应用蛋白质组学方法分析猪晶状体不同区域上皮细胞中蛋白质的表达差异 被引量：3

1

作者 罗琳 马璇 +3 位作者 张艳莉 刘炜 黎明涛 吴开力 《分析测试学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第3期17-21,共5页

应用蛋白质组学方法分析比较猪晶状体中央和周边上皮细胞的蛋白质表达差异。将32个正常猪晶状体前囊膜所附着于的上皮细胞分为中央和周边两部分,经二维凝胶电泳分离和凝胶考马斯亮兰染色,质谱(MALD I-TOF-MS)鉴定差异蛋白质斑点,并对鉴... 应用蛋白质组学方法分析比较猪晶状体中央和周边上皮细胞的蛋白质表达差异。将32个正常猪晶状体前囊膜所附着于的上皮细胞分为中央和周边两部分,经二维凝胶电泳分离和凝胶考马斯亮兰染色,质谱(MALD I-TOF-MS)鉴定差异蛋白质斑点,并对鉴定的蛋白质进行分类。结果显示来自中央与周边区域的猪晶体上皮细胞的蛋白在二维凝胶上分别有801和886个蛋白质斑点,鉴定出差异表达蛋白84个。差异表达的蛋白质在功能上有一定趋向性,主要涉及代谢、细胞骨架、信号转导/细胞周期/转录因子等。 展开更多

关键词 蛋白质组学 二维电泳 质谱 晶状体 上皮细胞

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蛋白质组学检测β-原肌球蛋白在结肠癌组织中的表达 被引量：4

2

作者 崔冀 康玉博 +4 位作者 黄帅 马晋平 蔡世荣 刘伟 黄奕华 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第8期1509-1512,共4页

目的:通过比较结肠腺癌与正常结肠黏膜的蛋白质组表达差异,寻找与结肠腺癌发生相关的蛋白质,筛选结肠癌诊断的分子标志物。方法:运用蛋白质组学技术,对8例结肠腺癌组织和8例正常结肠黏膜组织进行胶内差异双向电泳(2-D),选择差异表达超过... 目的:通过比较结肠腺癌与正常结肠黏膜的蛋白质组表达差异,寻找与结肠腺癌发生相关的蛋白质,筛选结肠癌诊断的分子标志物。方法:运用蛋白质组学技术,对8例结肠腺癌组织和8例正常结肠黏膜组织进行胶内差异双向电泳(2-D),选择差异表达超过2倍的蛋白质进行MALDI-TOF/TOF质谱分析和生物信息学分析,并对结肠癌组织中表达下调的蛋白β-原肌球蛋白(TMβ)进行Western blotting验证。结果:成功建立结肠腺癌和正常结肠黏膜的双向凝胶电泳图谱,结肠腺癌和正常黏膜组织凝胶电泳图谱中平均蛋白质斑点数分别为3289和3066,其中表达差异超过2倍的斑点共有31个,质谱分析和数据库检索共鉴定出18种蛋白质,包括cytoker-atin8、cytokeratin10、S100A6、TMβ、proteindisulfide isomerase等。从功能分析,这些差异蛋白与癌细胞的发生、增殖、分化、转移等相关;TMβ在结肠癌组织中的表达水平Western blotting结果与电泳结果一致。结论:蛋白质组学能有效地分离和鉴定结肠腺癌组织与正常结肠组织间的差异表达蛋白质,结肠癌组织中表达下降的TMβ,可能成为结肠癌诊断的分子标记物。 展开更多

关键词 结肠肿瘤 蛋白质组 原肌球蛋白

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骨肉瘤组织与良性骨肿瘤的比较蛋白质组学分析 被引量：4

3

作者 梁琼 李扬 +4 位作者 王连唐 刘郁林 罗灿桥 梁惠珍 黎明涛 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期1089-1093,共5页

