目的建立一种针对微量样本(1×10^(4)细胞)的蛋白质组前处理流程,用于衰老小鼠单个窦卵泡的蛋白质组图谱绘制,并对窦卵泡的衰老图谱进行解析。方法利用293T细胞,通过对比不同的裂解液、酶切条件、超声处理方式等,建立针对1×10^...目的建立一种针对微量样本(1×10^(4)细胞)的蛋白质组前处理流程,用于衰老小鼠单个窦卵泡的蛋白质组图谱绘制,并对窦卵泡的衰老图谱进行解析。方法利用293T细胞,通过对比不同的裂解液、酶切条件、超声处理方式等,建立针对1×10^(4)数量级细胞样本(约1μg数量级蛋白质)的蛋白质组前处理流程。通过与商业化的样本前处理试剂盒(iST试剂盒和Ex极微量试剂盒)进行对比,从蛋白质和肽段鉴定重叠性、蛋白质整体亲/疏水性、蛋白质理论等电点以及蛋白质分子质量4方面对本研究所建立的样本前处理流程进行评估。以100,1000和100003种数量级小鼠原代脾和肝细胞样本对样本前处理流程的样本适用性进行评估。基于该样本前处理流程,结合timsTOF Pro 2超灵敏质谱仪,绘制青年(2月龄)、中年(12月龄)和老年(22月龄)小鼠的单个窦卵泡的蛋白质组图谱。通过差异表达蛋白质分析与蛋白质表达时间序列分析,寻找与年龄因素显著相关的蛋白质,解析窦卵泡的衰老图谱。结果本研究建立了一套针对1×10^(4)数量级细胞样本的蛋白质组学前处理流程,该流程仅需一步操作完成裂解和还原烷基化,酶切过程无需超声。即对于1×10^(4)数量级细胞样本,将裂解液中的脱氧胆酸钠浓度由1%提升至10%,可以使蛋白质平均鉴定种类从4089种增加到4389种,具有更佳的裂解效果(P<0.05);在裂解液中添加碳酸氢铵缓冲液(50 mmol·L^(-1),90μL),蛋白质平均鉴定种类从2579种显著提升至4389种(P<0.01);单胰蛋白酶与混合酶(Trypsin/Lys-C)具有相似的酶切效果,均能鉴定到约3950种蛋白质;将酶切时间由过夜缩短至0.5 h,蛋白质平均鉴定量由4299种提升至4632种(P<0.05),在节省时间的同时能获得更高的蛋白质鉴定量。与商业化试剂盒相比,本流程鉴定的蛋白质中约92.3%能被iST试剂盒或Ex极微量试剂盒鉴定,且在亲/疏水性、理论等电点和分子质量等理化性质上无明显偏向,显示出良好稳健性。随着样本中细胞数量增加,鉴定的蛋白质种类显著增加(100、1000和10000个细胞样本中,小鼠脾原代细胞分别鉴定到蛋白质525,1650和3210种,小鼠肝原代细胞分别鉴定到蛋白质366、1160和3590种,P<0.05)。采用该处理流程对青、中、老年小鼠的单个窦卵泡(每组3个窦卵泡)进行了蛋白质组鉴定,每个卵泡均可鉴定超过7500种蛋白质。基于该数据,本研究通过主成分分析发现,不同年龄阶段的窦卵泡在蛋白质表达状态上表现出明显差异,证实了年龄是影响卵泡生理状态的关键因素。此外,在衰老小鼠的卵泡中,发现与染色体分离相关的蛋白显著下调(P<0.01),提示衰老卵泡中可能存在染色体分离障碍以及减数分裂的失调。通过进一步分析,本研究共识别出739种与年龄显著相关的蛋白质,其中378种正相关,361种负相关。结论本研究为微量样本提供了一种低成本、易操作、高通量和高灵敏度的蛋白质组样本前处理流程;构建了不同年龄阶段小鼠单个窦卵泡的蛋白质组动态变化图谱,为卵泡衰老基础研究提供了高质量的数据资源,为探索卵巢衰老的潜在治疗靶标和促进生殖力提升的药物开发提供了新的研究思路。展开更多
