s-lap/GFP融合蛋白在Hela细胞中的表达与定位 被引量：1

1

作者 宋忆淑 宋志宇 +2 位作者 费向东 贺冰 李玉新 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期39-41,共3页

目的 :观察 s- lap/ GFP融合蛋白在 Hela细胞中的表达及定位。方法 :根据 s- lap基因的编码区序列 ,应用 PCR技术突变其 3′末端终止密码子 ,并通过基因重组技术将其与 GFP基因融合 ,构建 s- lap/ GFP重组质粒 ;采用脂质体转染法 ,将 s-... 目的 :观察 s- lap/ GFP融合蛋白在 Hela细胞中的表达及定位。方法 :根据 s- lap基因的编码区序列 ,应用 PCR技术突变其 3′末端终止密码子 ,并通过基因重组技术将其与 GFP基因融合 ,构建 s- lap/ GFP重组质粒 ;采用脂质体转染法 ,将 s- lap/ GFP融合基因转入 Hela细胞中 ,用荧光显微镜观察其表达。结果 :s- lap/ GFP重组质粒序列测定的结果与预期设计完全一致。荧光显微镜显示 ,在转染 GFP基因的 Hela细胞中 ,荧光呈网状均匀分布于细胞浆内 ,而细胞核内低表达 ;在转染 s- lap/ GFP融合基因的 Hela细胞中 ,荧光均匀分布于整个细胞 ,尤其以细胞核内高表达。结论 :s- lap/ GFP融合蛋白可在人 Hela细胞中表达 ,并主要定位于细胞核。 展开更多

关键词 s-lap/gfp融合蛋白 重组融合蛋白质类/遗传学 基因融合/方法 HELA细胞

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RPE细胞光损伤相关新基因s-lap编码区克隆及s-lap/GFP融合蛋白在B16黑色素瘤细胞中的表达与定位 被引量：1

2

作者 宋忆淑 李玉新 +2 位作者 费向东 鲍永利 谭大鹏 《眼科新进展》 CAS 2005年第1期11-13,共3页

目的　克隆新基因s lap编码区序列 ,研究其编码的蛋白质在B16黑色素瘤细胞内的表达与定位。方法　分析s lapcDNA序列 ,建立视网膜色素上皮 (retinalpigmentep ithelium ,RPE)细胞光损伤模型 ,RT PCR克隆其编码区序列 ,构建了带有绿色荧... 目的　克隆新基因s lap编码区序列 ,研究其编码的蛋白质在B16黑色素瘤细胞内的表达与定位。方法　分析s lapcDNA序列 ,建立视网膜色素上皮 (retinalpigmentep ithelium ,RPE)细胞光损伤模型 ,RT PCR克隆其编码区序列 ,构建了带有绿色荧光蛋白的目的基因真核表达重组质粒 pcDNA3 .1 GFP/s lap ,转染B16黑色素瘤细胞 ,观察s lap/GFP融合蛋白在B16黑色素瘤细胞内的表达与定位。结果　s lapcDNA序列含有编码10 1个氨基酸的开放读码框架 ,有 2个可能的N 糖基化位点 ,1个可能的caseinkinaseII磷酸化位点和 2个可能的PKC磷酸化位点 ;成功地克隆了s lap蛋白编码区序列 ,构建了其真核表达载体 ,荧光显微镜观察 ,在转染 pcDNA3 .1 GFP质粒的B16黑色素瘤细胞中 ,荧光呈网状分布于细胞浆内 ,而细胞核内低表达 ;在转染s lap/GFP融合基因的B16黑色素瘤细胞中 ,荧光均匀分布于整个细胞 ,尤其以细胞核内高表达。结论　新基因s lap编码的蛋白质可在B16黑色素瘤细胞中获得表达 ,并以细胞核内高表达。 展开更多

关键词 s-lap基因 克隆 s-lap/gfp 融合蛋白 基因表达 基因定位

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花粉介导法将TaPHR1∷GFP融合蛋白基因导入玉米 被引量：6

3

作者 王秀红 白建荣 +3 位作者 孙毅 刘惠民 史向远 任志强 《西北植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第9期1732-1737,共6页