目的:分析骨肉瘤与骨良性肿瘤差异蛋白质质点,寻找影响骨肉瘤恶性生物学行为的分子指标。方法:固相pH梯度双向凝胶电泳分离5例骨肉瘤组织与5例良性骨肿瘤组织总蛋白。Deep purple荧光染色,Im-ageMaster 2DE软件分析,对差异蛋白质点采用... 目的:分析骨肉瘤与骨良性肿瘤差异蛋白质质点,寻找影响骨肉瘤恶性生物学行为的分子指标。方法:固相pH梯度双向凝胶电泳分离5例骨肉瘤组织与5例良性骨肿瘤组织总蛋白。Deep purple荧光染色,Im-ageMaster 2DE软件分析,对差异蛋白质点采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱测定肽质指纹图谱并查询SWISS-PROT数据库。结果:获得重复性较好的双向电泳荧光染色图谱。图像分析检测骨肉瘤组织平均蛋白点数为1 386±101,良性骨肿瘤组织平均蛋白点数为1 270±202。初步鉴定出22个差异表达蛋白质点,其中15个在骨肉瘤中表达上调,以锌指蛋白133(zinc finger protein 133,Znf133)、laminB和T-复合多肽1(tailless complex poly-peptide 1,TCP-1)上调明显;7个在骨肉瘤中表达下调,其中蛋白激酶C抑制因子-1(protein kinase C inhibitor pro-tein 1,KCIP-1)表达缺失。结论:骨肉瘤组织与良性骨肿瘤的蛋白质表达存在明显差异,其中Znf133、laminB、TCP1、KCIP-1等可能在骨肉瘤的发生发展中发挥重要作用,有可能成为诊断骨肉瘤的分子标记物或治疗靶点。 展开更多

关键词 骨肉瘤 蛋白质组

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克罗恩病患者与健康人血清蛋白质组学比较初步研究 被引量：3

4

作者 康亮 黄美近 +4 位作者 杨祖立 王磊 刘炜 黎明涛 汪建平 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2008年第12期2433-2438,共6页

目的:应用蛋白质组学方法在患者血清中寻找与克罗恩病相关的蛋白质。方法:采取克罗恩病患者以及正常成人血清蛋白样本各4例,用不同的CyDye荧光染料标记后进行胶内差异双向凝胶电泳(2-D DIGE),并对获得的图谱进行分析及对差异蛋白质进行... 目的:应用蛋白质组学方法在患者血清中寻找与克罗恩病相关的蛋白质。方法:采取克罗恩病患者以及正常成人血清蛋白样本各4例,用不同的CyDye荧光染料标记后进行胶内差异双向凝胶电泳(2-D DIGE),并对获得的图谱进行分析及对差异蛋白质进行基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定和生物学信息分析。结果:通过2-D DIGE分析,发现了克罗恩病患者中存在29个表达异常蛋白质点,质谱分析和数据库检索共鉴定出22种蛋白质,包括SER/THR,CD45,APC等。结论:蛋白质组学能很好显示克罗恩病患者与正常人血清蛋白质表达差异,本研究鉴定的蛋白质可能为研究克罗恩病的生物学行为提供新的分子标记物。 展开更多

关键词 CROHN病 蛋白质组

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应用蛋白质组学的方法筛选胰腺干细胞标记物 被引量：1

5

作者 杨明 王春友 +3 位作者 刘涛 汪洋 刘炜 黎明涛 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2006年第6期540-547,共8页

探索利用蛋白质组学的方法筛选胰腺干细胞的标记物.通过大鼠胰腺大部分切除(Px)的方法建立胰腺增生模型,采用双向电泳(2DE)分离比较Px术后第3天大鼠增生胰腺组织与假手术(Sx)非增生胰腺组织蛋白质的表达谱差异,用基质辅助激光解吸离子... 探索利用蛋白质组学的方法筛选胰腺干细胞的标记物.通过大鼠胰腺大部分切除(Px)的方法建立胰腺增生模型,采用双向电泳(2DE)分离比较Px术后第3天大鼠增生胰腺组织与假手术(Sx)非增生胰腺组织蛋白质的表达谱差异,用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和肽质量指纹图谱(PMF)的方法对差异蛋白进行鉴定,进一步经生物信息学检索,筛选与胚胎发育和细胞分化相关的蛋白质分子.蛋白质印迹分析蛋白质HSP47、Vimentin在Px大鼠胰腺组织中的表达,以验证2DE的结果.2DE显示Sx和Px大鼠胰腺组织平均蛋白质点数分别为(1369±31)和(1315±28)个,其中共有91个蛋白质点出现1.5倍以上的表达差异.所有差异蛋白质点PMF鉴定出53种蛋白质,其中Vimentin,cytokeratin8(CK8),lymphocytecytosolicprotein1(L-plastin),heterogeneousnuclearribonucleoproteinA2/B1(hnRNPA2/B1)和L-arginine:glycineamidinotransferase(AGAT)与胚胎发育和细胞分化有关,这些蛋白质可能是胰腺干细胞潜在的候选标记物.总之,蛋白质组学的方法利用其高通量的特点能有效发现潜在的胰腺干细胞生物学标记物. 展开更多

