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同源重组法衣原体RNA聚合酶表达载体的构建和应用
1
作者 石禹 包小峰 《医学研究与战创伤救治》 北大核心 2025年第2期113-119,共7页
目的利用同源重组法构建衣原体RNA聚合酶(cRNAP)各亚基质粒,转化入大肠埃希菌中表达蛋白并探讨其在衣原体转录调控中的应用。方法根据Gen Bank中的基因序列设计特异性引物,聚合酶链式反应(PCR)扩增cRNAP各亚基的目的基因片段,对PCR产物... 目的利用同源重组法构建衣原体RNA聚合酶(cRNAP)各亚基质粒,转化入大肠埃希菌中表达蛋白并探讨其在衣原体转录调控中的应用。方法根据Gen Bank中的基因序列设计特异性引物,聚合酶链式反应(PCR)扩增cRNAP各亚基的目的基因片段,对PCR产物进行纯化,质粒载体进行质粒抽提、质粒酶切、胶回收等处理。采用同源重组法将基因片段插入到目的载体进行片段融合构建cRNAP各亚基表达质粒,融合产物转化后用特异性引物进行PCR验证和测序。构建好的融合产物转化入大肠埃希菌化学感受态细胞表达蛋白。结果成功构建cRNAP各亚基质粒并成功表达cRNAP各亚基蛋白,研究了衣原体转录调节因子GrgA与cRNAP的直接相互作用是GrgA与cRNAP的α、β′亚基有结合,与β亚基无结合。两者可以作为衣原体感染治疗和预防的药物作用新靶点。结论同源重组法可用于构建cRNAP各亚基质粒并成功表达相应蛋白,并用于研究转录调节因子GrgA与cRNAP各亚基蛋白的结合位点,为衣原体感染治疗和预防药物作用新靶点的研究提供参考信息。 展开更多
关键词 同源重组法 衣原体 cRNAP 亚基 质粒载体 融合蛋白
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鸡球虫病7价多表位嵌合重组抗原ET seven真核质粒的构建、表达及其初步功能分析
2
作者 倪君丽 刘欣超 +7 位作者 孙栋 方肆云 王定爱 申翰钦 严专强 戚南山 孙铭飞 顾有方 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第11期5159-5172,共14页
为构建以鸡柔嫩艾美耳球虫EtAMA1、EtAMA2、EtMIC3、EtMIC4、EtMIC13、EtROP5和EtSAG1等入侵相关蛋白分子为抗原基础的多表位嵌合重组抗原ET seven真核表达质粒,同时验证其在DF-1细胞中的表达和通过不同辅助递送方式在鸡体内的表达及其... 为构建以鸡柔嫩艾美耳球虫EtAMA1、EtAMA2、EtMIC3、EtMIC4、EtMIC13、EtROP5和EtSAG1等入侵相关蛋白分子为抗原基础的多表位嵌合重组抗原ET seven真核表达质粒,同时验证其在DF-1细胞中的表达和通过不同辅助递送方式在鸡体内的表达及其免疫功能。本研究利用生信分析获得7个抗原表位,分别提取柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段虫体总RNA,通过RT-PCR扩增获得EtAMA1、EtAMA2、EtMIC3、EtMIC4、EtMIC13、EtROP5和EtSAG1等7个抗原的表位区域编码基因,构建基因图谱由公司合成以pcDNA3.1(+)为真核表达载体,构建真核表达质粒pcDNA3.1-ET seven;将鉴定阳性、测序正确的质粒pcDNA3.1-ET seven转染至DF-1细胞,利用RT-PCR和Western blot方法检测ET seven重组基因片段在DF-1细胞中的表达;以磷酸钙纳米颗粒作为辅助质粒递送佐剂检测pcDNA3.1-ET seven在鸡体内引起的细胞因子水平变化,间接ELISA检测特异性IgG抗体水平。结果显示:成功构建真核表达质粒pcDNA3.1-ET seven,RT-PCR和Western blot检测到ET seven的特异性表达,质粒通过磷酸钙纳米佐剂免疫鸡体后,检测细胞因子IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ、CD-40均在三次免疫后7 d高水平表达,其中CD-40与IL-6的表达水平最高。pcDNA3.1-ET seven重组质粒结合磷酸钙佐剂肌肉注射二次免疫后7 d间接ELISA检测特异性IgG抗体呈阳性。结果表明,pcDNA3.1-ET seven重组质粒构建成功,在鸡体内有良好的免疫原性,为鸡球虫病的疫苗防控提供新的思路和技术支撑。 展开更多