利用超声波辅助花粉介导基因转化法,将小麦耐低磷调控基因TaPHR1和GFP构建成的融合蛋白基因(TaPHR1∷GFP)导入3个玉米自交系郑58、昌7-2和PH6WC中.结果表明:3个自交系的转化效果存在基因型差异,郑58是很好的转化受体材料,平均结籽穗率... 利用超声波辅助花粉介导基因转化法,将小麦耐低磷调控基因TaPHR1和GFP构建成的融合蛋白基因(TaPHR1∷GFP)导入3个玉米自交系郑58、昌7-2和PH6WC中.结果表明:3个自交系的转化效果存在基因型差异,郑58是很好的转化受体材料,平均结籽穗率、每穗平均结籽数、BASTA除草剂抗性和转基因植株PCR阳性率均优于昌7-2和PH6W;对T1代植株进行Southern杂交表明,TaPHR1∷GFP融合蛋白基因已整合到玉米基因组中;RT-PCR结果显示,TaPHR1∷GFP融合蛋白基因得到有效转录;通过对发芽籽粒进行GFP荧光观察表明,TaPHR1∷GFP融合蛋白基因得到了表达. 展开更多

关键词 玉米自交系 花粉介导转基因法 TaPHR1∷gfp融合蛋白基因 gfp(绿色荧光蛋白)

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Tat-GFP融合蛋白的表达纯化及其穿膜活性 被引量：6

4

作者 关新刚 苏维恒 +2 位作者 于欣 佟海滨 孙新 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期725-728,I0001,共5页

目的:获得具备穿膜活性与绿色荧光蛋白(GFP)标记的Tat-GFP融合蛋白,探讨Tat-GFP在MCF-7细胞中的跨膜转运特性。方法:应用pET-24a-Tat-GFP质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,检测不同异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度(0.5和1.0mmol·L-1)... 目的:获得具备穿膜活性与绿色荧光蛋白(GFP)标记的Tat-GFP融合蛋白,探讨Tat-GFP在MCF-7细胞中的跨膜转运特性。方法:应用pET-24a-Tat-GFP质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,检测不同异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度(0.5和1.0mmol·L-1)和不同温度(22℃和37℃)诱导融合蛋白的表达情况;利用Ni-IDA树脂亲和纯化Tat-GFP蛋白,利用GFP特异性抗体采用Western blotting法分析洗脱液中的蛋白;激光共聚焦荧光显微镜下检测Tat-GFP融合蛋白的跨膜转运活性。结果:0.5和1.0mmol·L-1 IPTG诱导出的细菌总蛋白中所含的Tat-GFP蛋白量无明显差异;低温(22℃)诱导生产的Tat-GFP蛋白量较37℃更高;Western blotting分析,GFP抗体能够特异性识别PVDF膜上的蛋白,条带灰度与Tat-GFP蛋白上样量有关联;细胞穿膜实验,绿色荧光分布于MCF-7细胞的细胞质和细胞核中。结论:低温诱导时大肠杆菌BL21菌体上清液中Tat-GFP融合蛋白量更高,所生产的Tat-GFP融合蛋白既具备穿膜活性又具有易于检测的绿色荧光。 展开更多

关键词 Tat-gfp 细胞穿膜肽 融合蛋白 穿膜活性

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抗HBV中和抗体MA18/7轻链可变区V_L与GFP融合蛋白的表达及生物活性测定 被引量：1

5

作者 管宝全 张军 +3 位作者 罗文新 顾颖 朱子恒 夏宁邵 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第4期444-448,共5页

