胞划痕和Transwell侵袭实验结果显示全分子抗体能抑制c-Met阳性细胞CNE2和HONE1的迁移和侵袭能力。结论:本研究成功制备人源全分子抗c-Met抗体,该抗体有明显的中和活性,为探索鼻咽癌分子靶向治疗奠定了基础。 展开更多

关键词 鼻咽癌 C-MET 人源抗体

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全人源抗狂犬病病毒单克隆抗体的制备与鉴定 被引量：5

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作者 张夏玲 孙见宇 +7 位作者 殷珏 李明 周亦凭 刘云成 李万波 朱进 冯振卿 Mason Lu 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2012年第6期739-744,共6页

目的:利用人源IgM转基因小鼠制备全人源抗狂犬病病毒单克隆抗体,并对其进行初步鉴定。方法:以灭活的狂犬病病毒CTN株作为抗原免疫人IgM转基因小鼠。采用杂交瘤技术结合酶联免疫吸附试验(ELISA)高通量交叉筛选技术(HTS)制备全人源抗狂犬... 目的:利用人源IgM转基因小鼠制备全人源抗狂犬病病毒单克隆抗体,并对其进行初步鉴定。方法:以灭活的狂犬病病毒CTN株作为抗原免疫人IgM转基因小鼠。采用杂交瘤技术结合酶联免疫吸附试验(ELISA)高通量交叉筛选技术(HTS)制备全人源抗狂犬病病毒单克隆抗体。通过双抗体夹心ELISA鉴定单抗的人源性和抗体型,间接ELISA、斑点杂交(Dot Blot)实验及Western blot检测单抗的特异性,BiaCore X-100测定单抗结合抗原的亲和力。结果:建立了2株稳定分泌抗狂犬病病毒人源性单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为9E3和9F2。双抗体夹心ELISA结果显示2株单抗均为人源性免疫球蛋白IgM型。间接ELISA、斑点杂交实验结果表明2株单抗均能特异性识别灭活的狂犬病病毒CTN株。Western blot结果显示2株单抗均能与狂犬病病毒糖蛋白特异性结合。2株单抗与狂犬病病毒CTN株抗原结合的亲和力分别为2.62×10-10mol/L、4.06×10-11mol/L。结论:筛选制备了2株特异性、高亲和力的全人源抗狂犬病病毒单克隆抗体。本研究为进一步筛选人源抗狂犬病病毒免疫预防性中和抗体及其免疫治疗的应用奠定了基础。 展开更多

关键词 人IgM转基因小鼠 狂犬病病毒 全人源单克隆抗体

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抗日本血吸虫单克隆抗体NP11-4人／鼠嵌合Fab抗体片段的制备及功能鉴定 被引量：2

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作者 顾春艳 李红 +9 位作者 任勇亚 许静 朱晓娟 李玉华 仇镇宁 王祝鸣 朱进 戚晓红 管晓虹 冯振卿 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2009年第7期913-919,共7页

目的:构建日本血吸虫单克隆抗体NP11-4的人/鼠嵌合Fab(cFab)抗体片段,并对cFab抗体片段结合活性进行鉴定。方法:用抗体框架区的通用引物PCR扩增抗日本血吸虫单克隆抗体NP11-4的VH及VL基因,测序分析其核苷酸序列。将测序正确的鼠源VH、V... 目的:构建日本血吸虫单克隆抗体NP11-4的人/鼠嵌合Fab(cFab)抗体片段,并对cFab抗体片段结合活性进行鉴定。方法:用抗体框架区的通用引物PCR扩增抗日本血吸虫单克隆抗体NP11-4的VH及VL基因,测序分析其核苷酸序列。将测序正确的鼠源VH、VL分别与人IgG1的CH1、CL通过Overlap PCR扩增Fd及全长L,再利用Overlap PCR以Fd和全长L基因为模板扩增cFab基因。将cFab基因片段克隆至载体pComb3XSS中构建表达载体pComb3XSS-Fab,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导进行蛋白可溶性表达。通过Westernblot和ELISA方法对cFab抗体片段进行检测。结果:构建出抗日本血吸虫单克隆抗体NP11-4 cFab表达载体,Westernblot结果证实在大肠杆菌Top10F′中表达出cFab可溶性抗体片段,ELISA结果显示cFab抗体片段与可溶性虫卵抗原(SEA)有较好的结合活性。结论:表达、纯化了抗日本血吸虫单克隆抗体NP11-4cFab抗体片段,cFab抗体片段具有与亲本抗体相同的抗原结合能力,为制备抗日本血吸虫人源化免疫毒素提供了技术贮备。 展开更多

关键词 日本血吸虫 可变区基因 嵌合Fab 构建 表达

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