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Bacillus subtilis 168菌株产surfactin改造 被引量：8
1
作者 刘丽霞 高玲 +3 位作者 别小妹 陆兆新 张充 吕凤霞 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期97-102,共6页
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168菌株基因组中含有编码surfactin合成酶系的srfA操纵子,却不产抗菌肽surfactin。运用同源重组的方法将外源的有活性的sfp基因(编码4'-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶)整合入B.subtilis 168中,将其改造... 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168菌株基因组中含有编码surfactin合成酶系的srfA操纵子,却不产抗菌肽surfactin。运用同源重组的方法将外源的有活性的sfp基因(编码4'-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶)整合入B.subtilis 168中,将其改造为产surfactin的菌株。通过分析多株枯草芽孢杆菌和解淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的sfp基因,从基因的上、下游找出较为保守的区域,设计引物,从枯草芽孢杆菌Nja-9中扩增sfp基因,将获得的sfp基因与P43启动子和终止子相连,构建了sfp基因表达框,并连接于枯草整合质粒pDG1730上,最终构建了枯草芽孢杆菌整合质粒pST-1730,利用pST-1730本身的淀粉酶E基因与B.subtilis 168菌株的基因组DNA进行同源重组整合,获得了产surfactin的重组菌株B.subtilis121。本研究为surfactin合成酶基因的改造和分析奠定了基础。 展开更多
关键词 同源重组 bacillus SUBTILIS 168 SURFACTIN sfp基因 改造
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sfp基因转化增强了Bacillus subtilis 168的定殖能力和对黄瓜茎内枯萎病菌的抑制作用 被引量：13
2
作者 高毓晗 李世东 郭荣君 《中国生物防治学报》 CSCD 北大核心 2016年第1期76-85,共10页
枯草芽胞杆菌B006是一株防治黄瓜枯萎病的高效菌株,可产生脂肽类抗生素表面活性素surfactin和芬枯草菌素fengycin。为深入了解surfactin在根际的作用,本研究通过同源重组的方法将生防芽胞杆菌B006菌株中编码4′-磷酸泛酰巯基乙胺转移酶... 枯草芽胞杆菌B006是一株防治黄瓜枯萎病的高效菌株,可产生脂肽类抗生素表面活性素surfactin和芬枯草菌素fengycin。为深入了解surfactin在根际的作用,本研究通过同源重组的方法将生防芽胞杆菌B006菌株中编码4′-磷酸泛酰巯基乙胺转移酶Sfp的sfp基因整合到不产生surfactin的模式菌株B.subtilis168（B168）基因组中,获得了重组菌株B168S。重组菌株B168S在1%淀粉平板上不水解淀粉,在5%血平板上产生透明溶血圈;HPLC-ESI-MS检测表明菌株B168S在牛肉膏蛋白胨培养液中培养48 h后可产生surfactin。平板对峙试验表明菌株B168S在黄瓜根分泌物培养基上对Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum（Foc）菌丝生长有一定的抑制作用,抑制率R2/R1为1.22;平板菌落计数法测定表明,将菌悬液（10^6 cfu/m L）浸泡90 min的黄瓜种子播种于无菌石英砂3 d后,菌株B168S在黄瓜根基部和根尖的定殖量分别为菌株B168的2-3倍和9-10倍;温室盆栽试验表明,黄瓜苗用浓度为10^6 cfu/m L的B168S和B168菌悬液蘸根后,移栽到接种Foc孢子（10^5孢子/g）的病土中,移栽后第3周菌株B168S和B168处理的防效分别为21.1%和17.9%;对不同高度黄瓜茎中Foc的组织分离结果表明,菌株B168S处理后Foc在黄瓜茎内蔓延的相对高度低于菌株B168和Foc处理。上述结果进一步明确了surfactin可明显促进芽胞杆菌在黄瓜根部的定殖,并通过抑制枯萎病菌的侵染和在黄瓜茎中的蔓延增强对黄瓜枯萎病的防治效果。 展开更多