目的 :在大肠杆菌中表达抗HBV中和抗体MA18/7轻链可变区基因 (VL)与增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)的融合蛋白 ,并测定其生物学活性。方法 :应用基因工程技术 ,将EGFP基因克隆到载体pTO T7中构建原核表达载体。然后将MA18/7的VL基因按照读... 目的 :在大肠杆菌中表达抗HBV中和抗体MA18/7轻链可变区基因 (VL)与增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)的融合蛋白 ,并测定其生物学活性。方法 :应用基因工程技术 ,将EGFP基因克隆到载体pTO T7中构建原核表达载体。然后将MA18/7的VL基因按照读码框插入到无终止密码子TAA的EGFP基因的 5′末端 ,构建融合蛋白表达载体。通过ELISA和相对荧光强度测定在大肠杆菌中表达的融合蛋白的活性。结果 :构建了EGFP MA18/7 VL 表达载体。SDS PAGE表明 ,融合蛋白主要以包涵体的形式存在。荧光测定显示 ,融合蛋白保持了GFP的荧光性质。ELISA的结果表明 ,融合蛋白与重链可变区 (VH)片段结合成的Fv ,能特异性地识别HBVpre S1抗原。结论 :成功地获得具有良好生物学活性的融合蛋白 ,可用于进一步的研究。 展开更多

关键词 轻链可变区 gfp 融合蛋白

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以gfp为报告基因研究蛋白亚细胞定位 被引量：8

6

作者 夏玉凤 《生物技术通报》 CAS CSCD 2006年第2期11-13,共3页

以gfp作为报告基因研究了烟草中蛋白亚细胞定位。就表达系统选择、蛋白亚细胞定位软件分析、载体构造、材料选择等问题作一简要总结。

关键词 gfp 融合蛋白 亚细胞定位

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鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白GFP融合分子在COS7细胞内的表达 被引量：1

7

作者 李姣 张红 +5 位作者 张改平 王爱萍 易明林 郅玉宝 鲁琨 张丽萍 《中国畜牧兽医》 CAS 2008年第7期40-42,共3页

将鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2蛋白基因插入增强型绿色荧光表达载体pEGFP-C1中,构建了真核表达载体pEGFP-VP2。PCR与酶切鉴定结果表明VP2基因成功插入到表达载体pEGFP-C1中。脂质体法转染COS7细胞后,荧光显微镜检测到了GFP-VP2融合... 将鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2蛋白基因插入增强型绿色荧光表达载体pEGFP-C1中,构建了真核表达载体pEGFP-VP2。PCR与酶切鉴定结果表明VP2基因成功插入到表达载体pEGFP-C1中。脂质体法转染COS7细胞后,荧光显微镜检测到了GFP-VP2融合蛋白的表达。用200μg/ml的G418成功筛选到了稳定表达GFP-VP2融合蛋白的细胞系,表达蛋白经镍亲和柱得到了纯化。 展开更多

关键词 鸡 传染性法氏囊病病毒 VP2蛋白 真核表达 gfp融合蛋白

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用细菌/杆状病毒系统在昆虫细胞中表达GFP与HCV抗原融合蛋白 被引量：2

8

作者 王业富 齐义鹏 +2 位作者 岳莉莉 杜全胜 邓小昭 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 1998年第2期134-139,共6页

用细菌／杆状病毒（Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ）系统在昆虫细胞中高效表达了绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）与ＨＣＶ抗原的双功能融合蛋白，经ＥＬＩＳＡ测定和荧光显微镜观查证实，表达产物既能发射易于检测的绿色荧光，又具有ＨＣＶ的抗原活性，... 用细菌／杆状病毒（Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃ）系统在昆虫细胞中高效表达了绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）与ＨＣＶ抗原的双功能融合蛋白，经ＥＬＩＳＡ测定和荧光显微镜观查证实，表达产物既能发射易于检测的绿色荧光，又具有ＨＣＶ的抗原活性，实现了用绿色荧光蛋白等分子标记抗原，为免疫诊断新方法的建立打下了理论基础． 展开更多

关键词 HCV 核心蛋白 基因 绿色荧光蛋白 抗原融合蛋白

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静脉注射41BBLGFP融合表达质粒体内表达及其生物学活性

9

作者 邱惠 张桂梅 +3 位作者 张慧 袁野 李东 冯作化 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第4期482-487,共6页

