BPOZ基因纯合缺失ES细胞系的建立及其生长和分化研究

1

作者 项佑贵 党素英 +5 位作者 许勇 王龙 孙霞 费俭 傅继梁 王铸钢 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第6期801-806,共6页

研究BPOZ基因缺失对细胞生长和分化的影响.以高浓度的G418筛选BPOZ基因杂合缺失型ES细胞,PCR鉴定抗高浓度G418细胞克隆基因型;半定量RTPCR分析3种基因型ES细胞BPOZ基因的表达情况,分析3种基因型ES细胞Oct34基因的表达以明确ES细胞分化状... 研究BPOZ基因缺失对细胞生长和分化的影响.以高浓度的G418筛选BPOZ基因杂合缺失型ES细胞,PCR鉴定抗高浓度G418细胞克隆基因型;半定量RTPCR分析3种基因型ES细胞BPOZ基因的表达情况,分析3种基因型ES细胞Oct34基因的表达以明确ES细胞分化状态.利用3种基因型ES细胞进行细胞生长曲线和3H胸嘧啶核苷参入实验比较其生长速度和增殖能力.以裸鼠荷瘤实验和类胚体形成实验比较BPOZ基因纯合缺失型ES细胞与野生型ES细胞生长分化能力.结果表明,筛选获得两个BPOZ基因剔除的纯合ES细胞克隆;筛选得到的纯合ES细胞中BPOZ基因表达完全缺失,细胞处未分化状态.与野生型ES细胞相比,BPOZ基因纯合缺失型ES细胞生长受抑,增殖能力减弱.BPOZ基因纯合缺失型ES细胞可分化形成类胚体和具备来自3个不同胚层的细胞和组织的畸胎瘤.BPOZ基因剔除使ES细胞生长受抑,对ES细胞分化发育没有明显影响. 展开更多

关键词 BPOZ 基因纯合缺失 ES细胞 生长 分化

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核糖核酸酶Onconase的稀释复性条件优化研究 被引量：3

2

作者 郭红 徐殿胜 王庆诚 《化学与生物工程》 CAS 2013年第10期57-60,共4页

采用稀释复性方法从包涵体中复性得到有活力的Onconase蛋白,并与传统的醋酸沉淀复性方法进行了比较,考察了复性温度、尿素浓度、氧化型谷胱甘肽(GSSG)加入时间对复性效果的影响。结果表明,在最佳复性温度为4℃、采用最佳复性体系(先加G... 采用稀释复性方法从包涵体中复性得到有活力的Onconase蛋白,并与传统的醋酸沉淀复性方法进行了比较,考察了复性温度、尿素浓度、氧化型谷胱甘肽(GSSG)加入时间对复性效果的影响。结果表明,在最佳复性温度为4℃、采用最佳复性体系(先加GSSG的含2mol·L-1尿素的稀释复性缓冲溶液)时,复性纯化后Onconase含量和回收率明显高于醋酸沉淀复性法。 展开更多

关键词 核糖核酸酶 包涵体 稀释复性 分离纯化

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骨保护素(Opg)基因敲除小鼠发生高转换型骨质疏松和动脉钙化(英文) 被引量：26

3

作者 许勇 杨桦 +7 位作者 乔建瓯 李西华 严兰珍 王龙 徐国江 费俭 傅继粱 王铸钢 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2007年第3期260-266,共7页