关键词 柔嫩艾美耳球虫 多表位重组质粒 真核表达 DNA疫苗
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沙门氏菌invA基因重组质粒标准的构建 被引量：4
3
作者 李正义 梁成珠 +4 位作者 贾俊涛 姜英辉 孙涛 王宇 雷质文 《食品安全质量检测学报》 CAS 2014年第7期2119-2124,共6页
目的研制沙门氏菌invA基因重组质粒,为分子生物学方法快速检测沙门氏菌提供质粒标准。方法通过PCR扩增目的片段,连接至pMD 18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,测序方法证实目的片段已成功重组,荧光定量PCR方法定性检测分析,采用PicoGreen DNA... 目的研制沙门氏菌invA基因重组质粒,为分子生物学方法快速检测沙门氏菌提供质粒标准。方法通过PCR扩增目的片段,连接至pMD 18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,测序方法证实目的片段已成功重组,荧光定量PCR方法定性检测分析,采用PicoGreen DNA分子荧光定量方法对标准质粒分子进行定值。结果 invA基因目的片段成功重组至pMD 18-T载体上,荧光定量PCR结果显示制备重组质粒标准为沙门氏菌核酸标准,重组质粒标准的浓度为2.9μg/mL。结论成功构建沙门氏菌invA基因重组质粒,为快速检测沙门氏菌奠定了基础。 展开更多
关键词 沙门氏菌 重组质粒 invA基因
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阳离子脂质体禽流感病毒HA基因重组质粒复合物的电镜研究 被引量：4
4
作者 陈吉祥 李广林 +4 位作者 薛飞群 赵青云 赵荣材 赵家政 李树本 《电子显微学报》 CAS CSCD 1998年第4期353-354,共2页
阳离子脂质体禽流感病毒ＨＡ基因重组质粒复合物的电镜研究陈吉祥李广林薛飞群赵青云赵荣材（中国农科院兰州畜牧与兽药研究所，兰州７３００５０）赵家政李树本（中国科学院兰州化学物理研究所，兰州７３００００）阳离子脂质体已被成... 阳离子脂质体禽流感病毒ＨＡ基因重组质粒复合物的电镜研究陈吉祥李广林薛飞群赵青云赵荣材（中国农科院兰州畜牧与兽药研究所，兰州７３００５０）赵家政李树本（中国科学院兰州化学物理研究所，兰州７３００００）阳离子脂质体已被成功地用于重组质粒在体内外的基因转移... 展开更多
关键词 阳离子脂质体 禽流感病毒 HA基因 重组质粒 电镜
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重组DKK1及pCMV-HA2/DKK1重组质粒对宫颈癌细胞体外增殖作用的影响 被引量：6
5
作者 陆奎英 崔素芬 +4 位作者 徐亮 张玲玲 丁永玲 覃文新 包广宇 《临床检验杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第11期898-901,共4页