通过RTPCR方法扩增小鼠41BBLcDNA,以pEGFPN1为载体,构建融合蛋白41BBLGFP重组表达质粒p41BBLGFP.采用基于流体力学原理建立的裸DNA体内转染技术,从小鼠尾静脉快速(15s)注射质粒p41BBLGFP进行体内转染.荧光显微镜观察组织切片,见小鼠肝... 通过RTPCR方法扩增小鼠41BBLcDNA,以pEGFPN1为载体,构建融合蛋白41BBLGFP重组表达质粒p41BBLGFP.采用基于流体力学原理建立的裸DNA体内转染技术,从小鼠尾静脉快速(15s)注射质粒p41BBLGFP进行体内转染.荧光显微镜观察组织切片,见小鼠肝、脾、肾及肺中均有报告基因GFP表达,尤以肝细胞中荧光最强.进一步用Western印迹和免疫组织化学染色法确定肝细胞表面表达41BBL,用Hsp70H22细胞抗原肽皮下免疫小鼠,同时尾静脉注射质粒p41BBLGFP,检测血清中IL2和IFNγ的分泌.结果显示,质粒注射联合免疫组小鼠血清IL2和IFNγ的浓度分别较生理盐水对照组增加了3倍和4倍;脾细胞对H22细胞的杀伤率则由单独免疫组的45.74%±3.27%增至86.74%±9.36%.结果表明,体内(主要在肝脏)转染质粒p41BBLGFP可以成功表达,表达产物具有41BBL的生物学活性,为进一步研究体内转染41BBL用于基因治疗奠定了基础. 展开更多

关键词 4-1 BBL gfp 融合蛋白 静脉注射 体内表达

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重组组蛋白去乙酰化酶2-pEGFP-C2质粒的构建及表达

10

作者 章慧 黄成 +5 位作者 卞尔保 赵斌 吴宝明 刘昌伟 陈小霞 李俊 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期812-816,共5页

目的将组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)基因克隆入pEGFP-C2载体,探讨构建的质粒转染进非洲绿猴肾成纤维细胞COS-7株相关蛋白和mRNA的表达及蛋白分布部位的情况。方法从人肝癌细胞(HepG2)中获得组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)的cDNA,采用Xho I和Bam... 目的将组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)基因克隆入pEGFP-C2载体,探讨构建的质粒转染进非洲绿猴肾成纤维细胞COS-7株相关蛋白和mRNA的表达及蛋白分布部位的情况。方法从人肝癌细胞(HepG2)中获得组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)的cDNA,采用Xho I和BamH I双酶切,用T4连接酶将该cDNA连接pEGFP-C2质粒,将构建成功的pEGFP-C2-HDAC2质粒经PCR、限制性内切酶酶切和测序鉴定后转染非洲绿猴肾成纤维细胞(COS-7),荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,RT-PCR和Western blot鉴定HDAC2的表达。结果双酶切鉴定可见HDAC2质粒片段,转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达,PCR结果可检测到HDAC2 mRNA表达,同时Western blot可检测HDAC2蛋白和GFP蛋白的表达。结论成功构建了重组pEGFP-C2-HDAC2表达质粒,HDAC2蛋白可与绿色荧光蛋白在COS-7细胞中融合表达。 展开更多

关键词 组蛋白去乙酰化酶2 COS-7 融合蛋白 PEgfp-C2 HEPG2 绿色荧光蛋白

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hHT/GFP融合基因表达载体的构建及在小鼠成纤维细胞中的表达

11

作者 郭战军 马毅 +5 位作者 张钥 李三华 王广友 杨慧祥 孙光 乔宝民 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第9期25-28,共4页

为探讨超急排斥反应(hyperacute rejection,HAR)及延迟性异种排斥反应(delayed xenograft rejec-tion,DXR)分子调控机制,进行-α1,2岩藻糖苷转移酶基因(hHT)与绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein,GFP)融合表达载体pEGFP-C1-hH... 为探讨超急排斥反应(hyperacute rejection,HAR)及延迟性异种排斥反应(delayed xenograft rejec-tion,DXR)分子调控机制,进行-α1,2岩藻糖苷转移酶基因(hHT)与绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein,GFP)融合表达载体pEGFP-C1-hHT的构建及在小鼠成纤维细胞表达的研究。采用脂质体法转染小鼠成纤维细胞48 h后观察到GFP阳性细胞。同时对GFP阳性小鼠成纤维细胞进行PCR及Western blot,检测hHT基因的整合及表达情况。PCR结果表明hHT基因整合入小鼠基因组,Western blot检测到hHT基因的表达。研究结果表明,成功克隆hHT基因并构建了融合表达载体pEGFP-C1-hHT,可应用于进一步转基因研究。 展开更多