骨质疏松以及动脉钙化均是危害极大的临床常见病变,骨保护素(OPG)可能是联系两者的分子之一.构建替换型载体pXpPNT-OPG,利用同源重组,将编码前3个蛋白质结构域的小鼠Opg基因组第二外显子序列剔除掉.通过胚胎干细胞(ES)基因打靶获得了正... 骨质疏松以及动脉钙化均是危害极大的临床常见病变,骨保护素(OPG)可能是联系两者的分子之一.构建替换型载体pXpPNT-OPG,利用同源重组,将编码前3个蛋白质结构域的小鼠Opg基因组第二外显子序列剔除掉.通过胚胎干细胞(ES)基因打靶获得了正确重组的ES细胞克隆,ES细胞显微注射后获得嵌合体小鼠,交配传代获得杂合子和纯合子小鼠.RT-PCR和蛋白质印迹实验结果显示,纯合子小鼠没有Opg基因的表达.纯合子小鼠骨量丢失明显,骨生物力学指标明显下降,发生严重的骨质疏松,此外,还有50%以上的纯合子小鼠在早期出现动脉中层钙化.小鼠破骨功能亢进,与此同时,成熟成骨细胞数量增加,矿化功能强于野生型.Opg基因缺失小鼠骨中钙和磷大量流失,而血清中水平没有变化,这提示钙磷代谢异常不是OPG缺失导致动脉钙化的原因.对建立的Opg基因敲除小鼠模型进一步深入的研究,将有助于说明动脉钙化和骨质疏松症相互联系的分子机制,为防治骨质疏松症和动脉钙化的并发提供理论基础支持. 展开更多

关键词 骨保护素(Opg)基因敲除小鼠 骨质疏松 动脉钙化 骨转换 钙磷代谢

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利用CRISPR/Cas系统快速高效构建血友病乙小鼠模型 被引量：10

4

作者 汪启翰 怀聪 +4 位作者 孙瑞林 庄华 陈红岩 费俭 卢大儒 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2015年第11期1143-1148,共6页

血友病乙是由凝血因子Ⅸ(FactorⅨ,FⅨ)缺乏或功能缺陷导致的出血性疾病,为伴X染色体隐性遗传病。小鼠模型对于血友病乙的研究具有十分重要的意义,而基因组编辑技术又为小鼠模型的构建提供了一种快捷而且高效的途径。本文利用CRISPR/Ca... 血友病乙是由凝血因子Ⅸ(FactorⅨ,FⅨ)缺乏或功能缺陷导致的出血性疾病,为伴X染色体隐性遗传病。小鼠模型对于血友病乙的研究具有十分重要的意义,而基因组编辑技术又为小鼠模型的构建提供了一种快捷而且高效的途径。本文利用CRISPR/Cas系统,在小鼠FⅨ基因第8外显子上选择靶位点,将Cas9 m RNA和带有靶位点的sg RNA显微注射到C57BL/6品系小鼠的受精卵中,获得基因修饰的小鼠。利用高分辨率熔解曲线分析(High resolution melting,HRM)技术进行精确基因分型,并通过测序验证,在60只小鼠中,总共有51只小鼠的靶位点发生了突变,突变率高达85%,其中雄鼠的突变率为79.5%,雌鼠的突变率为95.2%;未检测到非目标位置的基因编辑脱靶。凝血活性实验显示,突变小鼠的FⅨ活性值(FactorⅨcoagulant activity,FⅨ:C)是非突变小鼠的6.82%,大大低于非突变小鼠,表明突变小鼠的凝血活性缺失。本研究表明,利用CRISPR/Cas系统成功构建了人类血友病乙遗传病小鼠模型。 展开更多

关键词 血友病乙 CRISPR/Cas系统 基因组编辑 小鼠模型

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Adiponectin基因剔除LacZ基因敲入小鼠模型的建立 被引量：6

5

作者 任维华 李西华 +10 位作者 王芳 乔建瓯 党素英 孔辉 王龙 陆顺元 孙霞 徐国江 傅继梁 费俭 王铸钢 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2006年第9期846-853,共8页