目的观察人重组DKK1和pCMV-HA2/DKK1重组质粒对体外培养宫颈癌细胞株Hela细胞增殖的影响。方法体外培养Hela细胞,非放射性细胞增殖(MTS)法检测重组DKK1、抗DKK1抗体和人源DKK1真核表达质粒pCMV-HA2/DKK1对Hela细胞增殖作用的影响,wester... 目的观察人重组DKK1和pCMV-HA2/DKK1重组质粒对体外培养宫颈癌细胞株Hela细胞增殖的影响。方法体外培养Hela细胞,非放射性细胞增殖(MTS)法检测重组DKK1、抗DKK1抗体和人源DKK1真核表达质粒pCMV-HA2/DKK1对Hela细胞增殖作用的影响,western blot及ELISA法检测转染pCMV-HA2/DKK1重组质粒后Hela细胞中DKK1蛋白的表达情况。结果与对照组相比,10,50 ng/mL的DKK1对Hela细胞有明显抑制作用(F分别为162.31,184.65,P均<0.01);抗DKK1抗体对Hela细胞的增殖影响无统计学意义(P均>0.05);pCMV-HA2/DKK1重组质粒转染Hela细胞后对细胞增殖有明显抑制作用,加入抗DKK1抗体不能完全拮抗pCMV-HA2/DKK1对Hela细胞的抑制作用;pCMV-HA2/DKK1重组质粒转染Hela细胞后可检测到DKK1蛋白表达,经western blot证实为DKK1蛋白(Mr约为38 000),ELISA法结果表明,DKK1蛋白的分泌量随培养时间的延长而增加,第5天时达峰值(19.82 mg/L)。结论重组DKK1和人源DKK1真核表达质粒pCMV-HA2/DKK1可抑制Hela细胞的增殖,抗DKK1抗体可部分抵抗DKK1的抑制作用,提示DKK1在宫颈癌肿瘤发生中对肿瘤细胞具有抑制作用。 展开更多
关键词 重组DKK1 真核表达质粒 pCMV-HA2/DKK1 HELA细胞 细胞增殖
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猪IFN-γ和IL-4重组质粒对口蹄疫疫苗的免疫佐剂效应研究 被引量：4
6
作者 蒙学莲 房永祥 +3 位作者 窦永喜 陈国华 景志忠 才学鹏 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第9期1240-1244,共5页
为了研究猪IFN-γ和IL-4对疫苗的免疫佐剂效应,用pcDNA3.1/IFN-γ和pcDNA3.1/IL-4的重组质粒与口蹄疫双价疫苗配伍免疫小鼠,检测小鼠抗口蹄疫抗体水平和CD4+/CD8+T细胞比值的动态变化,观察其免疫佐剂效应。结果表明pcDNA3.1/IFN-γ和pcD... 为了研究猪IFN-γ和IL-4对疫苗的免疫佐剂效应,用pcDNA3.1/IFN-γ和pcDNA3.1/IL-4的重组质粒与口蹄疫双价疫苗配伍免疫小鼠,检测小鼠抗口蹄疫抗体水平和CD4+/CD8+T细胞比值的动态变化,观察其免疫佐剂效应。结果表明pcDNA3.1/IFN-γ和pcDNA3.1/IL-4重组质粒都能显著提高小鼠抗口蹄疫抗体水平(P<0.01),其中pcDNA3.1/IFN-γ提高亚洲Ⅰ型FMD抗体水平的佐剂效应较pcDNA3.1/IL-4的显著(P<0.01),而pcDNA3.1/IL-4提高O型FMD抗体水平的佐剂效应显著高于pcDNA3.1/IFN-γ(P<0.01),pcDNA3.1也显示出了一定的佐剂效应;免疫后不同时间pcDNA3.1/IFN-γ和pcDNA3.1/IL-4组CD4+/CD8+T细胞比值显著高于其他组(P<0.01),且第21天与第7、45天的差异极显著(P<0.01)。 展开更多
关键词 重组质粒 佐剂效应 CD4+/CD8+T细胞 口蹄疫
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影响生长抑素重组质粒pEGS／2SS转染HeLa细胞效果的因素研究 被引量：4
7
作者 何晓红 曹少先 +1 位作者 茆达干 杨利国 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第3期279-285,共7页
旨在分析生长抑素重组质粒pEGS/2SS转染HeLa细胞(人宫颈癌上皮细胞)转染效果的影响因素,探讨最佳转染条件,为进一步研究生长抑素基因疫苗的作用机制和作用效果奠定基础。以脂质体转染法将带有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的重组质粒pEGS/... 旨在分析生长抑素重组质粒pEGS/2SS转染HeLa细胞(人宫颈癌上皮细胞)转染效果的影响因素,探讨最佳转染条件,为进一步研究生长抑素基因疫苗的作用机制和作用效果奠定基础。