关键词 hHT基因 gfp基因 融合表达 小鼠 成纤维细胞

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GFP-SUMO-3融合蛋白的重组及其在LNCaP细胞中的表达和定位

12

作者 伍贤军 缪璇 +3 位作者 程秀 王妍青 辻一郎 李晓萌 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期1024-1027,1175,共5页

目的:构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组真核表达载体pEGFP-N1-SUMO-3,观察GFP-SUMO-3融合蛋白在人前列腺癌细胞LNCaP中的表达与定位。方法:采用PCR扩增SUMO-3基因全长cDNA编码区序列,克隆入pEGFP-N1真核表达载体。重组质粒pEGFP... 目的:构建以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因的重组真核表达载体pEGFP-N1-SUMO-3,观察GFP-SUMO-3融合蛋白在人前列腺癌细胞LNCaP中的表达与定位。方法:采用PCR扩增SUMO-3基因全长cDNA编码区序列,克隆入pEGFP-N1真核表达载体。重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3通过酶切和测序鉴定正确后,脂质体法将重组质粒转染至LNCaP中,利用GFP抗体通过Western blotting检测GFP-SUMO-3融合蛋白的表达,通过荧光显微镜观察其在细胞中的表达及分布。结果:重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定,得到大小分别为4 700和312bp的条带,与预期结果一致。测序结果显示,GFP在N端,是阅读框正确的SUMO-3的基因序列。在LNCaP细胞中过表达GFP-SUMO-3融合蛋白,Western blotting得到相对分子质量为39 000的蛋白表达条带,与GFP-SUMO-3大小相符。荧光显微镜观察,转染重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3的细胞中呈绿色荧光,主要在细胞核内表达,与DAPI重合。结论:成功构建重组质粒pEGFP-N1-SUMO-3,并表达代绿色荧光蛋白的SUMO-3融合蛋白,鉴定出SUMO-3在LNCaP细胞中的核定位性。 展开更多

关键词 gfp-SUMO-3融合蛋白 重组蛋白质类 LNCAP细胞 基因表达

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DNA错配修复蛋白MutS和MutL的相互作用研究(英文) 被引量：7

13

作者 毕利军 张先恩 +1 位作者 周亚凤 张治平 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2005年第12期1178-1184,共7页

MutL和MutS是DNA错配修复系统中起关键作用的修复蛋白.利用基因融合技术高效表达了MutL和MutS融合蛋白,并利用它们发展了一种研究二者相互作用的简便方法.融合蛋白MutL-GFP(Trx-His6-GFP-(Ser-Gly)6-MutL),MutL-StreptagⅡ(Trx-His6-(Se... MutL和MutS是DNA错配修复系统中起关键作用的修复蛋白.利用基因融合技术高效表达了MutL和MutS融合蛋白,并利用它们发展了一种研究二者相互作用的简便方法.融合蛋白MutL-GFP(Trx-His6-GFP-(Ser-Gly)6-MutL),MutL-StreptagⅡ(Trx-His6-(Ser-Gly)6-StreptagⅡ-(Ser-Gly)6-MutL)和MutS(Trx-His6-(Ser-Gly)6-MutS)被构建并在大肠杆菌中高效表达.收集菌体细胞、超声波破碎后离心取上清进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,结果表明有与预期分子质量相应的诱导表达条带出现,其表达量约占全细胞蛋白的30%且以可溶形式存在.利用固定化金属离子配体亲和层析柱分别纯化融合蛋白,其纯度达到90%.通过将MutS蛋白固定的方法研究两种MutL融合蛋白分别与MutS之间的相互作用.结果表明:只有MutS蛋白与含有错配碱基DNA分子结合后才与MutL蛋白发生相互作用.通过检测MutL融合蛋白标记的绿色荧光信号或酶学显色信号来鉴定相互作用的发生.建立的融合分子系统方法也为研究其他的蛋白质或生物大分子之间的相互作用提供了一个技术平台. 展开更多

