目的·构建5-羟色胺化(serotonylation,5-HT化)修饰蛋白研究体系,为寻找和发现5-HT化修饰蛋白提供方法学基础。方法·基于癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库和基因型-组织表达(Genotype-Tissue Expression,GT...目的·构建5-羟色胺化(serotonylation,5-HT化)修饰蛋白研究体系,为寻找和发现5-HT化修饰蛋白提供方法学基础。方法·基于癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库和基因型-组织表达(Genotype-Tissue Expression,GTEx)数据库分析编码5-HT化修饰的关键酶的基因转谷氨酰胺酶2(transglutaminase 2,TGM2)和编码5-羟色胺转运体(serotonin transporter,SERT)的基因溶质载体家族6(solute carrier family 6,SLC6A4)在正常生理组织和肿瘤组织中的表达情况。利用5-羟色胺盐酸盐分步合成5-羟色胺衍生物5-PT(5-propargyltryptamide),并利用傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、核磁共振氢谱1H-NMR、核磁共振碳谱13C-NMR和飞行时间质谱(TOF-MS)等手段进行分析和结构表征。通过流式细胞术检测5-PT在人胰腺癌细胞AsPC-1和小鼠免疫细胞[包括CD4^(+)T细胞、CD8^(+)T细胞以及髓系巨噬细胞(bone marrow derived macrophage,BMDM)]的胞内摄入情况。通过点击化学反应、免疫共沉淀以及质谱分析技术寻找和鉴定发生5-HT化修饰的蛋白,并进行京都基因和基因组数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析。结果·生物信息学相关分析显示TGM2和SLC6A4在生物体内正常组织和肿瘤组织广泛存在。流式细胞术结果显示合成的5-PT可通过细胞表面的SERT摄取进入人胰腺癌细胞AsPC-1和小鼠免疫细胞(包括CD4^(+)T细胞、CD8^(+)T细胞以及BMDM)。质谱分析数据显示,在各个细胞蛋白的5-PT处理组都富集到了丰富的5-HT化修饰蛋白。KEGG富集分析显示这些蛋白参与糖酵解和氨基酸合成相关通路。结论·利用合成的5-PT成功构建了5-HT化修饰蛋白的研究体系,在不同的细胞中富集得到多个5-HT化修饰的蛋白,为研究蛋白的5-HT化修饰及其功能提供了相对简单高效的研究手段。展开更多
目的·从原子层面探索KRAS^(G12D/R68G)突变诱发肿瘤细胞对MRTX1133耐药的机制。方法·从RCSB蛋白质数据库(Protein Data Bank,PDB)获取KRAS^(G12D)与MRTX1133相互作用复合物的晶体结构数据。使用PyMOL软件将KRAS第68位的精氨...目的·从原子层面探索KRAS^(G12D/R68G)突变诱发肿瘤细胞对MRTX1133耐药的机制。方法·从RCSB蛋白质数据库(Protein Data Bank,PDB)获取KRAS^(G12D)与MRTX1133相互作用复合物的晶体结构数据。使用PyMOL软件将KRAS第68位的精氨酸突变为甘氨酸(R68G),构建KRAS^(G12D)和KRAS^(G12D/R68G)分别与MRTX1133相互作用体系的初始构象。使用LEaP程序构建带有周期性边界的模拟体系,应用ff19SB力场计算KRAS中标准氨基酸的力场参数,应用GAFF(general AMBER force field)力场计算MRTX1133的力场参数,应用TIP3P(intermolecular potential three point)力场计算水分子的力场参数。使用Amber软件对体系进行能量最小化,体系升温至300 K后,进行等温等容平衡和等温等压运动的计算。使用cpptraj轨迹分析软件计算每个体系的均方根偏差(root mean square deviation,RMSD)、体系中每个氨基酸的均方根波动(root mean square fluctuation,RMSF),对轨迹进行主成分分析(principal component analysis,PCA),计算MRTX1133和GDP的溶剂可及表面积(solvent-accessible surface area,SASA)。测量区域之间氢键形成的数量,并计算氨基酸之间的动态交叉相关矩阵(dynamic cross-correlation matrix,DCCM)。结果·RMSD分析显示KRAS^(G12D/R68G)体系中KRAS的变化幅度大于KRAS^(G12D)体系。RMSF分析显示KRAS^(G12D/R68G)体系中KRAS的SwitchⅠ和SwitchⅡ区域的波动幅度明显大于KRAS^(G12D)体系。PCA分析提示KRAS^(G12D/R68G)体系中KRAS的SwitchⅠ和SwitchⅡ区域更多地处于向外打开的状态。两体系中SwitchⅠ与P-loop之间距离以及SwitchⅡ与P-loop之间距离的比较显示了KRAS^(G12D/R68G)体系中的GDP和MRTX1133的结合口袋与KRAS^(G12D)体系相比均显著扩大。SASA分析显示KRAS^(G12D/R68G)体系中的GDP和MRTX1133的溶剂暴露面积与KRAS^(G12D)体系相比均明显增加。DCCM分析显示KRAS^(G12D/R68G)体系中SwitchⅠ、SwitchⅡ和P-loop区域之间存在更多的分离运动。结论·KRAS^(G12D/R68G)突变破坏了SwitchⅠ和SwitchⅡ区域之间的相互作用,导致了SwitchⅠ和SwitchⅡ的分离,继而导致MRTX1133的结合口袋开放,增加了MRTX1133的溶剂暴露面积,从而加速了MRTX1133的解离,最终导致KRAS^(G12D/R68G)对MRTX1133耐药。展开更多