关键词 同源重组 sfp基因 芽胞杆菌 SURFACTIN 黄瓜枯萎病菌
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Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909麦芽寡糖基海藻糖合成酶在Bacillus subtilis中的重组表达和发酵优化 被引量：5
3
作者 韩唱 宿玲恰 吴敬 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第7期162-168,共7页
为实现Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909来源的麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)基因tre Y在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中的重组表达,以质粒p ET-24a(+)-tre Y为模板PCR扩增得到目的基因,并与表达载体pHY300PLK连接,转入表达... 为实现Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909来源的麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)基因tre Y在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中的重组表达,以质粒p ET-24a(+)-tre Y为模板PCR扩增得到目的基因,并与表达载体pHY300PLK连接,转入表达宿主Bacillus subtilis CCTCC M 2016536中,重组菌在TB培养基中培养48 h后MTSase酶活达到17.5 U/m L;在此基础上对重组菌发酵条件进行优化,通过单因素实验(氮源种类、氮源复配、氮源浓度、碳源种类、葡萄糖浓度、初始pH、诱导温度)和正交实验(氮源浓度、葡萄糖浓度、初始pH、诱导温度)确定其摇瓶发酵产酶的最适培养基和培养条件为:氮源(工业蛋白胨∶棉籽粉=3∶1)48.0 g/L、葡萄糖为10.0 g/L、培养基初始pH为7.0,最适培养温度为30℃;在此条件下,MTSase的酶活可达41.5 U/m L,是优化前的2.4倍。 展开更多
关键词 麦芽寡糖基海藻糖合成酶 枯草芽孢杆菌 重组表达 发酵优化
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重组大肠杆菌产Bacillus subtilis 168来源γ-谷氨酰转肽酶的摇瓶发酵优化 被引量：1
4
作者 陈星奕 宿玲恰 吴敬 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第8期799-805,共7页
为实现来源于Bacillus subtilis的γ-谷氨酰转肽酶（GGT）高效胞外分泌表达,以基因工程菌E.coli BL21（DE3）/p ET-20b（＋）/ggt为出发菌株,对其发酵产酶的诱导条件和培养基进行优化。最终确定其最优发酵培养基为：10 g/L甘油,21 g/L... 为实现来源于Bacillus subtilis的γ-谷氨酰转肽酶（GGT）高效胞外分泌表达,以基因工程菌E.coli BL21（DE3）/p ET-20b（＋）/ggt为出发菌株,对其发酵产酶的诱导条件和培养基进行优化。最终确定其最优发酵培养基为：10 g/L甘油,21 g/L酵母粉,7 g/L蛋白胨,130 mmol/L磷酸盐;发酵条件为：37℃、200 r/min培养4 h,加入0.2 mmol/L IPTG后转入25℃,诱导40~48 h,优化后酶活达到81.2 U/m L,是未优化前的1.9倍。本研究结果为目前国内报道大肠杆菌摇瓶发酵产γ-谷氨酰转肽酶的最高酶活,为该酶的工业化生产奠定了基础。 展开更多
关键词 枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis) Γ-谷氨酰转肽酶 重组大肠杆菌 发酵优化