关键词 融合蛋白 绿色荧光蛋白 Strep tagⅡ MUTS MUTL 相互作用

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重组绿色荧光蛋白-肿瘤坏死因子融合蛋白的表达及应用 被引量：3

14

作者 孙义敏 尹丙姣 +2 位作者 李卓娅 姜小丹 徐勇 《华中科技大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2004年第5期519-521,534,共4页

目的　为肿瘤坏死因子 α (TNF α)及其受体 (TNFR)的科学研究提供实验工具。方法　用基因克隆技术构建了人TNF α (rhTNF α)及绿色荧光蛋白 (GFP)与人TNF α的融合蛋白 (GFP TNF)的原核表达质粒pET2 8a/rhTNF及 pET2 8a/GFP TNF ,分... 目的　为肿瘤坏死因子 α (TNF α)及其受体 (TNFR)的科学研究提供实验工具。方法　用基因克隆技术构建了人TNF α (rhTNF α)及绿色荧光蛋白 (GFP)与人TNF α的融合蛋白 (GFP TNF)的原核表达质粒pET2 8a/rhTNF及 pET2 8a/GFP TNF ,分别转化大肠杆菌BL2 1;用IPTG诱导重组蛋白的表达 ,超声裂菌 ,包涵体中的rhTNF α和GFP TNF用镍金属螯合层析柱进行纯化 ;用MTT法检测rhTNF α和GFP TNF的生物活性。结果重组表达的rhTNF α及GFP TNF均具有明显的细胞毒效应 ,GFP TNF还具有GFP的绿色荧光特性。结论　rhTNF α和GFP TNF具有生物活性 ,可用于TNF α和TNFR的实验研究。 展开更多

关键词 HTNF-Α 原核表达质粒 TNFR 肿瘤坏死因子-α(TNF-α) 融合蛋白 细胞毒效应 绿色荧光蛋白(gfp) 绿色荧光蛋白 IPTG 包涵体

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人类GABARAPL2基因的亚细胞定位 被引量：2

15

作者 陈政 张坚萱 +1 位作者 辛玉蓉 蒋滢 《生物学杂志》 CAS CSCD 2002年第1期15-18,共4页

为了对GABARAPL2 (GABAA 受体相关蛋白相似蛋白 2 )基因的功能进行初步分析 ,首先通过同源比较的方法将序列与其同源物进行比较 ,发现GABARAPL2的氨基酸序列与GABARAP(GABAA 受体相关蛋白 )高度同源 ,而GABARAP已证实通过结合细胞骨架... 为了对GABARAPL2 (GABAA 受体相关蛋白相似蛋白 2 )基因的功能进行初步分析 ,首先通过同源比较的方法将序列与其同源物进行比较 ,发现GABARAPL2的氨基酸序列与GABARAP(GABAA 受体相关蛋白 )高度同源 ,而GABARAP已证实通过结合细胞骨架的微管蛋白 ,使GABAA 受体聚集、定位在细胞膜上。本文采用PCR法从人脑组织的cDNA文库中扩增出GABARAPL2的cDNA ,克隆至T质粒载体中进行测序验证 ,然后以此为模板 ,引物中引入酶切位点再次PCR ,扩增出GABARAPL2的开放阅读框 ,并将其插入到加强型绿色荧光蛋白融合表达载体EGFP中 ,将绿色荧光蛋白标记的GABARAPL2和GABARAP分别转染HLF细胞株。结果两种蛋白的分布情况基本一致 ,在细胞质内和核内均有分布 ,而且核内的分布较胞质为多。结构功能域分析表明 ,GABARAPL2含有蛋白激酶C磷酸化位点和酪氨酸激酶磷酸化位点 ,可能通过磷酸化参与细胞骨架的变化。结论GABARAPL2和GABARAP不仅在胞质中作为受体相关蛋白协助受体的聚集、定位 。 展开更多