关键词 蛋白质组学 胰腺干细胞 胰腺增生 分子标记物 VIMENTIN

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应用亲和磷酸蛋白质组学筛选氧化应激重塑型LPS通路的侯选信号分子 被引量：1

6

作者 邹志鹏 潘婷 +3 位作者 李煜生 刘炜 朱振宇 姜勇 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2007年第6期1189-1194,共6页

目的:研究低剂量LPS刺激的Thp-1细胞在有或无H2O2预处理时磷酸化蛋白组的差异,以初步筛选氧化应激重塑型LPS通路中的新信号分子。方法:使用PMA刺激Thp-1单核细胞36h使之分化成为成熟的巨噬细胞,静息36h后,先以等体积的培养基或100μmol/... 目的:研究低剂量LPS刺激的Thp-1细胞在有或无H2O2预处理时磷酸化蛋白组的差异,以初步筛选氧化应激重塑型LPS通路中的新信号分子。方法:使用PMA刺激Thp-1单核细胞36h使之分化成为成熟的巨噬细胞,静息36h后,先以等体积的培养基或100μmol/L H2O2刺激1h,再以培养基或10μg/L LPS刺激30min。采用PMAC(phosphoprotein metal affinity column)富集各组细胞的磷酸化蛋白质,经超滤除盐后进行二维凝胶电泳,比较LPS组和H2O2+LPS组的磷酸化蛋白图谱的差异,并挑选部分斑点进行质谱鉴定。结果:相对于LPS组(仅用LPS刺激的细胞),在H2O2+LPS组(LPS刺激前经H2O2提前处理的细胞)中,有29个磷酸化蛋白斑点在双向电泳图谱中表现出可重复的差异,其中,17个斑点发生了上调(包括新出现的斑点),12个发生了下调(包括消失的斑点)。我们已经鉴定出其中5个差异蛋白,这些蛋白参与多种多样的细胞过程例如蛋白质降解、信号转导和蛋白质折叠等。其中,在H2O2+LPS组中显著下调的proteasome beta-4亚基与LPS信号传递关系密切。结论:亲和磷酸蛋白组学有效减少了高丰度的结构蛋白的干扰并增加了信号分子检出的可能性。上述5个蛋白尤其是proteasome beta-4亚基可能是氧化应激重塑型LPS通路的重要调节分子。 展开更多

关键词 脂多糖类 电泳 氧化性应激 磷酸化蛋白质组学

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颅内动脉瘤患者血清蛋白组变化的研究 被引量：5

7

作者 朱永华 刘炜 +5 位作者 石忠松 刘少军 李明昌 黎明涛 潘伟生 黄正松 《中山大学学报（医学科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期652-656,共5页

【目的】寻找颅内动脉瘤患者血清中表达差异的蛋白。【方法】采集12例血清蛋白样本(颅内动脉瘤患者4例、脑挫裂伤患者4例及正常成人本4例)用不同的CyDye染料交叉标记后依次进行双向胶内差异凝胶电泳(2-DDIGE)、图像分析及基质辅助激光... 【目的】寻找颅内动脉瘤患者血清中表达差异的蛋白。【方法】采集12例血清蛋白样本(颅内动脉瘤患者4例、脑挫裂伤患者4例及正常成人本4例)用不同的CyDye染料交叉标记后依次进行双向胶内差异凝胶电泳(2-DDIGE)、图像分析及基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定。【结果】发现胶号为1119的蛋白质点,在颅内动脉瘤患者血清中比正常成人组表达升高1.82倍(P<0.05),而在脑挫裂伤患者血清中与正常成人的表达差异没有统计学意义(P>0.05)。该蛋白点经质谱鉴定为结合珠蛋白。【结论】结合珠蛋白在颅内动脉瘤患者血清中表达升高,可能参与了颅内动脉瘤的形成及扩张。 展开更多

关键词 双向胶内差异凝胶电泳 图像分析 血清蛋白 颅内动脉瘤 基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱 结合珠蛋白

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交叉酶切联合MALDI-TOF/MS分析重组蛋白二硫键分布的方法建立 被引量：2

8

作者 徐祖敏 程锐 +5 位作者 杨霞 杨中汉 刘少军 黎明涛 蔡卫斌 高国全 《中山大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期93-99,共7页