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重组牛凝乳酶基因在Bacillus megaterium WH320中的表达及其酶学性质研究
5
作者 李勇 刘文雯 +1 位作者 朱浩君 黄日波 《中国乳品工业》 CAS 北大核心 2013年第4期4-6,共3页
对牛凝乳酶基因进行密码子优化,并首次在高效表达宿主巨大芽孢杆菌中表达。通过克隆牛凝乳酶基因,将片段与穿梭质粒pHIS1525连接,连接产物转化大肠杆菌XL-10,筛选出阳性克隆子,所获重组质粒经酶切、测序鉴定,证实含目的片段。通过原生... 对牛凝乳酶基因进行密码子优化,并首次在高效表达宿主巨大芽孢杆菌中表达。通过克隆牛凝乳酶基因,将片段与穿梭质粒pHIS1525连接,连接产物转化大肠杆菌XL-10,筛选出阳性克隆子,所获重组质粒经酶切、测序鉴定,证实含目的片段。通过原生质体转化的方法转化到表达宿主巨大芽孢杆菌WH320。用木糖诱导表达,离心取上清经镍柱亲和层析(Ni-NTA)和聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)分离纯化并鉴定,测定重组牛凝乳酶的酶学性质,表明在巨大芽孢杆菌中得到有效表达。为我国利用生物工程技术的方法自主生产凝乳酶提供了基础。。 展开更多
关键词 重组凝乳酶 巨大芽孢杆菌 酶学性质
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嗜盐芽孢杆菌果胶裂解酶的重组表达、性质表征及在低次烟叶提质中的应用
6
作者 汪季涛 王浩军 +5 位作者 边文杰 张福建 董洪旭 高丽伟 张鹏 沈忱 《中国烟草学报》 北大核心 2025年第4期90-100,共11页
为获得能够降低烟叶杂气、提升烟叶品质的微生物酶资源,以烟叶为材料筛选具有果胶裂解功能的细菌,使用毕赤酵母异源表达了该细菌的果胶裂解酶基因,研究了其酶学性质和对烟叶品质的影响。结果表明:筛选到一株产果胶裂解酶的细菌,经鉴定... 为获得能够降低烟叶杂气、提升烟叶品质的微生物酶资源,以烟叶为材料筛选具有果胶裂解功能的细菌,使用毕赤酵母异源表达了该细菌的果胶裂解酶基因,研究了其酶学性质和对烟叶品质的影响。结果表明:筛选到一株产果胶裂解酶的细菌,经鉴定为嗜盐芽孢杆菌(Bacillus halotolerans),将其果胶裂解酶PelHA重组于毕赤酵母细胞中进行表达;PelHA的最适反应温度为50℃,最适反应pH为10.0,在30℃~40℃、pH 9.0~11.5的范围内稳定性良好,1 mM Ca^(2+)可以显著激发PelHA的酶活力,而Cu^(2+)、Co^(2+)、Fe^(3+)、Mn^(2+)4种金属离子以及EDTA、SDS和β-巯基乙醇等化学试剂对PelHA有明显抑制作用;PelHA的Km和Vm分别为85.25 mg/mL、0.47μmol/mL/min;经PelHA处理的烟叶中酸类、醇类、酯类等香气总体含量上升,酚类物质和含氮杂环类物质总体含量减少。经PelHA处理烟叶的卷烟制品香气质量更为优越,杂气、刺激性减少,香气浓度、劲头增加。为实现烟叶用果胶裂解酶自主化打下基础。 展开更多
关键词 果胶裂解酶 嗜盐芽孢杆菌 重组表达 稳定性 香气
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c-di-AMP为佐剂的重组卡介苗免疫对小鼠白色脂肪的调节作用
7
作者 董梦娟 常宇骁 +8 位作者 宁唤唤 路延之 康健 徐铭泽 代婷 李嘉玲 郝乐冉 张琳娜 柏银兰 《中国人兽共患病学报》 北大核心 2025年第4期370-375,共6页
目的研究c-di-AMP为佐剂的重组卡介苗(rBCG)调节小鼠附睾白色脂肪(eWAT)代谢及免疫的作用和机制。方法SPF级雄性C57BL/6小鼠经静脉免疫卡介苗(BCG)和重组卡介苗(rBCG),监测小鼠体重变化。分离并称重小鼠eWAT重量,血球仪计血管基质成分(S... 目的研究c-di-AMP为佐剂的重组卡介苗(rBCG)调节小鼠附睾白色脂肪(eWAT)代谢及免疫的作用和机制。方法SPF级雄性C57BL/6小鼠经静脉免疫卡介苗(BCG)和重组卡介苗(rBCG),监测小鼠体重变化。分离并称重小鼠eWAT重量,血球仪计血管基质成分(SVFs)数量。制备小鼠脂肪组织切片,HE染色后显微镜下观察和比较各组小鼠eWAT脂肪细胞大小、数量和形态以及冠状结构(CLS)形成等变化。qRT-PCR检测各组小鼠脂肪代谢相关因子、细胞因子和衰老相关基因的转录水平。结果BCG和rBCG免疫小鼠体重随时间逐渐增加,rBCG免疫诱导eWAT比重增加,SVFs数量降低。HE染色结果显示,BCG免疫促进eWAT脂肪细胞增生和rBCG免疫促进脂肪细胞肥大,BCG和rBCG免疫均可诱导eWAT中CLS形成。qRT-PCR检测结果显示,rBCG免疫可抑制eWAT脂肪分解和能量消耗相关基因表达。BCG免疫对细胞因子转录作用影响不大,而rBCG可诱导IFN-γ和IL-1Ra显著表达,抑制IL-15和IL-2的转录,但不诱导衰老相关基因的表达。结论rBCG免疫可诱导eWAT脂肪细胞肥大,其机制与抑制eWAT脂肪分解及调节细胞因子表达有关。 展开更多