关键词 GABARAPL2 同源比较 结构域 gfp融合蛋白 细胞学定位 人类基因定位

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Wnt/β-连环蛋白信号途径活性的分析系统的建立 被引量：2

16

作者 冯涛 周兰 何通川 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 2004年第4期413-416,共4页

目的 :建立Wnt/ β -连环蛋白信号途径功能活性的分析系统。 方法 :首先构建一个表达 β -连环蛋白 -绿色荧光蛋白的融合蛋白的载体 ,pCMV -bcGFP ;再用之转染HEK2 93细胞 ,用G4 18和LiCl筛选出稳定表达该融合蛋白的细胞 ,克隆建株并鉴... 目的 :建立Wnt/ β -连环蛋白信号途径功能活性的分析系统。 方法 :首先构建一个表达 β -连环蛋白 -绿色荧光蛋白的融合蛋白的载体 ,pCMV -bcGFP ;再用之转染HEK2 93细胞 ,用G4 18和LiCl筛选出稳定表达该融合蛋白的细胞 ,克隆建株并鉴定。结果 :成功获得稳定表达该融合蛋白的细胞株 ,即 2 93-bc -GFP细胞株 ;在荧光显微镜下以及蛋白质印迹分析证实 :所获得的 2 93-bc -GFP细胞株表达该融合蛋白的基础水平极低 ;用Wnt1和LiCl处理后可以明显地使该融合蛋白在细胞内的水平升高。结论 :上述结果提示该分析系统是以Wnt依赖的方式、受 β -连环蛋白调节的。该分析系统可以用作一个功能报告系统 ,以鉴定肿瘤发生中导致 β-连环蛋白信号途径失调的潜在的上游因子 ,也同样可以用于筛选那些特异抑制人类肿瘤中 展开更多

关键词 Wnt/β-连环蛋白信号途径 β-连环蛋白-绿色荧光蛋白 功能分析系统

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甘露糖外切酶的细胞生物学定位研究 被引量：1

17

作者 莫蓓莘 《深圳大学学报（理工版）》 EI CAS 北大核心 2006年第4期358-361,共4页

用不同试剂从西红柿种子提取甘露聚糖外切酶,结果表明甘露聚糖外切酶只能被含高盐的缓冲液(0.1mol/LHepes+500mmol/LNaCl,pH7.0)提取出来,单独的低盐缓冲液(0.1mol/LHepes,pH7.0)或用非盐洗涤剂代替高盐则不能提取该酶.通过基因枪将甘... 用不同试剂从西红柿种子提取甘露聚糖外切酶,结果表明甘露聚糖外切酶只能被含高盐的缓冲液(0.1mol/LHepes+500mmol/LNaCl,pH7.0)提取出来,单独的低盐缓冲液(0.1mol/LHepes,pH7.0)或用非盐洗涤剂代替高盐则不能提取该酶.通过基因枪将甘露聚糖外切酶和GFP融合蛋白转化洋葱表皮细胞,发现转化了甘露聚糖外切酶和GFP融合蛋白的洋葱表皮细胞壁上有荧光,表明甘露聚糖外切酶可能定位在细胞壁上. 展开更多

关键词 基因枪 gfp 洋葱表皮细胞 甘露聚糖外切酶 细胞壁

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瘦素与绿色荧光蛋白融合基因的合成及其高效表达

18

作者 庞实锋 吴晓萍 +4 位作者 李校堃 郑青 于平野 曲红艳 王艳萍 《中国药科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第3期276-279,共4页