adiponectin是脂肪细胞特异分泌的一种活性蛋白质,具有增加胰岛素敏感性、抗炎及抗动脉硬化等活性.建立adiponectin基因剔除β-半乳糖苷酶基因(LacZ)敲入小鼠模型,可为整体动物水平研究adiponectin基因功能及其表达调控机制等提供理想工... adiponectin是脂肪细胞特异分泌的一种活性蛋白质,具有增加胰岛素敏感性、抗炎及抗动脉硬化等活性.建立adiponectin基因剔除β-半乳糖苷酶基因(LacZ)敲入小鼠模型,可为整体动物水平研究adiponectin基因功能及其表达调控机制等提供理想工具.根据生物信息学方法获得adiponectin基因组序列,设计基因剔除及敲入策略,在adiponectin基因第2和第3号外显子剔除的同时,在其ATG和信号肽序列后顺接LacZ基因完整编码序列,构建完成了Adipo-LacZ-XpPNT基因剔除质粒.通过电穿孔将打靶质粒转入ES细胞,以G418和ganciclovir进行药物筛选,获得药物抗性的ES细胞克隆,PCR和DNA印迹鉴定出正确同源重组克隆.将同源重组的ES细胞克隆注入小鼠囊胚得到嵌合体小鼠,嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠交配产生杂合子小鼠,杂合子间交配获得adiponectin基因剔除LacZ基因敲入纯合子小鼠.经RT-PCR、RNA印迹和ELISA检测证实纯合子小鼠脂肪和血清中adiponectin基因表达呈阴性.RT-PCR、RNA印迹及蛋白质印迹检测发现,LacZ基因在突变小鼠脂肪组织中有特异性表达,其表达谱与内源性adiponectin基因的表达谱一致.但在脂肪组织及外周血中未能检测到LacZ活性,且血清中LacZ蛋白亦呈阴性.由此成功建立了adiponectin基因完全灭活及LacZ基因以内源性adiponectin基因表达谱表达的小鼠模型,为进一步研究该基因功能及其表达调控创造了有利条件. 展开更多

关键词 ADIPONECTIN 基因剔除 β-半乳糖苷酶基因(LacZ) 基因敲入

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慢病毒载体介导IκB激酶-α(IKKα)基因RNA干扰转基因小鼠的制备 被引量：4

6

作者 杨志峰 王龙 +6 位作者 杨生生 匡颖 陈欢 徐国江 蔡在龙 王铸钢 毛积芳 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2007年第2期215-221,共7页

IκB激酶-α(IKKα)的功能与淋巴形成和乳腺发育相关,在乳腺肿瘤中观察到IKKα蛋白的过量表达.应用小鼠受精卵卵周隙注射慢病毒载体的方式,建立IKKα基因RNAi转基因小鼠模型,为在体内研究IKKα基因的生物学功能及其与肿瘤发生的关系创... IκB激酶-α(IKKα)的功能与淋巴形成和乳腺发育相关,在乳腺肿瘤中观察到IKKα蛋白的过量表达.应用小鼠受精卵卵周隙注射慢病毒载体的方式,建立IKKα基因RNAi转基因小鼠模型,为在体内研究IKKα基因的生物学功能及其与肿瘤发生的关系创造条件.实验构建了针对IKKα基因RNAi(剔降)的慢病毒载体,并将载体导入小鼠受精卵卵周隙,获得携带该载体的转基因小鼠模型,经PCR鉴定首建鼠阳性率为15%.转基因小鼠外周血细胞IKKαmRNA表达量明显降低.初步表型观察分析,IKKα基因RNAi小鼠发育正常,进一步的分析工作正在进行中. 展开更多

关键词 IKKα基因 慢病毒载体 RNA干扰 转基因小鼠

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BPOZ基因剔除小鼠模型的建立 被引量：1

7

作者 项佑贵 孙霞 +9 位作者 王龙 严兰珍 杨桦 刘伟 许勇 徐国江 王一 费俭 傅继梁 王铸钢 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2004年第7期616-621,共6页