血浆是血液的重要组成部分,它作为临床蛋白质组学研究的重要样本,蕴含着丰富的生理与病理信息,是发现疾病相关生物标志物的理想来源。蛋白质N-糖基化作为一种关键的翻译后修饰,广泛参与细胞间通讯、免疫调节和信号转导等生物学过程,其...血浆是血液的重要组成部分,它作为临床蛋白质组学研究的重要样本,蕴含着丰富的生理与病理信息,是发现疾病相关生物标志物的理想来源。蛋白质N-糖基化作为一种关键的翻译后修饰,广泛参与细胞间通讯、免疫调节和信号转导等生物学过程,其异常变化与肿瘤、自身免疫疾病和神经退行性疾病等多种病理状态密切相关。因此,N-糖基化蛋白质组学在生物标志物和药物靶点开发中具有重要价值。然而,由于N-糖肽在生物样本中的丰度较低,且质谱分析时易受高丰度非修饰肽段的信号抑制,因此,在质谱检测前对其进行高效富集是实现深度N-糖蛋白质组覆盖的关键挑战,特别是对于微量血浆样本目前尚缺乏深入研究。本工作针对微量血浆N-糖肽构建了一种高效富集方法和高灵敏度质谱分析策略,首先通过优化亲水相互作用色谱法(HILIC)填料固定相化学组成、孔径大小等关键参数与N-糖肽的洗脱梯度,得到具有高选择性的富集方案,并结合基于平行累积序列碎片技术(PASEF)高分辨质谱仪Tims TOF Pro 2与高质量精度的Orbitrap Lumos的双平台互补分析,显著提升了N-糖肽的鉴定深度,在仅使用20μg血浆肽段(等效0.5μL全血浆)的条件下,通过HILIC富集得到了2962条完整N-糖肽,显著提高了N-糖肽鉴定的灵敏度,成功填补了微量血浆N-糖肽富集技术的空白,也为基于血浆N-糖蛋白质组学的精准医学研究提供了可靠的分析平台,为疾病生物标志物的发现提供了技术支持。展开更多
文摘目的建立一种针对微量样本(1×10^(4)细胞)的蛋白质组前处理流程,用于衰老小鼠单个窦卵泡的蛋白质组图谱绘制,并对窦卵泡的衰老图谱进行解析。方法利用293T细胞,通过对比不同的裂解液、酶切条件、超声处理方式等,建立针对1×10^(4)数量级细胞样本(约1μg数量级蛋白质)的蛋白质组前处理流程。通过与商业化的样本前处理试剂盒(iST试剂盒和Ex极微量试剂盒)进行对比,从蛋白质和肽段鉴定重叠性、蛋白质整体亲/疏水性、蛋白质理论等电点以及蛋白质分子质量4方面对本研究所建立的样本前处理流程进行评估。以100,1000和100003种数量级小鼠原代脾和肝细胞样本对样本前处理流程的样本适用性进行评估。基于该样本前处理流程,结合timsTOF Pro 2超灵敏质谱仪,绘制青年(2月龄)、中年(12月龄)和老年(22月龄)小鼠的单个窦卵泡的蛋白质组图谱。通过差异表达蛋白质分析与蛋白质表达时间序列分析,寻找与年龄因素显著相关的蛋白质,解析窦卵泡的衰老图谱。结果本研究建立了一套针对1×10^(4)数量级细胞样本的蛋白质组学前处理流程,该流程仅需一步操作完成裂解和还原烷基化,酶切过程无需超声。