关键词 卡介苗 重组卡介苗 环二腺苷酸 白色脂肪 脂肪代谢 细胞因子
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重组芽孢杆菌在鸡养殖中的研究现状与发展趋势
8
作者 吴丹 王洪壮 《西藏农业科技》 2025年第2期111-114,共4页
芽孢杆菌(Bacillus-like)作为一类重要的益生菌,其可通过调节肠道菌群平衡、增强肌体免疫力、促进营养物质吸收、抑制病原菌生长等方式,显著提升畜禽的健康水平和生产性能。而重组芽孢杆菌则是在天然芽孢杆菌的基础上,通过基因工程技术... 芽孢杆菌(Bacillus-like)作为一类重要的益生菌,其可通过调节肠道菌群平衡、增强肌体免疫力、促进营养物质吸收、抑制病原菌生长等方式,显著提升畜禽的健康水平和生产性能。而重组芽孢杆菌则是在天然芽孢杆菌的基础上,通过基因工程技术,对其基因组进行人为改造,使其获得新的优良性状。作为微生物制剂的重要成员,重组芽孢杆菌具有独特的生物学特性和功能优势。通过对重组芽孢杆菌在鸡养殖领域的研究现状与发展趋势进行全面综述,旨在为重组芽孢杆菌在鸡生产实际中的广泛应用提供理论参考和实践指导。 展开更多
关键词 重组芽孢杆菌 鸡 枯草芽孢杆菌 研究现状
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γ-谷氨酰转肽酶在枯草芽孢杆菌中高效表达及发酵培养基优化 被引量：1
9
作者 张祖政 毛泽敬 +4 位作者 余华顺 张彦 杨潇 龚大春 郑贤良 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2024年第24期76-83,共8页
γ-谷氨酰转肽酶是一种能催化底物谷胺酰胺形成γ-谷氨酰-酶复合体,再被受体底物(如氨基酸、短肽)亲核取代,发生转肽反应形成γ-谷氨酰肽的酶,在食品、医药等领域有重要应用价值。该研究选用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SCK6作为表... γ-谷氨酰转肽酶是一种能催化底物谷胺酰胺形成γ-谷氨酰-酶复合体,再被受体底物(如氨基酸、短肽)亲核取代,发生转肽反应形成γ-谷氨酰肽的酶,在食品、医药等领域有重要应用价值。该研究选用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SCK6作为表达宿主,以来源于枯草芽胞杆菌的173种信号肽为基础构建γ-谷氨酰转酶信号肽筛选文库,筛选出最优信号肽SP_(cotC),在此基础上进行启动子筛选,得到最优启动子P_(aprE),最终构建了一株高效分泌表达γ-谷氨酰肽酶的重组菌株BS-gts3,摇瓶发酵胞外酶活力最高为5.04 U/mL。通过单因素试验和响应面试验筛选出最优培养基:乳糖31.73 g/L、FM80250.26 g/L、硫酸镁1.24 g/L、KH_(2)PO_(4)1.25 g/L、K_(2)HPO_(4)0.75 g/L,胞外酶活提高了12%,为5.623 U/mL。并进行5 L发酵罐放大培养,在38 h,胞外酶活力达到最高28.18 U/mL,是已报道的最高水平。该研究对γ-谷氨酰转肽酶的产品开发及应用奠定了基础。 展开更多
关键词 枯草芽孢杆菌 Γ-谷氨酰转肽酶 启动子 信号肽 重组表达
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热处理对转基因秸秆中重组蛋白和重组DNA的降解作用
10
作者 颜晶莹 倪亮 +1 位作者 沈星宇 李玉 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2024年第9期2079-2088,共10页