BPOZ是在卵巢癌等肿瘤组织中表达下调的细胞生长抑制基因 ,建立BPOZ基因剔除小鼠模型 ,可以为在体研究BPOZ基因的生物学功能及其与肿瘤发生的关系创造条件 .运用生物信息学手段确定小鼠BPOZ基因组序列 ,设计基因剔除策略 ,构建完成了基... BPOZ是在卵巢癌等肿瘤组织中表达下调的细胞生长抑制基因 ,建立BPOZ基因剔除小鼠模型 ,可以为在体研究BPOZ基因的生物学功能及其与肿瘤发生的关系创造条件 .运用生物信息学手段确定小鼠BPOZ基因组序列 ,设计基因剔除策略 ,构建完成了基因剔除载体XpPNT BPOZ .以电穿孔方法将基因剔除载体导入ES细胞 ,用G4 18和Ganciclovoir进行正负筛选 ,获得抵抗克隆 ,PCR和DNA印迹鉴定出正确同源重组的ES细胞克隆 .将同源重组的ES细胞注入小鼠囊胚 ,获得嵌合体小鼠 .嵌合体小鼠与C5 7BL/ 6J小鼠交配后获得Aguoti毛色的小鼠30只 ,其中 15只为BPOZ基因剔除杂合子小鼠 ,阳性率为 5 0 % .在雌雄杂合子交配的后代中获得纯合子小鼠 .初步的表型观察发现BPOZ基因剔除小鼠发育正常 ,有繁殖能力 ,进一步的表型分析工作正在进行之中 . 展开更多

关键词 BPOZ基因 细胞生长抑制基因 基因剔除

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小鼠性激素结合球蛋白条件基因打靶载体的构建 被引量：1

8

作者 王越 金镇 +1 位作者 孙磊 郑晋华 《中国医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第3期203-208,213,共7页

目的构建小鼠性激素结合球蛋白(Shbg)条件基因打靶载体。方法运用ET克隆的方法构建Shbg基因第4-7号外显子两侧插入loxp位点的条件性剔除载体。首先以BAC DNA为模板克隆出Shbg及其上、下游基因并打靶质粒载体(p BR322-MKAB),利用该质粒和... 目的构建小鼠性激素结合球蛋白(Shbg)条件基因打靶载体。方法运用ET克隆的方法构建Shbg基因第4-7号外显子两侧插入loxp位点的条件性剔除载体。首先以BAC DNA为模板克隆出Shbg及其上、下游基因并打靶质粒载体(p BR322-MKAB),利用该质粒和BAC克隆,通过同源重组方式,获得套取质粒(p BR322-Shbg-Re);再分别以PL452及PL451为模板扩增出含Neo片段,经过再一轮的Red/ET重组成功实现条件性基因敲除打靶载体(p BR322-MK-SHBG-cko)的构建。结果经多个限制性内切酶酶切鉴定和测序证实,构建的p BR322-MK-AB、p BR322-Shbg-Re、SHBG-Ln重组质粒和Shbg条件基因打靶载体(p BR322-MK-SHBG-cko)结构正确,与设计相符。结论成功构建了小鼠Shbg条件基因打靶载体,为后续Shbg基因条件敲除小鼠模型的构建奠定了基础。 展开更多

关键词 性激素结合球蛋白 条件性基因敲除 载体 Red/ET重组

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多形性腺瘤基因1与唾液腺肿瘤 被引量：4

9

作者 杨雯珺 张陈平 +1 位作者 赵旭东 王铸钢 《国外医学（口腔医学分册）》 2003年第5期359-361,共3页

近年来学者发现,多形性腺瘤基因1的激活和表达与多形性腺瘤及其他唾液液肿瘤的发生密切相关。多形性腺瘤基因1具有转录因子活性,通过对下游靶基因的表达调控而发挥生物学功能。对多形性腺瘤基因1及其相关基因的功能以及其在多形性腺瘤... 近年来学者发现,多形性腺瘤基因1的激活和表达与多形性腺瘤及其他唾液液肿瘤的发生密切相关。多形性腺瘤基因1具有转录因子活性,通过对下游靶基因的表达调控而发挥生物学功能。对多形性腺瘤基因1及其相关基因的功能以及其在多形性腺瘤发病机制中的作用研究,在口腔颌面肿瘤领域具普遍指导意义。 展开更多

关键词 唾液腺肿瘤 多形性腺瘤基因1 发病机制 基因表达

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瞬时性受体电位通道香草酸受体亚型6基因敲除小鼠模型的建立