以脂质体转染法将带有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的重组质粒pEGS/2SS转染HeLa细胞,探讨质粒转染HeLa细胞最佳条件的4个参数:质粒DNA剂量、脂质体剂量、最佳转染时间和质粒提取方法,在荧光显微镜下观察细胞转染情况并计算转染率。结果:在六孔细胞培养板上,当DNA/脂质体剂量为1μg/6μg时,转染效率最高,在转染后72 h达到34.02%;当用Plasmid Maxi Kit试剂盒提取质粒,转染时间为48 h,转染效率最高,达到17.88%。重组质粒pEGS/2SS转染He-La细胞条件是:采用试剂盒(Plasmid Maxi Kit)提取的质粒,DNA和脂质体的剂量分别为1μg与6μg,转染时间48 h,此时的转染效率最高,达17.88%。 展开更多
关键词 脂质体 HELA细胞 生长抑素重组质粒pEGS/2SS
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结核分支杆菌phoS2重组质粒的构建、表达、纯化及生物信息学预测 被引量：2
8
作者 丁淑琴 徐文锦 +1 位作者 杨园园 杨风琴 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2014年第3期306-310,共5页
目的构建结核分支杆菌phoS2表达重组质粒、原核表达及纯化重组蛋白，并对重组蛋白进行免疫学特性的初步鉴定。方法将目的基因亚克隆到pET32a表达载体，成功构建的重组质粒双酶切鉴定并测序。加IPTG诱导表达，表达产物经SDS-PAGE鉴定后用... 目的构建结核分支杆菌phoS2表达重组质粒、原核表达及纯化重组蛋白，并对重组蛋白进行免疫学特性的初步鉴定。方法将目的基因亚克隆到pET32a表达载体，成功构建的重组质粒双酶切鉴定并测序。加IPTG诱导表达，表达产物经SDS-PAGE鉴定后用含Ni^2＋的His-bind树脂柱亲和层析纯化phoS2，并用Westernblot对其进行鉴定。应用DNAstar等生物分析软件对该蛋白的理化特性、跨膜区域、二级结构、三维结构进行预测。结果双酶切鉴定及测序分析表明，成功构建了基因工程菌株高效表达质粒phos2／pET32a。IPTG诱导表达的SDS-PAGE鉴定结果显示，上清液中只见极少量的特异蛋白表达带，沉淀部分可见明显的特异表达带，说明phoS2主要是包涵体表达。经免疫印迹分析获得的phoS2分子质量为37953ku。生物信息学预测该蛋白分子质量为37953．1ku，理论等电点为5．75，具有1个跨膜区，位于1-19位，结构域位于1-370位。结论成功构建了结核分支杆菌phoS2／pET32a重组质粒，phoS2能够高效表达。蛋白结构功能的预测对本实验的实施及进一步的研究提供了理论依据。 展开更多
关键词 结核分支杆菌 phoS2 重组质粒 表达 纯化 生物信息学 预测
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重组质粒pEGFP-N1-Twist对SKOV3细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响 被引量：3
9
作者 尉春艳 张熙 +3 位作者 孙学军 彭慧霞 贺赛 王桂贤 《山西医科大学学报》 CAS 2014年第8期695-698,784,785,共6页
目的评估重组质粒pEGFP-N1-Twist对卵巢癌SKOV3细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响。方法将pEGFP-N1-Twist转染入SKOV3细胞系,用real-time PCR和Western blot检测Twist基因与蛋白的表达情况;通过Transwell及MTT试验检测pEGFP-N1-Twist对SK... 目的评估重组质粒pEGFP-N1-Twist对卵巢癌SKOV3细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响。方法将pEGFP-N1-Twist转染入SKOV3细胞系,用real-time PCR和Western blot检测Twist基因与蛋白的表达情况;通过Transwell及MTT试验检测pEGFP-N1-Twist对SKOV3细胞的作用。结果转染了pEGFP-N1-Twist的SKOV3细胞中Twist基因/蛋白的表达明显上调;转染组较空白对照组侵袭及迁移能力增强(P<0.05),细胞增殖能力明显增加(P<0.05)。结论成功构建了Twist基因的真核表达载体并能在细胞内稳定表达,Twist基因能增强SKOV3细胞的侵袭及迁移能力、细胞增殖能力。 展开更多