随着转基因作物种植面积的不断扩大,如何高效处理转基因秸秆成为了一个重要的科学问题。未经处理的转基因秸秆中的重组蛋白和重组DNA可以在土壤中存在很长时间,并对土壤生物多样性产生潜在负面影响。因此寻找一个既节约成本又对环境无... 随着转基因作物种植面积的不断扩大,如何高效处理转基因秸秆成为了一个重要的科学问题。未经处理的转基因秸秆中的重组蛋白和重组DNA可以在土壤中存在很长时间,并对土壤生物多样性产生潜在负面影响。因此寻找一个既节约成本又对环境无害的秸秆处理方法非常重要。高温处理是降解转基因秸秆重组蛋白和重组DNA的有效手段,但目前对处理温度和处理时间的选择还缺乏系统的研究。本研究通过试纸条、聚合酶链反应(PCR)等方法检测不同温度和时间处理的转基因作物秸秆中重组蛋白和重组DNA的水平。结果表明,转基因大豆、棉花、玉米、水稻的秸秆在50℃处理3 h后,其体内的抗除草剂蛋白草胺膦乙酰转移酶(phosphinothricin acetyltransferase, PAT)等重组蛋白基本降解;但相同温度下,重组DNA的降解则需要4 d时间;提高处理温度可以在一定程度上缩短重组蛋白和重组DNA降解所需的时间。50℃处理4 d的条件在实际生产中通过堆肥就能实现。本研究从分子生物学的角度为转基因秸秆处理提供了依据。 展开更多
关键词 转基因秸秆 重组蛋白 重组DNA 草胺膦乙酰转移酶(PAT) 5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因(Cp4-EPSPS) BT基因
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microRNA与结核病相互关系的研究进展 被引量：2
11
作者 樊宇 杨春 +5 位作者 何永林 徐蕾 卢楠 穆柳青 张春燕 康月茜 《重庆医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第9期1167-1171,共5页
microRNA(miRNA)是一类广泛存在于各种生物体内的小分子非编码单链RNA,主要在转录后水平调控靶基因的表达。越来越多的证据表明它在细胞分化与沟通、机体发育、免疫反应等诸多方面都发挥着重要作用。尤其在疾病相关研究中,miRNA更是具... microRNA(miRNA)是一类广泛存在于各种生物体内的小分子非编码单链RNA,主要在转录后水平调控靶基因的表达。越来越多的证据表明它在细胞分化与沟通、机体发育、免疫反应等诸多方面都发挥着重要作用。尤其在疾病相关研究中,miRNA更是具有广泛的用途和美好的前景。本文主要针对miRNA的相关特性、与结核病(tuberculosis,TB)相互关系的研究进展以及应用前景等做综述。 展开更多
关键词 MICRORNA 结核病 结核分枝杆菌 bacillus calmette-guerin(BCG)
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枯草芽孢杆菌分泌表达极耐热木聚糖酶及其酶学性质 被引量：9
12
作者 向亚萍 罗楚平 +2 位作者 周华飞 刘永锋 陈志谊 《江苏农业学报》 CSCD 北大核心 2016年第5期1037-1042,共6页
为将海栖热袍菌极耐热木聚糖酶基因xyn B（Gen Bank登录号AY340789）在枯草芽孢杆菌Bs916中进行异源分泌表达,并阐明工程菌分泌重组木聚糖酶的酶学性质。克隆极耐热木聚糖酶基因xynB,将其与罗克霉素启动子融合,构建融合质粒载体pXYNB2,... 为将海栖热袍菌极耐热木聚糖酶基因xyn B（Gen Bank登录号AY340789）在枯草芽孢杆菌Bs916中进行异源分泌表达,并阐明工程菌分泌重组木聚糖酶的酶学性质。克隆极耐热木聚糖酶基因xynB,将其与罗克霉素启动子融合,构建融合质粒载体pXYNB2,将其转化到枯草芽孢杆菌Bs916中,获得重组枯草芽孢杆菌（Bs916/p XYNB2）,并对重组芽孢杆菌分泌表达的极耐热木聚糖酶的酶学性质进行了研究。SDS-PAGE法测定重组枯草芽孢杆菌分泌的蛋白在相对分子质量43 000处有明显的蛋白表达条带。重组木聚糖酶的最适反应p H值为5.0-5.8,重组木聚糖酶的最适反应温度大于或等于100℃,重组极耐热木聚糖酶在pH值4.6-7.8比较稳定,重组木聚糖酶的温度稳定性在90℃下保温2 h后残存酶活83%。可见,生防枯草芽孢杆菌Bs916能有效分泌表达极耐热木聚糖酶,为以后构建多种纤维素和半纤维素在其中的协同表达,拓宽其碳源利用范围奠定基础。 展开更多
关键词 重组枯草芽孢杆菌 海栖热袍菌 极耐热木聚糖酶 基因融合 分泌表达