文摘目的·构建5-羟色胺化(serotonylation,5-HT化)修饰蛋白研究体系,为寻找和发现5-HT化修饰蛋白提供方法学基础。方法·基于癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库和基因型-组织表达(Genotype-Tissue Expression,GTEx)数据库分析编码5-HT化修饰的关键酶的基因转谷氨酰胺酶2(transglutaminase 2,TGM2)和编码5-羟色胺转运体(serotonin transporter,SERT)的基因溶质载体家族6(solute carrier family 6,SLC6A4)在正常生理组织和肿瘤组织中的表达情况。利用5-羟色胺盐酸盐分步合成5-羟色胺衍生物5-PT(5-propargyltryptamide),并利用傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、核磁共振氢谱1H-NMR、核磁共振碳谱13C-NMR和飞行时间质谱(TOF-MS)等手段进行分析和结构表征。通过流式细胞术检测5-PT在人胰腺癌细胞AsPC-1和小鼠免疫细胞[包括CD4^(+)T细胞、CD8^(+)T细胞以及髓系巨噬细胞(bone marrow derived macrophage,BMDM)]的胞内摄入情况。通过点击化学反应、免疫共沉淀以及质谱分析技术寻找和鉴定发生5-HT化修饰的蛋白,并进行京都基因和基因组数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析。结果·生物信息学相关分析显示TGM2和SLC6A4在生物体内正常组织和肿瘤组织广泛存在。流式细胞术结果显示合成的5-PT可通过细胞表面的SERT摄取进入人胰腺癌细胞AsPC-1和小鼠免疫细胞(包括CD4^(+)T细胞、CD8^(+)T细胞以及BMDM)。质谱分析数据显示,在各个细胞蛋白的5-PT处理组都富集到了丰富的5-HT化修饰蛋白。KEGG富集分析显示这些蛋白参与糖酵解和氨基酸合成相关通路。结论·利用合成的5-PT成功构建了5-HT化修饰蛋白的研究体系,在不同的细胞中富集得到多个5-HT化修饰的蛋白,为研究蛋白的5-HT化修饰及其功能提供了相对简单高效的研究手段。
文摘目的·从原子层面探索KRAS^(G12D/R68G)突变诱发肿瘤细胞对MRTX1133耐药的机制。方法·从RCSB蛋白质数据库(Protein Data Bank,PDB)获取KRAS^(G12D)与MRTX1133相互作用复合物的晶体结构数据。使用PyMOL软件将KRAS第68位的精氨酸突变为甘氨酸(R68G),构建KRAS^(G12D)和KRAS^(G12D/R68G)分别与MRTX1133相互作用体系的初始构象。使用LEaP程序构建带有周期性边界的模拟体系,应用ff19SB力场计算KRAS中标准氨基酸的力场参数,应用GAFF(general AMBER force field)力场计算MRTX1133的力场参数,应用TIP3P(intermolecular potential three point)力场计算水分子的力场参数。使用Amber软件对体系进行能量最小化,体系升温至300 K后,进行等温等容平衡和等温等压运动的计算。使用cpptraj轨迹分析软件计算每个体系的均方根偏差(root mean square deviation,RMSD)、体系中每个氨基酸的均方根波动(root mean square fluctuation,RMSF),对轨迹进行主成分分析(principal component analysis,PCA),计算MRTX1133和GDP的溶剂可及表面积(solvent-accessible surface area,SASA)。测量区域之间氢键形成的数量,并计算氨基酸之间的动态交叉相关矩阵(dynamic cross-correlation matrix,DCCM)。结果·RMSD分析显示KRAS^(G12D/R68G)体系中KRAS的变化幅度大于KRAS^(G12D)体系。RMSF分析显示KRAS^(G12D/R68G)体系中KRAS的SwitchⅠ和SwitchⅡ区域的波动幅度明显大于KRAS^(G12D)体系。PCA分析提示KRAS^(G12D/R68G)体系中KRAS的SwitchⅠ和SwitchⅡ区域更多地处于向外打开的状态。两体系中SwitchⅠ与P-loop之间距离以及SwitchⅡ与P-loop之间距离的比较显示了KRAS^(G12D/R68G)体系中的GDP和MRTX1133的结合口袋与KRAS^(G12D)体系相比均显著扩大。SASA分析显示KRAS^(G12D/R68G)体系中的GDP和MRTX1133的溶剂暴露面积与KRAS^(G12D)体系相比均明显增加。DCCM分析显示KRAS^(G12D/R68G)体系中SwitchⅠ、SwitchⅡ和P-loop区域之间存在更多的分离运动。结论·KRAS^(G12D/R68G)突变破坏了SwitchⅠ和SwitchⅡ区域之间的相互作用,导致了SwitchⅠ和SwitchⅡ的分离,继而导致MRTX1133的结合口袋开放,增加了MRTX1133的溶剂暴露面积,从而加速了MRTX1133的解离,最终导致KRAS^(G12D/R68G)对MRTX1133耐药。