关键词 重组质粒 TWIST基因 卵巢癌 真核表达载体pEGFP-N1 基因克隆
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重组质粒pEGFP-N1-Twist的构建、表达及其对SKOV3细胞克隆形成能力的影响 被引量：1
10
作者 尉春艳 张熙 +3 位作者 孙学军 彭慧霞 史玉霞 王桂贤 《西安交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2014年第4期447-450,共4页
目的构建含有Twist基因的重组质粒pEGFP-N1-Twist,为进一步研究上皮性卵巢癌的发生及转移机制奠定基础。方法生物合成Twist cDNA基因序列,定向克隆至pEGFP-N1表达载体内,将pEGFP-N1-Twist转染入SKOV3细胞系,用Real-time PCR和Western b... 目的构建含有Twist基因的重组质粒pEGFP-N1-Twist,为进一步研究上皮性卵巢癌的发生及转移机制奠定基础。方法生物合成Twist cDNA基因序列,定向克隆至pEGFP-N1表达载体内,将pEGFP-N1-Twist转染入SKOV3细胞系,用Real-time PCR和Western blot检测Twist基因的表达情况;通过克隆形成实验检测pEGFP-N1-Twist对SKOV3细胞的作用。结果 Twist基因的cDNA已克隆到真核细胞表达载体pEGFP-N1中,将pEGFP-N1-Twist转染入SKOV3细胞后,Twist基因/蛋白的表达明显上调,转染组较对照组克隆形成明显增加(P<0.05)。结论成功构建了Twist基因的真核表达载体并能在细胞内稳定表达,Twist基因能增强SKOV3细胞的克隆形成能力。 展开更多
关键词 重组质粒 TWIST基因 卵巢癌 真核表达载体pEGFP-N1 基因克隆
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牛瑟氏泰勒虫热休克蛋白70的克隆与原核表达重组质粒的构建 被引量：1
11
作者 王轶男 贾立军 +3 位作者 薛书江 胡诗悦 钱年超 张守发 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2013年第2期60-63,共4页
为了构建牛瑟氏泰勒虫热休克蛋白70(HSP70)基因片段原核重组表达质粒,本试验根据Gen-Bank上登录的牛瑟氏泰勒虫热休克蛋白70基因序列(D12692.1),应用Primer Premier 5.0软件设计合成一对特异性引物,以牛瑟氏泰勒虫DNA为模板,扩增片段大... 为了构建牛瑟氏泰勒虫热休克蛋白70(HSP70)基因片段原核重组表达质粒,本试验根据Gen-Bank上登录的牛瑟氏泰勒虫热休克蛋白70基因序列(D12692.1),应用Primer Premier 5.0软件设计合成一对特异性引物,以牛瑟氏泰勒虫DNA为模板,扩增片段大小为1 692bp,与参考序列的同源性为99%。将该基因与pET-28a(+)载体进行连接,成功构建了重组表达载体pET-28a-HSP70,本试验为进一步研究牛瑟氏泰勒虫HSP70基因佐剂作用、研制基因工程疫苗奠定了基础。 展开更多
关键词 牛瑟氏泰勒虫 热休克蛋白70 重组质粒
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重组质粒BT24的构建 被引量：1
12