以Kringle环为分子模型,应用MALDI-TOF/MS联合特异性蛋白酶酶切技术,探讨建立蛋白质二硫键分布和定位分析的研究方法。采用pET22b(+)原核表达体系诱导表达重组人纤溶酶原K5蛋白(rhK5),经Ni2+-NTA resin亲和层析纯化,并通过SDS-PAGE和Wes... 以Kringle环为分子模型,应用MALDI-TOF/MS联合特异性蛋白酶酶切技术,探讨建立蛋白质二硫键分布和定位分析的研究方法。采用pET22b(+)原核表达体系诱导表达重组人纤溶酶原K5蛋白(rhK5),经Ni2+-NTA resin亲和层析纯化,并通过SDS-PAGE和Western-blot进行初步鉴定;采用MTT法分析rhK5对微血管内皮细胞的抑制活性;联合应用交叉酶切(Trypsin Gold单切或Trypsin Gold及Endoproteinase ASP-N双酶切)和基质辅助激光解析-飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS)分析rhK5的二硫键分布;并应用生物信息学方法和圆二色谱法进一步验证rhK5二级结构。应用原核体系高效表达具有生物活性的rhK5蛋白,经交叉酶切联合MAL-DI-TOF/MS证实rhK5中的6个半胱氨酸正确配对形成了3对二硫键(Cys462:541,Cys483:524和Cys512:536),圆二色谱法测定发现rhK5为典型的β折叠型结构。上述研究结果为分析基因工程重组蛋白质中半胱氨酸配对及二硫键分布提供了方法学基础。 展开更多

关键词 基因工程 重组蛋白 蛋白质结构 二硫键 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱

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正常人眼小梁组织的二维凝胶电泳及质谱分析 被引量：5

9

作者 彭蔚 余敏斌 +3 位作者 吴开力 马璇 刘炜 杨扬帆 《中山大学学报（医学科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期672-676,共5页

【目的】应用二维电泳和质谱对正常人眼小梁组织蛋白质组的进行初步分析。【方法】采用二维凝胶电泳对正常人眼小梁组织进行蛋白分离和图像分析。分别用(7cm×8cm、13cm×16cm、18cm×16cm)3种不同尺寸大小凝胶分离蛋白,并... 【目的】应用二维电泳和质谱对正常人眼小梁组织蛋白质组的进行初步分析。【方法】采用二维凝胶电泳对正常人眼小梁组织进行蛋白分离和图像分析。分别用(7cm×8cm、13cm×16cm、18cm×16cm)3种不同尺寸大小凝胶分离蛋白,并结合基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析及数据库搜索从而鉴定部分蛋白质斑点。【结果】建立小梁组织蛋白样品处理及二维凝胶电泳的实验条件及方法,获得正常人眼小梁组织二维凝胶电泳蛋白图谱。3种不同尺寸大小凝胶的蛋白质分离斑点数分别为230个、875个、1213个。质谱鉴定出14个蛋白点。【结论】完成人眼小梁组织蛋白质的二维电泳凝胶“标准”图谱并作质谱分析的方法性探索对同类研究具有参考意义,为分析小梁组织在青光眼发病过程中蛋白质表达改变研究提供了新的方法及途径。 展开更多

关键词 小梁组织 二维凝胶电泳 质谱 蛋白图谱

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兔眼组织的二维凝胶电泳分析 被引量：2

10

作者 马璇 刘炜 +3 位作者 彭蔚 张艳莉 黎明涛 吴开力 《眼科新进展》 CAS 2004年第5期337-340,共4页

目的　应用二维凝胶电泳对不同兔眼组织的蛋白进行初步分析 ,探索开展眼蛋白质组学的方法。方法　分离正常兔眼的不同组织 ,经样本初处理后 ,进行二维凝胶电泳和凝胶银染色 ,然后分析电泳图谱 ,比较各组织蛋白的分离效果。结果　成功建... 目的　应用二维凝胶电泳对不同兔眼组织的蛋白进行初步分析 ,探索开展眼蛋白质组学的方法。方法　分离正常兔眼的不同组织 ,经样本初处理后 ,进行二维凝胶电泳和凝胶银染色 ,然后分析电泳图谱 ,比较各组织蛋白的分离效果。结果　成功建立对各眼组织进行样本处理、二维凝胶电泳的基本方法和条件。得到兔结膜、角膜内皮、虹膜、晶状体前囊膜、视网膜的二维凝胶电泳图谱 ,各组织蛋白在小胶上均能显示 4 0 0个以上的斑点。晶状体中央和周边上皮细胞的凝胶图谱呈现出数十个斑点的差异。结论　二维凝胶电泳是分析眼部组织蛋白质的一种好方法 ,不同眼部组织的蛋白在组成、含量、分布等方面的差异可通过二维凝胶电泳图谱清晰显示出来。 展开更多