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枯草芽孢杆菌产角蛋白酶的发酵过程优化 被引量：5
13
作者 刘文涛 刘柏宏 +3 位作者 张娟 李江华 陈坚 堵国成 《食品与生物技术学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第5期466-471,共6页
为了实现重组角蛋白酶在基因工程菌Bacillus subtilis WB600中的高效生产,在3L发酵罐中对发酵条件和补料策略进行了优化,建立了补料分批发酵工艺.研究发现,两阶段控制pH,前6小时控制pH 7.0,后期控制pH 8.0、DO 20％,发酵过程以葡萄糖为... 为了实现重组角蛋白酶在基因工程菌Bacillus subtilis WB600中的高效生产,在3L发酵罐中对发酵条件和补料策略进行了优化,建立了补料分批发酵工艺.研究发现,两阶段控制pH,前6小时控制pH 7.0,后期控制pH 8.0、DO 20％,发酵过程以葡萄糖为流加碳源,7～11 h以μ为0.15 h-1指数流加、12～15 h以μ为0.1 h-1指数流加、16～27 h恒速流加葡萄糖3 g/（L·h）,在30 L发酵罐水平上,27 h酶活达到864 U/mL,生产强度为31.8 U/（mL·h）,国外报道的酶活达到2 900 mL,酶活在国内属领先水平,为重组枯草芽孢杆菌产角蛋白酶的工业化生产打下了坚实的基础. 展开更多
关键词 重组枯草芽孢杆菌 流加策略 发酵优化 角蛋白酶
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同源重组法构建枯草芽孢杆菌224 yugS基因缺失突变株 被引量：5
14
作者 刘杰 房春红 +3 位作者 李琬 矫洪涛 喻江 李景鹏 《生物技术通报》 CAS CSCD 2007年第4期148-151,共4页
从枯草芽孢杆菌224的基因组DNA中分别扩增出溶血样基因yugS的上、下游片段,并利用携带新霉素抗性基因(neor)的重组质粒pMD18-T-neo作为骨架,构建了基于yugS基因位点的基因阻断质粒pMD18-T-neo-yugS,线性化后电转化入枯草杆菌224,从新霉... 从枯草芽孢杆菌224的基因组DNA中分别扩增出溶血样基因yugS的上、下游片段,并利用携带新霉素抗性基因(neor)的重组质粒pMD18-T-neo作为骨架,构建了基于yugS基因位点的基因阻断质粒pMD18-T-neo-yugS,线性化后电转化入枯草杆菌224,从新霉素抗性平板上挑取转化子,通过对基因组的PCR鉴定和核苷酸测序证明,确定转化子yugS156为yugS基因缺失突变株。 展开更多
关键词 枯草杆菌224 yugS基因 同源重组
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短小芽孢杆菌脂肪酶基因的克隆、表达及酶学性质研究 被引量：4
15
作者 苏二正 吴向萍 +1 位作者 高蓓 魏东芝 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期132-138,共7页
从土壤样品中通过筛菌过程获得一株产脂肪酶的菌株,经16S rRNA鉴定属于短小芽孢杆菌,根据已报道的来源于芽孢杆菌的脂肪酶基因设计引物,克隆获得其全长基因,命名为lipS6,大小为648 bp,编码215个氨基酸,经比对其与已报道的脂肪酶基因B26... 从土壤样品中通过筛菌过程获得一株产脂肪酶的菌株,经16S rRNA鉴定属于短小芽孢杆菌,根据已报道的来源于芽孢杆菌的脂肪酶基因设计引物,克隆获得其全长基因,命名为lipS6,大小为648 bp,编码215个氨基酸,经比对其与已报道的脂肪酶基因B26有96%的同源性。构建重组表达质粒pET32a-lipS6,在大肠杆菌中实现了可溶表达,酶活达到2 000 U/mL。重组脂肪酶LipS6的最适温度为30℃,最适pH为9,低浓度的Ca2+与Mn2+对其有很明显的激活作用,疏水性有机溶剂对其毒害作用小,在正己烷体系中可以催化酯化反应,最适酯化底物酸为十四酸,底物醇为正丁醇。 展开更多
关键词 脂肪酶 短小芽孢杆菌 基因克隆 重组表达 性质
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Cre-LoxP系统在炭疽芽胞杆菌基因敲除中的应用及eag基因的敲除 被引量：4
16