10

作者 叶添文 郑晋华 +3 位作者 安静 郭清河 陈方经 陈爱民 《第二军医大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期10-15,共6页

目的建立瞬时性受体电位通道香草酸受体亚型6(Trpv6)基因敲除小鼠模型,为在体研究Trpv6的生物学功能及其与骨代谢关系奠定基础。方法从Ensembl数据库中获得小鼠Trpv6基因组序列。设计基因敲除策略,构建基因敲除载体pBR322-MK-Trpv6。以... 目的建立瞬时性受体电位通道香草酸受体亚型6(Trpv6)基因敲除小鼠模型,为在体研究Trpv6的生物学功能及其与骨代谢关系奠定基础。方法从Ensembl数据库中获得小鼠Trpv6基因组序列。设计基因敲除策略,构建基因敲除载体pBR322-MK-Trpv6。以电穿孔方法将基因敲除载体导入胚胎多能干细胞(ES细胞),用G418和Ganciclovoir进行正负筛选,获得双抗性克隆。PCR鉴定出正确同源重组的ES细胞克隆。将正确同源重组的ES细胞注射到C57BL/6J小鼠的囊胚中,获得嵌合体小鼠。挑选嵌合率在50%的雄鼠与C57BL/6J小鼠交配,获得的灰鼠经PCR鉴定为杂合子小鼠。杂合子小鼠交配后获得纯合子小鼠。结果成功构建了打靶载体pBR322-MK-Trpv6。电穿孔后,共获得24个正确同源重组的克隆,同源重组效率为25%。同源重组的克隆经显微注射后,共获得4只嵌合率大于50%的雄鼠。嵌合鼠与C57BL/6J小鼠交配,获得57只来源于ES细胞的灰鼠,PCR鉴定证实其中17只为杂合子小鼠,阳性率为29.8%。杂合子小鼠交配获得纯合子小鼠。经蛋白质印迹分析证实纯合子小鼠无Trpv6蛋白的表达。结论成功建立了Trpv6基因敲除小鼠模型,其中纯合子小鼠未出现胚胎致死现象。 展开更多

关键词 Trpv6基因 基因敲除小鼠 骨重建

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睾丸间质细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的建立

11

作者 刘德鸿 沈丽萍 +3 位作者 蔡蕾 王津津 匡颖 孙宁 《临床小儿外科杂志》 CAS 2013年第3期201-204,共4页

目的苗勒氏管激素受体-2（anti—mullerianhormonereceptor-2，Amhr2）是睾丸间质细胞中的特异性标志分子，我们构建了Amhr2基因启动子介导的睾丸间质细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠（Amhr2一Cre）。方法采用显微注射法将7．1kb的... 目的苗勒氏管激素受体-2（anti—mullerianhormonereceptor-2，Amhr2）是睾丸间质细胞中的特异性标志分子，我们构建了Amhr2基因启动子介导的睾丸间质细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠（Amhr2一Cre）。方法采用显微注射法将7．1kb的转基因片段导入小鼠基因组，获得子代小鼠睾丸组织进行PCR检测，再将转基因小鼠与ROSA26报告小鼠交配，利用LaeZ染色对Amhr2-Cre双转基因进行检测。结果获得子代Amhr2-Cre转基因小鼠经PCR检测显示，睾丸间质细胞中Cre重组酶介导的Amhr2基因发生重组；LacZ染色进一步表明，Cre重组酶在睾丸间质细胞中特异性表达，并介导ROSA位点LoxP序列间的重组。结论建立的睾丸间质细胞特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠在睾丸组织中具有一定的组织特异性，并能在体内成功介导这些睾丸间质细胞基因组上LoxP位点间的重组，是一种研制在睾丸特定细胞中特异性基因剔除小鼠的良好遗传工具小鼠。 展开更多

关键词 睾丸 间质细胞 动物实验 基因表达

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转Notch1基因T淋巴细胞白血病双荧光示踪斑马鱼模型的建立及鉴定 被引量：4

12

作者 卿恺 陈芳源 +3 位作者 沈莉菁 林文洁 孙瑞林 钟济华 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期257-262,279,共7页