即对于1×10^(4)数量级细胞样本,将裂解液中的脱氧胆酸钠浓度由1%提升至10%,可以使蛋白质平均鉴定种类从4089种增加到4389种,具有更佳的裂解效果(P<0.05);在裂解液中添加碳酸氢铵缓冲液(50 mmol·L^(-1),90μL),蛋白质平均鉴定种类从2579种显著提升至4389种(P<0.01);单胰蛋白酶与混合酶(Trypsin/Lys-C)具有相似的酶切效果,均能鉴定到约3950种蛋白质;将酶切时间由过夜缩短至0.5 h,蛋白质平均鉴定量由4299种提升至4632种(P<0.05),在节省时间的同时能获得更高的蛋白质鉴定量。与商业化试剂盒相比,本流程鉴定的蛋白质中约92.3%能被iST试剂盒或Ex极微量试剂盒鉴定,且在亲/疏水性、理论等电点和分子质量等理化性质上无明显偏向,显示出良好稳健性。随着样本中细胞数量增加,鉴定的蛋白质种类显著增加(100、1000和10000个细胞样本中,小鼠脾原代细胞分别鉴定到蛋白质525,1650和3210种,小鼠肝原代细胞分别鉴定到蛋白质366、1160和3590种,P<0.05)。采用该处理流程对青、中、老年小鼠的单个窦卵泡(每组3个窦卵泡)进行了蛋白质组鉴定,每个卵泡均可鉴定超过7500种蛋白质。基于该数据,本研究通过主成分分析发现,不同年龄阶段的窦卵泡在蛋白质表达状态上表现出明显差异,证实了年龄是影响卵泡生理状态的关键因素。此外,在衰老小鼠的卵泡中,发现与染色体分离相关的蛋白显著下调(P<0.01),提示衰老卵泡中可能存在染色体分离障碍以及减数分裂的失调。通过进一步分析,本研究共识别出739种与年龄显著相关的蛋白质,其中378种正相关,361种负相关。结论本研究为微量样本提供了一种低成本、易操作、高通量和高灵敏度的蛋白质组样本前处理流程;构建了不同年龄阶段小鼠单个窦卵泡的蛋白质组动态变化图谱,为卵泡衰老基础研究提供了高质量的数据资源,为探索卵巢衰老的潜在治疗靶标和促进生殖力提升的药物开发提供了新的研究思路。
文摘血浆是血液的重要组成部分,它作为临床蛋白质组学研究的重要样本,蕴含着丰富的生理与病理信息,是发现疾病相关生物标志物的理想来源。蛋白质N-糖基化作为一种关键的翻译后修饰,广泛参与细胞间通讯、免疫调节和信号转导等生物学过程,其异常变化与肿瘤、自身免疫疾病和神经退行性疾病等多种病理状态密切相关。因此,N-糖基化蛋白质组学在生物标志物和药物靶点开发中具有重要价值。然而,由于N-糖肽在生物样本中的丰度较低,且质谱分析时易受高丰度非修饰肽段的信号抑制,因此,在质谱检测前对其进行高效富集是实现深度N-糖蛋白质组覆盖的关键挑战,特别是对于微量血浆样本目前尚缺乏深入研究。本工作针对微量血浆N-糖肽构建了一种高效富集方法和高灵敏度质谱分析策略,首先通过优化亲水相互作用色谱法(HILIC)填料固定相化学组成、孔径大小等关键参数与N-糖肽的洗脱梯度,得到具有高选择性的富集方案,并结合基于平行累积序列碎片技术(PASEF)高分辨质谱仪Tims TOF Pro 2与高质量精度的Orbitrap Lumos的双平台互补分析,显著提升了N-糖肽的鉴定深度,在仅使用20μg血浆肽段(等效0.5μL全血浆)的条件下,通过HILIC富集得到了2962条完整N-糖肽,显著提高了N-糖肽鉴定的灵敏度,成功填补了微量血浆N-糖肽富集技术的空白,也为基于血浆N-糖蛋白质组学的精准医学研究提供了可靠的分析平台,为疾病生物标志物的发现提供了技术支持。