作者 熊兴华 刘春林 +2 位作者 吴小月 张家明 郑学勤 《湖南农业大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 1998年第3期199-202,共4页
用ＢａｍＨⅠ从植物表达载体ｐＢＨ１９中，酶切回收含３５Ｓ启动子与Ｎｏｓ终止子的胰蛋白酶抑制因子基因（ＨＲＴＩ）片段，将其克隆到植物表达载体ｐＴＨＹ４８的ＢａｍＨⅠ位点，构建具潮霉素选择标记的植物表达载体ｐＢＴ２４．经... 用ＢａｍＨⅠ从植物表达载体ｐＢＨ１９中，酶切回收含３５Ｓ启动子与Ｎｏｓ终止子的胰蛋白酶抑制因子基因（ＨＲＴＩ）片段，将其克隆到植物表达载体ｐＴＨＹ４８的ＢａｍＨⅠ位点，构建具潮霉素选择标记的植物表达载体ｐＢＴ２４．经Ａｇａｒｏｓｅｇｅｌ检测和酶切鉴定，获得具有胰蛋白酶抑制因子基因和潮霉素抗性基因的植物表达载体ｐＢＴ２４． 展开更多
关键词 重组质粒BT24 植物表达载体 载体构建 抗性基因
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Omi/HtrA2 shRNA重组真核表达质粒的构建及其在大鼠肾小管上皮细胞缺氧/复氧模型中的作用 被引量：1
13
作者 王利华 乔晞 +1 位作者 董华 李荣山 《山西医科大学学报》 CAS 2008年第3期214-217,共4页
目的构建在哺乳动物细胞中表达的Omi/HtrA2短发夹RNA(shRNA)的表达质粒,观察其对大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E缺氧/复氧模型中Omi/HtrA2表达的影响。方法根据Genbank中Omi/HtrA2 mRNA分别设计2对多聚核苷酸序列,退火形成互补双链DNA,分别... 目的构建在哺乳动物细胞中表达的Omi/HtrA2短发夹RNA(shRNA)的表达质粒,观察其对大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E缺氧/复氧模型中Omi/HtrA2表达的影响。方法根据Genbank中Omi/HtrA2 mRNA分别设计2对多聚核苷酸序列,退火形成互补双链DNA,分别克隆至经双酶切后的载体Pgenesil-1上,构建Omi/HtrA2特异性的shRNA表达载体PGP1和PGP2,进行酶切和测序鉴定。制作NRK-52E缺氧/复氧模型,将表达质粒通过脂质体介导转染NRK-52E,Western blot检测Omi/HtrA2蛋白质表达。结果将合成的DNA片段退火后克隆至Pgenesil-1载体上,构建Omi/HtrA2特异shRNA表达载体PGP1和PGP2;经酶切和测序证实构建成功,无碱基突变发生。将表达质粒介导转染NRK-52E缺氧/复氧模型后,细胞Omi/HtrA2蛋白质表达显著降低。结论成功构建针对大鼠Omi/HtrA2基因的shRNA表达载体PGP1和PGP2,它们能有效抑制NRK-52E缺氧/复氧模型中Omi/HtrA2表达。 展开更多
关键词 OMI/HTRA2 SHRNA 重组质粒
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肺炎衣原体膜表面蛋白重组质粒的构建 被引量：1
14
作者 周林福 朱海红 +1 位作者 陈离伟 周云连 《科技通报》 北大核心 2004年第2期172-174,177,共4页
目的构建表达肺炎衣原体膜表面蛋白(OMP)的重组质粒,并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白.方法用高保真PCR方法从肺炎衣原体扩增OMP片段,双酶切后插入原核表达质粒pQE 30,在大肠杆菌M15中表达.结果　重组质粒经双酶切鉴定与目的基因长... 目的构建表达肺炎衣原体膜表面蛋白(OMP)的重组质粒,并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白.方法用高保真PCR方法从肺炎衣原体扩增OMP片段,双酶切后插入原核表达质粒pQE 30,在大肠杆菌M15中表达.结果　重组质粒经双酶切鉴定与目的基因长度相符;各表达蛋白经SDS PAGE分析,相对分子量与文献相符.结论　该重组质粒可用于核酸疫苗的备选质粒,基因重组菌表达的融合蛋白有可能作为有效抗原用于肺炎衣原体检测试剂盒的制备. 展开更多