目的在血管内皮增强型绿色荧光蛋白标记的斑马鱼系(fli1-EGFP)中,转入Rag2启动子驱动的人源性截短型Notch1基因(ICN1),从中筛选并鉴定发生急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)的斑马鱼,建立稳定传代的红绿双色示踪的T-ALL斑马鱼疾病模型。方法构... 目的在血管内皮增强型绿色荧光蛋白标记的斑马鱼系(fli1-EGFP)中,转入Rag2启动子驱动的人源性截短型Notch1基因(ICN1),从中筛选并鉴定发生急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)的斑马鱼,建立稳定传代的红绿双色示踪的T-ALL斑马鱼疾病模型。方法构建Rag2-ICN1-EGFP质粒,显微注射到斑马鱼胚胎的单细胞期,利用荧光体视显微镜筛选F0代,并建立稳定传代的转基因鱼系。通过荧光体视显微镜、RT-PCR、Western blotting验证ICN1 mRNA和蛋白的表达,并利用流式细胞术、外周血涂片方法鉴定T-ALL斑马鱼模型的表型。结果在867条显微注射重组质粒的斑马鱼中,鉴定发现有20条(2.3%)转基因阳性斑马鱼,为F0代转基因斑马鱼,其中雄鱼9条,雌鱼11条。在已性成熟的F0代成鱼之间采取一对一形式交配,产下F1代,通过荧光体视显微镜、RT-PCR、Western blotting在大体观、mRNA以及蛋白水平验证了ICN1的表达;流式细胞术和外周血涂片结果显示,转基因F1代斑马鱼与fli1-EGFP斑马鱼相比,红细胞比例显著降低,淋巴细胞比例明显增高。结论成功构建转Notch1基因红绿双色示踪的T-ALL斑马鱼模型,为深入探讨Notch在促进T-ALL发生中的调控机制以及利用这种疾病模型进行高通量的活体药物筛选提供了研究平台。 展开更多

关键词 NOTCH1 急性T淋巴细胞白血病 斑马鱼 双荧光示踪

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四倍体补偿技术的建立及其应用 被引量：2

13

作者 匡颖 孙霞 +4 位作者 邓涛 卢希彬 孙瑞林 王铸钢 费俭 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2008年第3期304-311,共8页

常规基因剔除小鼠的获得主要是利用ES细胞的全能性先获得嵌合体小鼠,再利用ES细胞的生殖系传递能力,通过嵌合体与野生型小鼠的交配获得杂合子小鼠.而四倍体补偿技术则可绕过嵌合体小鼠阶段,直接获得基因修饰杂合子小鼠.利用电融合技术和... 常规基因剔除小鼠的获得主要是利用ES细胞的全能性先获得嵌合体小鼠,再利用ES细胞的生殖系传递能力,通过嵌合体与野生型小鼠的交配获得杂合子小鼠.而四倍体补偿技术则可绕过嵌合体小鼠阶段,直接获得基因修饰杂合子小鼠.利用电融合技术和Piezoelectric microinjection显微注射技术建立了四倍体补偿技术,小鼠四倍体胚胎的获得率(电融合率)为(93.01±1.37)%,经体外培养囊胚形成率为(82.49±2.08)%.通过显微注射方法将2种129品系小鼠来源的ES细胞(CJ7和SCR012)注射到四倍体囊胚腔中,获得了完全ES细胞来源的小鼠,ES鼠的获得率分别为2.7%和8.3%.经微卫星DNA检测,成体小鼠的10个被检测组织均为129小鼠来源的.同时,也利用基因修饰的ES细胞进行了研究,获得了2种基因修饰的完全ES细胞来源的杂合子小鼠,部分小鼠具有繁殖能力,经繁育已获得了纯合子,其中凝血因子Ⅷ基因敲除小鼠获得了预期的血友病小鼠表型.上述结果说明四倍体补偿技术可应用于基因修饰小鼠的制备. 展开更多