作者 王艳春 姜娜 +6 位作者 展德文 邱炎 袁盛凌 陶好霞 王令春 张兆山 刘纯杰 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2009年第7期934-940,共7页
将Cre-LoxP系统应用于Bacillus anthracis中并成功敲除eag基因.以B.anthracis基因组为模板扩增得到上下游同源臂,联合两端带有LoxP位点的壮观霉素抗性基因片段构建好同源重组载体,转化B.anthracisAP422,通过一系列筛选得到带有抗性标记... 将Cre-LoxP系统应用于Bacillus anthracis中并成功敲除eag基因.以B.anthracis基因组为模板扩增得到上下游同源臂,联合两端带有LoxP位点的壮观霉素抗性基因片段构建好同源重组载体,转化B.anthracisAP422,通过一系列筛选得到带有抗性标记的重组菌.然后,通过转入Cre重组酶表达质粒,去除抗性标记,得到eag基因缺失的重组菌,并在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行了系统的鉴定.最终建立了Cre-LoxP系统在B.anthracis中的应用方法,并成功敲除eag基因. 展开更多
关键词 炭疽芽胞杆菌 Cre-LoxP系统 eag基因 同源重组 基因敲除
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全细胞催化合成L-苯基乳酸重组大肠杆菌的构建 被引量：9
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作者 王颖 范铭 +3 位作者 薛素妹 钱凯 齐斌 朱益波 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2015年第12期13-17,共5页
苯基乳酸是一种新型天然广谱抑菌物质,L-乳酸脱氢酶是微生物转化苯丙酮酸合成L-苯基乳酸的关键酶,通过构建过量表达L-乳酸脱氢酶的重组大肠杆菌,提高大肠杆菌合成L-苯基乳酸(苯基乳酸,phenyllactic acid,PLA)的能力。以Bacillus megater... 苯基乳酸是一种新型天然广谱抑菌物质,L-乳酸脱氢酶是微生物转化苯丙酮酸合成L-苯基乳酸的关键酶,通过构建过量表达L-乳酸脱氢酶的重组大肠杆菌,提高大肠杆菌合成L-苯基乳酸(苯基乳酸,phenyllactic acid,PLA)的能力。以Bacillus megaterium Z2013513基因组为模板,经PCR扩增得到L-乳酸脱氢酶基因,连接表达载体p ET-28a(+)并导入到大肠杆菌BL21(DE3),获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/p ET-28a-ldh L。SDS-PAGE电泳和酶活分析表明,约在40 ku处出现显著特异性条带,粗酶液酶活力达3.4 U/mg。在37℃、200 r/min条件下,25 g/L(干重)重组大肠杆菌经60 min将70.32 mmol/L苯丙酮酸全细胞转化合成50.59 mmol/L L-苯基乳酸。由于具有较高的产物光学纯度(96.98%e.e.)和底物摩尔转化率(71.94%),表明一步生物转化法能高效地合成L-苯基乳酸。 展开更多
关键词 L-苯基乳酸 L-乳酸脱氢酶 巨大芽孢杆菌 重组大肠杆菌 全细胞转化
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枯草芽孢杆菌高效表达系统的构建 被引量：3
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作者 毕台飞 胡雄斌 +1 位作者 宋巍 杨明明 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2011年第11期71-79,88,共10页