关键词 肺炎衣原体 膜表面蛋白 重组质粒
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重组真核表达质粒pHsp70-hsv-tk的构建及在细胞内的热诱导表达 被引量：1
15
作者 唐秋莎 陈道桢 张东生 《医学研究生学报》 CAS 2008年第11期1132-1137,共6页
目的:构建用于靶向基因治疗的重组真核表达质粒pHsp70-hsv-tk(pHT),体外转染SMMC-7721肝癌细胞,观察热诱导基因表达情况。方法:设计1对引物,以pHSV-106质粒为模板进行PCR扩增,将扩增产物纯化所得目的基因片段与pD3SX载体连接,转化大肠杆... 目的:构建用于靶向基因治疗的重组真核表达质粒pHsp70-hsv-tk(pHT),体外转染SMMC-7721肝癌细胞,观察热诱导基因表达情况。方法:设计1对引物,以pHSV-106质粒为模板进行PCR扩增,将扩增产物纯化所得目的基因片段与pD3SX载体连接,转化大肠杆菌E.coliDH5α,克隆PCR法筛选菌落,测序鉴定后大量抽提质粒。磁性转染法将pHT导入SMMC-7721,加热处理后,用RT-PCR法检测tk基因的整合。结果:获得重组的hsv-tk基因条带。结论:成功构建了pHT质粒,可用于进行靶向性基因治疗研究。 展开更多
关键词 真核表达 pHsp70-hsv-tk 构建 热诱导表达 重组真核表达质粒
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共表达VP3与hIL-18基因真核重组质粒的构建及对人结肠癌细胞的影响 被引量：1
16
作者 金宁一 连海 +5 位作者 米志强 李肖 徐敬龙 金洪涛 解丽华 李萍 《高技术通讯》 EI CAS CSCD 2003年第9期43-46,共4页
先将鸡贫血病毒VP3基因插入真核表达载体pVAX1的多克隆位点,再将pIRES1载体上的IRES启动子及新霉素基因一同切下插入pVAX1的VP3基因下游,然后切下新霉素基因,将hIL-18基因插入其中,构建成pVVP3IL-18,将pVVP3IL-18转染Hela细胞。间接免... 先将鸡贫血病毒VP3基因插入真核表达载体pVAX1的多克隆位点,再将pIRES1载体上的IRES启动子及新霉素基因一同切下插入pVAX1的VP3基因下游,然后切下新霉素基因,将hIL-18基因插入其中,构建成pVVP3IL-18,将pVVP3IL-18转染Hela细胞。间接免疫荧光表明,在细胞膜和细胞浆观察到了特异的黄绿色荧光,证明表达了hIL-18。pVVP3IL-18转染人结肠癌细胞HCT-116后,经AO/EB染色及电镜观察,可见大量细胞凋亡。说明真核重组质粒pVVP3IL-18可在HeLa细胞中表达,并可在体外诱导人结肠癌细胞HCT-116凋亡。 展开更多
关键词 鸡贫血病毒 真核表达 载体 VP3 hIL-18 IRES启动子 HELA细胞 结肠癌细胞 凋亡素 真核重组质粒
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产丙酮酸氧化酶重组大肠杆菌的发酵过程质粒稳定性研究 被引量：3
17
作者 赵劼 王永红 +2 位作者 储炬 张嗣良 庄英萍 《常熟理工学院学报》 2015年第4期1-7,共7页
研究了碳源、温度、溶氧、pH值及外源丙酮酸氧化酶表达对重组大肠杆菌DH5α/pSML-PyOD质粒稳定性的影响.结果表明,以甘油为碳源,37℃,装液量10%~15%条件下重组菌质粒稳定性最好.当发酵过程中体系pH值在6~7之间时,质粒稳定性较高,但当pH... 研究了碳源、温度、溶氧、pH值及外源丙酮酸氧化酶表达对重组大肠杆菌DH5α/pSML-PyOD质粒稳定性的影响.结果表明,以甘油为碳源,37℃,装液量10%~15%条件下重组菌质粒稳定性最好.当发酵过程中体系pH值在6~7之间时,质粒稳定性较高,但当pH提高至7.5时,质粒稳定性会有所下降,重组菌在低pH值条件下有利于产丙酮酸氧化酶.外源蛋白表达使得重组菌质粒稳定性有所下降. 展开更多