关键词 四倍体补偿技术 ES鼠 基因修饰 近交系ES细胞

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一种新型转基因斑马鱼毒物检测系统的建立 被引量：7

14

作者 纪喜文 田雪 徐殿胜 《化学与生物工程》 CAS 2010年第9期69-72,共4页

利用转基因技术成功建立一套绿色荧光蛋白(GFP)转基因斑马鱼毒物检测系统。选用芳香烃反应元件AHRDtk片段和pFRMwg+plasmid载体,通过酶切、连接和PCR鉴定等程序成功构建载体DNA,然后通过显微注射转入斑马鱼,经不断传代和筛选得到稳定的... 利用转基因技术成功建立一套绿色荧光蛋白(GFP)转基因斑马鱼毒物检测系统。选用芳香烃反应元件AHRDtk片段和pFRMwg+plasmid载体,通过酶切、连接和PCR鉴定等程序成功构建载体DNA,然后通过显微注射转入斑马鱼,经不断传代和筛选得到稳定的、受芳香烃反应元件AHRDtk控制的转基因斑马鱼,可用于水环境中毒物的检测。 展开更多

关键词 转基因 斑马鱼 毒物检测 绿色荧光蛋白

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GLUT4-Cre转基因模型建立与Cre酶特异性表达

15

作者 孔辉 骆惠均 +4 位作者 陈玉英 王龙 陆振虞 费俭 王铸钢 《上海第二医科大学学报》 CSCD 2004年第10期789-792,832,共5页

目的 建立骨骼肌和脂肪组织特异性表达Cre重组酶基因的转基因小鼠,以期在上述组织细胞中实现相关基因的条件性剔除。方法 选择人葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)基因的启动子驱动Cre重组酶的特异性表达,利用基因重组技术,构建GLUT4-Cre转基因表... 目的 建立骨骼肌和脂肪组织特异性表达Cre重组酶基因的转基因小鼠,以期在上述组织细胞中实现相关基因的条件性剔除。方法 选择人葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)基因的启动子驱动Cre重组酶的特异性表达,利用基因重组技术,构建GLUT4-Cre转基因表达质粒。通过显微注射法将该质粒导入小鼠受精卵细胞核,获得的新生鼠经PCR和Southern杂交方法进行基因型的分析鉴定,常规方法培育、传代转基因鼠。用RT-PCR和免疫组化法对Cre酶在阳性转基因鼠体内mRNA和蛋白表达水平进行检测。结果 获得5只阳性转基因首建鼠,其中3只已建系并稳定传代。在脑、脂肪组织中检测到Cre基因表达,而心肌、骨骼肌及肝脏组织中未检出转基因表达。结论 成功构建了在脑、脂肪组织中特异性表达Cre的转基因鼠,为研究与2型糖尿病、胰岛素抵抗等相关的条件性基因剔除小鼠模型的建立奠定了基础。 展开更多

关键词 特异性表达 GLUT4 脂肪组织 阳性 转基因鼠 骨骼肌 质粒 CRE重组酶 CRE基因 建系

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RNA干扰-转录后水平的基因沉默

16

作者 谭轶 费照亮 +1 位作者 费俭 王铸钢 《上海第二医科大学学报》 CSCD 2004年第7期583-586,593,共5页

随着人类基因组计划的初步完成,生命科学也随之进入后基因组计划的时代。在各种研究基因功能的方法中,RNA水平使目的基因沉默无疑是目前研究的新点和热点,特别是双链RNA(dsRNA)介导的转录后水平的基因沉默(PTGS),更是快速关闭基因的途径... 随着人类基因组计划的初步完成,生命科学也随之进入后基因组计划的时代。在各种研究基因功能的方法中,RNA水平使目的基因沉默无疑是目前研究的新点和热点,特别是双链RNA(dsRNA)介导的转录后水平的基因沉默(PTGS),更是快速关闭基因的途径,目前在植物、线虫、果蝇和小鼠早期胚胎中均有发现和证实。这一现象的发现和应用将有助于基因功能及其在信号传导、病毒抵御机制等方面的研究,并有可能开创基因治疗的新模式。 展开更多