关键词 二维凝胶电泳 兔 眼组织

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CD45在克罗恩病患者血清中的表达 被引量：3

11

作者 康亮 杨祖立 +4 位作者 王磊 黄美近 刘炜 黎明涛 汪建平 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期259-263,共5页

目的应用蛋白质组学方法在患者血清中寻找与克罗恩病相关的蛋白质。方法采取克罗恩病患者以及正常成人血清蛋白样本各4例,用不同的CyDye荧光染料标记后进行胶内差异双向凝胶电泳(2-DDIGE),并对获得的图谱进行分析及对差异蛋白质进行基... 目的应用蛋白质组学方法在患者血清中寻找与克罗恩病相关的蛋白质。方法采取克罗恩病患者以及正常成人血清蛋白样本各4例,用不同的CyDye荧光染料标记后进行胶内差异双向凝胶电泳(2-DDIGE),并对获得的图谱进行分析及对差异蛋白质进行基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱鉴定。结果通过2-DDIGE分析,发现克罗恩病患者中存在29个表达异常蛋白质点,其中胶号为973的蛋白质点,在克罗恩病患者患者血清中比正常成人组表达升高2.55倍(P<0.05),该蛋白点经质谱鉴定为CD45。结论CD45在克罗恩病患者血清的高表达提示在克罗恩病的病程中免疫系统失衡可能起着一定作用。 展开更多

关键词 克罗恩病 双向胶内差异凝胶电泳 基质辅助激光解吸离子 质谱 CD45

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色霉素对多巴胺能神经元的保护作用 被引量：1

12

作者 王文雅 黎明涛 +1 位作者 饶进军 朱小南 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第4期522-526,共5页

目的研究色霉素对MPP+诱导凋亡的多巴胺能神经元的保护作用。方法体外培养的胎鼠腹侧中脑神经元,以MPP+引起多巴胺能神经元凋亡作为帕金森病的细胞模型,Hoechst 33258荧光核染色法检测神经元的凋亡情况,免疫细胞化学方法检测多巴胺能神... 目的研究色霉素对MPP+诱导凋亡的多巴胺能神经元的保护作用。方法体外培养的胎鼠腹侧中脑神经元,以MPP+引起多巴胺能神经元凋亡作为帕金森病的细胞模型,Hoechst 33258荧光核染色法检测神经元的凋亡情况,免疫细胞化学方法检测多巴胺能神经元内磷酸化Tau水平。结果10μmol·L-1 MPP+可以升高Tau磷酸化水平,诱导神经元发生典型的凋亡。而色霉素通过抑制Tau磷酸化,减少神经元凋亡,使TH-阳性细胞数目增加。结论色霉素可以通过抑制Tau磷酸化而对MPP+诱导凋亡的多巴胺能神经元发挥保护作用,色霉素可能用于临床防治帕金森病等神经退行性疾病。 展开更多

关键词 色霉素 MPP+ 多巴胺能神经元 细胞培养 帕金森病 TAU

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分泌型磷脂酶A_2非酶活性依赖的神经元保护作用

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作者 黎明涛 马驰 +11 位作者 谢元斌 叶彦颖 朱小南 闫霞 施乐瑜 袁衡新 陈汝筑 李文明 皮荣标 韩怡凡 Igor Krizaj 黄守坚 《中山大学学报（医学科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2003年第6期523-527,共5页