目的 :为了便于追踪瘦素 (Leptin)在体内的去向 ,对其进行体内定位 ,设计合成Leptin荧光分子蛋白探针。方法 :用PCR技术将LeptincDNA与绿色荧光蛋白cDNA构建成融合基因LG ,然后将其克隆进原核表达载体pET3c中 ,构建成原核表达工程菌BL2 ... 目的 :为了便于追踪瘦素 (Leptin)在体内的去向 ,对其进行体内定位 ,设计合成Leptin荧光分子蛋白探针。方法 :用PCR技术将LeptincDNA与绿色荧光蛋白cDNA构建成融合基因LG ,然后将其克隆进原核表达载体pET3c中 ,构建成原核表达工程菌BL2 1(DE3) /pET3c LG。用Western blot杂交检测重组蛋白的免疫原性 ,用荧光显微镜观察融合蛋白及其诱导菌休的发光活性。结果 :DNA测序结果证实设计合成的融合基因与预期一致 ;构建的工程菌BL2 1(DE3) /pET3c LG获得了表达 ,融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的 4 0 %以上 ;Western blot杂交检测表明重组蛋白具有Leptin的免疫原性 ;经IPTG诱导后的菌体及蛋白粗提液在荧光显微镜下可观察到其能发射出强烈的绿色荧光。结论 :融合基因在大肠杆菌中实现了高效表达 ,表达的融合蛋白具Leptin的免疫原性和GFP的发光特性。为利用绿色荧光蛋白标记Leptin在动物体内的药物治疗的研究提供了一种新的途径。 展开更多

关键词 瘦素 绿色荧光蛋白(gfp) 融合基因 高效表达

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鸡Igλ轻链绿色荧光蛋白融合分子在COS7细胞膜的表达

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作者 张红 宋海涛 +5 位作者 张改平 邢广旭 赵东 杨继飞 柴书军 郝青梅 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2006年第11期102-104,109,共4页

将牛IgG Fc受体γRⅡ的跨膜区序列嵌合入鸡Igλ轻链基因中,并将鸡Igλ轻链信号肽与Pegfp-C1载体的绿色荧光蛋白N端融合产生带有信号肽的中间载体Pegfp-C1-SP。鸡Igλ轻链基因嵌合分子定向克隆入载体的多克隆位点,构建了带有信号肽的鸡I... 将牛IgG Fc受体γRⅡ的跨膜区序列嵌合入鸡Igλ轻链基因中,并将鸡Igλ轻链信号肽与Pegfp-C1载体的绿色荧光蛋白N端融合产生带有信号肽的中间载体Pegfp-C1-SP。鸡Igλ轻链基因嵌合分子定向克隆入载体的多克隆位点,构建了带有信号肽的鸡Igλ轻链/GFP融合蛋白真核表达载体。转染COS7细胞后,荧光显微镜观察,重组鸡Igλ轻链/GFP蛋白在COS7细胞膜及膜周围有明显表达,而载体pEGFP-C1转染的COS7细胞GFP则分布在细胞及细胞核。结果表明,牛IgG Fc受体γRⅡ的跨膜区能介导融合蛋白在细胞膜上的表达。 展开更多

关键词 鸡Igγ轻链 牛IgG Fc受体γR Ⅱ跨膜区 COS7细胞 gfp融合蛋白

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马铃薯StHb1蛋白的亚细胞定位

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作者 李继刚 郑建坡 曲占良 《河北大学学报（自然科学版）》 CAS 北大核心 2012年第5期523-527,共5页

为了研究马铃薯StHb1蛋白的亚细胞定位情况,采用RT-PCR技术克隆到马铃薯StHb1基因cDNA序列,并成功构建了StHb1基因与绿色荧光蛋白基因的融合表达载体pBI121-StHb1-GFP.利用农杆菌介导法将重组载体转化洋葱内表皮细胞,通过荧光显微镜观... 为了研究马铃薯StHb1蛋白的亚细胞定位情况,采用RT-PCR技术克隆到马铃薯StHb1基因cDNA序列,并成功构建了StHb1基因与绿色荧光蛋白基因的融合表达载体pBI121-StHb1-GFP.利用农杆菌介导法将重组载体转化洋葱内表皮细胞,通过荧光显微镜观察融合蛋白的瞬时表达以确定StHb1蛋白在细胞内的分布.结果表明StHb1蛋白主要分布于细胞核中. 展开更多

关键词 非共生血红蛋白 绿色荧光蛋白(gfp) 亚细胞定位 融合表达载体 农杆菌介导转化

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