关键词 RNA干扰 基因转录 基因沉默 PTGS 基因治疗

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抗小鼠PLRP1多克隆抗体的制备以及特异性鉴定和应用(英文)

17

作者 任建科 沈嘉娟 +1 位作者 盛哲津 费俭 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2008年第12期1410-1416,共7页

小鼠胰泡细胞表达和分泌一种被称为胰甘油三脂酶(PTL)的脂肪酶,主要参与食物来源的甘油三脂的消化吸收,胰泡细胞同时也表达胰脂肪酶相关蛋白1(PLRP1),它同PTL具有很高的同源性.为了研究PLRP1的生物学功能,需要制备其抗体.应用谷胱甘肽S... 小鼠胰泡细胞表达和分泌一种被称为胰甘油三脂酶(PTL)的脂肪酶,主要参与食物来源的甘油三脂的消化吸收,胰泡细胞同时也表达胰脂肪酶相关蛋白1(PLRP1),它同PTL具有很高的同源性.为了研究PLRP1的生物学功能,需要制备其抗体.应用谷胱甘肽S-转移酶(GST)表达系统表达了GST融合蛋白,亲和纯化后用以免疫新西兰大白兔,获得了抗PLRP1的多克隆抗体.免疫印迹分析表明,该多克隆抗血清能检测出0.6ng的融合蛋白抗原以及在3μg的小鼠胰液提取物中检测出PLRP1蛋白.在证明抗体的特异性方面,尝试了一种新的方法:用PLRP1基因剔除的小鼠作为阴性对照,通过免疫印迹和免疫组化实验证明了该多克隆抗血清具有很高的特异性.进一步的研究发现,进食能促进胰腺中PLRP1的外分泌,这表明PLRP1可能在食物的消化过程中具有一定的生物学功能. 展开更多

关键词 特异性 胰脂肪酶相关蛋白1 多克隆抗体 GST融合蛋白

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RNA干扰沉默HOXA2基因表达对肝癌细胞株行为的影响

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作者 胡晓珺 王一成 欧伶 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2014年第2期154-159,共6页

目的研究同源异型盒A2(HOXA2)基因对肝癌细胞生长、细胞周期及凋亡的影响,探讨其作为潜在肝癌治疗靶点的可行性。方法采取实时定量PCR和逆转录PCR检测HOXA2基因的表达情况;siRNA干扰HOXA2基因在肝癌细胞株PLC/PRF/5、MHCC-97L中表达,通... 目的研究同源异型盒A2(HOXA2)基因对肝癌细胞生长、细胞周期及凋亡的影响,探讨其作为潜在肝癌治疗靶点的可行性。方法采取实时定量PCR和逆转录PCR检测HOXA2基因的表达情况;siRNA干扰HOXA2基因在肝癌细胞株PLC/PRF/5、MHCC-97L中表达,通过CCK-8评价肝细胞肝癌细胞株增殖情况,采用软琼脂克隆形成试验评价锚泊非依赖生长情况,流式细胞术分析细胞周期及细胞凋亡。结果实时定量PCR和逆转录PCR检测结果显示HOXA2基因在肝癌组织中表达上调(P<0.05)。针对HOXA2基因设计合成siRNAs能够特异性沉默HOXA2基因在肝癌细胞株PLC/PRF/5、MHCC-97L中的表达,在干扰了HOXA2基因表达后肝癌细胞株的软琼脂克隆形成能力和肝癌细胞增殖能力均受到不同程度的抑制。流式细胞结果表明,干扰HOXA2基因表达能够减缓细胞周期进展,使肝癌细胞阻滞于G1期,并且S期减少。Annexin V和PI双染色细胞凋亡实验表明,干扰HOXA2基因能促进肝癌细胞凋亡。结论HOXA2基因可以较显著影响肝癌细胞增殖和凋亡。 展开更多

关键词 RNA干扰 同源异型盒基因 肝癌 细胞周期 细胞凋亡

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