【目的】优化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)启动子和表达宿主,构建其高效的表达系统,为重组枯草芽孢杆菌的研究和应用奠定基础。【方法】以β-半乳糖苷酶编码基因为报告基因,以诱导型的枯草芽孢杆菌麦芽糖操纵元启动子为调控元件、... 【目的】优化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)启动子和表达宿主,构建其高效的表达系统,为重组枯草芽孢杆菌的研究和应用奠定基础。【方法】以β-半乳糖苷酶编码基因为报告基因,以诱导型的枯草芽孢杆菌麦芽糖操纵元启动子为调控元件、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒为载体骨架,构建枯草芽孢杆菌高效表达载体pGJ222,将其电转化到B.subtilis 1A747菌株后进行诱导表达试验和葡萄糖抑制试验。利用同源重组的方法,用枯草芽孢杆菌组成型启动子P43替换了B.subtilis野生型菌株1A747麦芽糖操纵元的上游调控序列,得到优化重组表达宿主菌B.subtilis BCYL,将pGJ222转入B.subtilis BCYL后,对优化的表达系统进行诱导表达试验和葡萄糖抑制试验。分别用PCR扩增大肠杆菌和枯草芽孢杆菌维生素B12合成前期途径的谷氨酰-tRNA合成酶编码基因hemA,构建其表达载体,并将其转化B.subtilis BCYL中进行诱导表达检测。【结果】成功构建了枯草芽孢杆菌高效表达载体pGJ222,并实现了β-半乳糖苷酶的高效表达,其表达量占总可溶性蛋白的18%;质量分数5%的麦芽糖诱导24hβ-半乳糖苷酶活达到16U/mL。成功获得了优化重组表达宿主菌B.subtilis BCYL,其可使β-半乳糖苷酶活性有大幅度提高,在质量分数5%麦芽糖诱导24hβ-半乳糖苷酶活达到21U/mL,葡萄糖的抑制作用明显减弱。【结论】通过对启动子和表达宿主的优化,获得了枯草芽孢杆菌高效表达系统,为枯草芽孢杆菌基因工程研究提供了有力工具。 展开更多
关键词 枯草芽孢杆菌 表达系统 同源重组 Β-半乳糖苷酶
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重组巨大芽孢杆菌产青霉素G酰化酶发酵条件研究 被引量：9
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作者 范超 黎继烈 +4 位作者 吴浩 朱晓媛 郝聚喜 丁丽霞 张蕾 《中南林业科技大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第7期124-129,135,共7页
对重组巨大芽孢杆菌产胞外青霉素G酰化酶的发酵条件进行优化。先用单因素实验确定最适碳源、氮源以及碳源浓度、氮源浓度、发酵时间和发酵温度的范围。采用Box-Behnken实验设计和响应面分析方法,对重组巨大芽孢杆菌产青霉素G酰化酶的发... 对重组巨大芽孢杆菌产胞外青霉素G酰化酶的发酵条件进行优化。先用单因素实验确定最适碳源、氮源以及碳源浓度、氮源浓度、发酵时间和发酵温度的范围。采用Box-Behnken实验设计和响应面分析方法,对重组巨大芽孢杆菌产青霉素G酰化酶的发酵条件进行优化,得出其最佳发酵条件为:葡萄糖32 g/L、胰蛋白胨17 g/L、时间42.5 h、温度34℃,在此条件下青霉素G酰化酶的活力达到10 614±8 U/L,较优化前提高了16.83%。 展开更多
关键词 重组巨大芽孢杆菌 青霉素G酰化酶 Box-Behnken实验设计 响应面法 发酵条件
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遗传工程微生物细胞间发生的自然遗传转化 被引量：5
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作者 陈琪 陈向东 +1 位作者 谢志雄 沈萍 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2000年第3期140-143,共4页
将两株具有不同遗传标记的枯草芽孢杆菌在基本培养基中分别培养至对数生长后期后进行短时间混合静置培养 ,经选择平板筛选、DNaseI敏感性试验、质粒检测和产蛋白酶活性检测 ,发现两菌株之间可通过自然遗传转化进行染色体DNA和质粒DNA的... 将两株具有不同遗传标记的枯草芽孢杆菌在基本培养基中分别培养至对数生长后期后进行短时间混合静置培养 ,经选择平板筛选、DNaseI敏感性试验、质粒检测和产蛋白酶活性检测 ,发现两菌株之间可通过自然遗传转化进行染色体DNA和质粒DNA的交换。研究结果表明 ,自然遗传转化可在细胞间进行 ,这对揭示微生物群居的自然环境中可能存在的细胞间的DNA转移 ,以及正确评估遗传工程微生物(GEMs)的安全使用具有重要意义。 展开更多
关键词 遗传工程微生物 细胞间 自然遗传转化 重组质粒
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