【目的】鉴定中华眼镜蛇(Najanajaatra)蛇毒中的神经保护因子,研究其抗神经元凋亡作用机制。【方法】连续柱层析法分离、纯化蛇毒神经保护因子。用EdmanN-末端测序法取得蛋白质一级序列,BLAST软件进行蛋白质鉴定。使用低钾诱导体外培养... 【目的】鉴定中华眼镜蛇(Najanajaatra)蛇毒中的神经保护因子,研究其抗神经元凋亡作用机制。【方法】连续柱层析法分离、纯化蛇毒神经保护因子。用EdmanN-末端测序法取得蛋白质一级序列,BLAST软件进行蛋白质鉴定。使用低钾诱导体外培养小脑颗粒神经元凋亡模型,研究其神经元保护作用。【结果】从中华眼镜蛇蛇毒中分离出一种,可浓度依赖性地抑制低钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡。神经保护因子(Cobravenomneu-ronalprotectivefactor,CVNPF)此神经保护因子N-末端20个氨基酸序列为NLYQFKNMIQCTVPSRSWWD-,BLAST序列同源比对确定该保护因子为中华眼镜蛇分泌型磷脂酶A2(secretedphospholipaseA2,sPLA2)。进一步发现来源于蜂毒、莫桑比克眼镜蛇(Njajanajamossambica)蛇毒、西部菱斑响尾蛇(Crotalusatroxalso)蛇毒的sPLA2也对小脑颗粒神经元具有保护作用;其作用不为磷脂酶A2酶活性抑制剂7,7-Dimethyleicosadienoicacid(DEDA)和Manoalide阻断。【结论】CVNPF属于sPLA2。多种sPLA2可以抗神经元凋亡,其保护机制与磷脂酶A2的酶活性无关。 展开更多

关键词 分泌型磷脂酶A2 非酶活性依赖 神经元 保护作用 蛇毒 神经保护因子

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ATM失活诱导GADD45α依赖的小脑颗粒神经元凋亡

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作者 吴森斌 伍健伟 +5 位作者 马莹 赵凡一 曹东芳 梁建峰 胡坤华 袁忠民 《中山大学学报（医学科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2023年第5期758-767,共10页

【目的】探究共济失调毛细血管扩张突变(ATM)激酶失活诱导神经元凋亡的具体分子机制。【方法】体外成熟7 d的小脑颗粒神经元(CGNs)分别用含25 mmol/L KCl(25 K)培养基、5 mmol/L KCl(5 K)培养基和含ATM特异性抑制剂(Ku55933,10μmol/L;K... 【目的】探究共济失调毛细血管扩张突变(ATM)激酶失活诱导神经元凋亡的具体分子机制。【方法】体外成熟7 d的小脑颗粒神经元(CGNs)分别用含25 mmol/L KCl(25 K)培养基、5 mmol/L KCl(5 K)培养基和含ATM特异性抑制剂(Ku55933,10μmol/L;Ku60019,15μmol/L)的25 K培养基后进行免疫印迹检测ATM、Caspase3、Cleaved Caspase-3的蛋白表达水平或培养8 h后进行Hoechst染色分析。在C6细胞和CGNs中转染ATM和GADD45α特异性siRNA,q-PCR和免疫印迹验证其干扰效率。体外成熟5 d的CGNs通过磷酸钙转染ATM特异性siRNA和pCMV-EGFP 48 h后进行Hoechst染色和凋亡分析。体外成熟7 d的CGNs用含ATM特异性抑制剂的25 K培养基培养8 h后进行全转录组测序、差异表达基因鉴定和通路富集分析。体外成熟5 d的CGNs通过磷酸钙转染GADD45α特异性siRNA和pCMV-EGFP 48 h,用含15μmol/L Ku6的25 K培养基处理8 h或5 K培养基处理8 h后进行Hoechst染色和凋亡分析。【结果】与25 K组相比,5 K处理组和ATM特异性抑制剂处理组的CGNs ATM蛋白表达降低、Cleaved Caspase-3蛋白表达增加、细胞核固缩率增加。C6细胞和CGNs中转染ATM和GADD45α特异性siRNA后有效降低ATM和GADD45α的mRNA和蛋白的表达。与对照相比,CGNs转染ATM特异性siRNA后,细胞核固缩率升高。在Ku55933处理组中鉴定出835个基因表达上调,848个基因表达下调;在Ku60019处理组中鉴定出454个基因表达上调,314个基因表达下调;274个基因在Ku5处理组和Ku6处理组中共同上调,179个基因在Ku5处理组和Ku6处理组中共同下调,其中ATM下游靶标GADD45α表达上调;通路富集结果显示TNF信号通路、NF-κB信号通路和凋亡信号通路等被显著富集。与对照相比,抑制剂处理组和5K组GADD45α的mRNA和蛋白表达均升高。与对照相比,转染GADD45α特异性siRNA后用含15μmol/L Ku60019的25 K培养基处理8 h或5 K培养基处理后的CGNs细胞核固缩率降低。【结论】ATM活性降低诱导GADD45α依赖的神经元凋亡。 展开更多

关键词 神经元凋亡 共济失调毛细血管扩张突发 生长停滞和DNA损伤诱导蛋白45α 转录组测序

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