为实现鳗败血假单胞菌(Pseudomonas anguilliseptica,PA)早期感染的快速诊断,基于recA基因建立了2种检测方法:SYBR Green I实时荧光定量PCR(SYBR Green I real-time quantitative PCR)和重组酶介导等温扩增结合侧流层析试纸条(Recombina...为实现鳗败血假单胞菌(Pseudomonas anguilliseptica,PA)早期感染的快速诊断,基于recA基因建立了2种检测方法:SYBR Green I实时荧光定量PCR(SYBR Green I real-time quantitative PCR)和重组酶介导等温扩增结合侧流层析试纸条(Recombinase-mediated isothermal amplification combined with lateral flow dipstick,RAA-LFD)。以PA的管家基因recA为靶标,设计筛选出1对qPCR特异性引物、1对RAA特异性引物和RAA探针,并通过同源重组构建标准品质粒pUC18-recA,以建立2种检测方法。将所建立的方法应用于PA感染的大口黑鲈(Micropterus salmoides)组织样本检测,并测定PA载量。结果表明,建立的qPCR方法最低DNA检测浓度为2.816×10^(2)拷贝·μL^(-1),模板量与Ct值在构建的标准曲线中呈现良好的线性关系(r^(2)=0.9992),且具有较强的特异性和较高的稳定性;RAA-LFD方法的最低DNA检测浓度为2.816×10^(4)拷贝·μL^(-1),检测时间最快可达15 min,显色较为稳定且特异性强。应用结果显示,qPCR和RAALFD方法的阳性样本检出率分别为87.50%和85.00%,较普通PCR方法明显提高;其中,qPCR方法可准确测定PA感染宿主组织中的菌体载量,肾中的载量最高,达3.533×10^(7)拷贝·ng^(-1)。建立的2种方法特异性均较好,其中qPCR方法灵敏性更高,RAA-LFD方法则时效性更强,均可用于PA早期感染的检测,且qPCR方法还可对感染宿主体内的菌体载量进行定量分析。展开更多
目的为了提高微量样本中miRNA的检测通量和检测效率,本文建立了一种能够同时准确定量两种miRNA的双重实时荧光定量PCR(real time fluorogenic quantitative PCR)检测体系,并通过实际样本检测验证其应用于体液鉴别的效果。方法设计适用于...目的为了提高微量样本中miRNA的检测通量和检测效率,本文建立了一种能够同时准确定量两种miRNA的双重实时荧光定量PCR(real time fluorogenic quantitative PCR)检测体系,并通过实际样本检测验证其应用于体液鉴别的效果。方法设计适用于miRNA双重检验的相关引物及探针并优化实验体系组分,建立基于TaqMan技术的miRNA双重实时荧光定量PCR检测体系并验证其特异性、灵敏度和可重复性;使用此检测体系对58份不同体液样本中的miR-451a与miR-21-5p进行检测,并借助miR-451a与miR-21-5p的比值鉴定法评估该体系的体液鉴别能力;使用该检测体系样本数据确定的最佳截断值对模拟案件样本进行鉴别。结果优化的检测体系能够实现对血液与非血液、月经血与外周血的100%区分,同时可以实现对模拟案件样本的准确鉴别。结论该双重实时荧光定量PCR检测体系将时间和材料成本均缩短至原来的一半,为后续建立更多重的实时荧光定量PCR检测体系并应用于体液鉴别打下了基础。展开更多
文摘为实现鳗败血假单胞菌(Pseudomonas anguilliseptica,PA)早期感染的快速诊断,基于recA基因建立了2种检测方法:SYBR Green I实时荧光定量PCR(SYBR Green I real-time quantitative PCR)和重组酶介导等温扩增结合侧流层析试纸条(Recombinase-mediated isothermal amplification combined with lateral flow dipstick,RAA-LFD)。以PA的管家基因recA为靶标,设计筛选出1对qPCR特异性引物、1对RAA特异性引物和RAA探针,并通过同源重组构建标准品质粒pUC18-recA,以建立2种检测方法。将所建立的方法应用于PA感染的大口黑鲈(Micropterus salmoides)组织样本检测,并测定PA载量。结果表明,建立的qPCR方法最低DNA检测浓度为2.816×10^(2)拷贝·μL^(-1),模板量与Ct值在构建的标准曲线中呈现良好的线性关系(r^(2)=0.9992),且具有较强的特异性和较高的稳定性;RAA-LFD方法的最低DNA检测浓度为2.816×10^(4)拷贝·μL^(-1),检测时间最快可达15 min,显色较为稳定且特异性强。应用结果显示,qPCR和RAALFD方法的阳性样本检出率分别为87.50%和85.00%,较普通PCR方法明显提高;其中,qPCR方法可准确测定PA感染宿主组织中的菌体载量,肾中的载量最高,达3.533×10^(7)拷贝·ng^(-1)。建立的2种方法特异性均较好,其中qPCR方法灵敏性更高,RAA-LFD方法则时效性更强,均可用于PA早期感染的检测,且qPCR方法还可对感染宿主体内的菌体载量进行定量分析。
文摘目的为了提高微量样本中miRNA的检测通量和检测效率,本文建立了一种能够同时准确定量两种miRNA的双重实时荧光定量PCR(real time fluorogenic quantitative PCR)检测体系,并通过实际样本检测验证其应用于体液鉴别的效果。方法设计适用于miRNA双重检验的相关引物及探针并优化实验体系组分,建立基于TaqMan技术的miRNA双重实时荧光定量PCR检测体系并验证其特异性、灵敏度和可重复性;使用此检测体系对58份不同体液样本中的miR-451a与miR-21-5p进行检测,并借助miR-451a与miR-21-5p的比值鉴定法评估该体系的体液鉴别能力;使用该检测体系样本数据确定的最佳截断值对模拟案件样本进行鉴别。结果优化的检测体系能够实现对血液与非血液、月经血与外周血的100%区分,同时可以实现对模拟案件样本的准确鉴别。结论该双重实时荧光定量PCR检测体系将时间和材料成本均缩短至原来的一半,为后续建立更多重的实时荧光定量PCR检测体系并应用于体液鉴别打下了基础。