关键词 丙酮酸氧化酶 重组大肠杆菌 DH5α/pSMLPyOD 质粒稳定性
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基因重组质粒稳定性与苯丙氨酸发酵的研究 被引量：1
18
作者 梁世中 高河泳 关达治 《华南理工大学学报（自然科学版）》 EI CAS CSCD 1991年第3期1-7,共7页
本研究应用具有苯丙氨酸生产基因 pheA^(FR)、aroF^(FR)、CI_(857) 的质粒 pSY130～14和质粒 pS Y16,重组构建了具有苯丙氨酸生产基因系统的新质粒 pSY200-14。然后,使其转化到大肠菌 AT2471中,育成了基因重组菌株 AT2471/pSY200-14。... 本研究应用具有苯丙氨酸生产基因 pheA^(FR)、aroF^(FR)、CI_(857) 的质粒 pSY130～14和质粒 pS Y16,重组构建了具有苯丙氨酸生产基因系统的新质粒 pSY200-14。然后,使其转化到大肠菌 AT2471中,育成了基因重组菌株 AT2471/pSY200-14。试验表明,新菌株质粒稳定性比原菌株有较大的提高。在2. 5升通气搅拌罐进行苯丙氨酸发酵试验,在搅拌转速850rpm、通气速率1. 0VVM,38. 5℃和 pH7. 0的条件下,发酵48小时苯丙氨酸生成量达14. 2g/L,比原菌株 AT2471/pSY130-14增产11. 8%。 展开更多
关键词 基因 重组 质粒 苯丙氨酸 发酵
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TUB2基因重组质粒的构建、鉴定及其在毛壳菌中的转化 被引量：1
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作者 迟玉杰 杨谦 《高技术通讯》 EI CAS CSCD 2003年第2期34-40,共7页
根据苯并咪唑类杀菌剂抗性基因的核酸序列 ,在其阅读框架外的上、下游设计一对特异性引物 ,并在其 5′ 端分别加上PstI位点。以pRB12 9质粒为模板 ,PCR扩增得到一条长约 1 4kb的片段 ,经酶切鉴定证明是TUB2基因。将此PCR产物经消化后与... 根据苯并咪唑类杀菌剂抗性基因的核酸序列 ,在其阅读框架外的上、下游设计一对特异性引物 ,并在其 5′ 端分别加上PstI位点。以pRB12 9质粒为模板 ,PCR扩增得到一条长约 1 4kb的片段 ,经酶切鉴定证明是TUB2基因。将此PCR产物经消化后与同样酶切的pTA质粒连接 ,构建出 pTA TUB2质粒并转化大肠杆菌。再以pTA TUB2质粒为模板 ,PCR扩增该目的基因 ,通过对其核苷酸序列分析证明构建的质粒是含TUB2基因的 pTA TUB2质粒。利用PEG方法 ,将该质粒转化毛壳菌 ,使得对多菌灵非常敏感的毛壳菌能够在 30 0 μg/ml多菌灵的培养基上正常生长 ,其抗药性提高 30 0倍以上 ,且转化稳定性试验表明 ,其抗药性在非选择性培养基上连续培养 10代保持不变。结果表明质粒pTA TUB2对毛壳菌的转化率为 2 7/ (2× 10 5)。 展开更多
关键词 TUB2基因 鉴定 毛壳菌 转化 杀菌剂 基因工程 基因重组质粒 生物防治 抗苯并咪唑类基因
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弓形体重组质粒pcDNA_3-SAG1免疫小鼠诱导的细胞免疫应答研究 被引量：2
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作者 周永安 陈观今 +1 位作者 郭虹 吕芳丽 《山西临床医药》 2001年第5期335-338,共4页
目的 :用 pc DNA3- SAG1真核表达质粒直接免疫小鼠 ,观察 DNA免疫所诱导的小鼠细胞免疫应答 ,为研制弓形虫疫苗奠定基础。方法 :大量制备重组质粒 pc DAN3- SAG1,然后将其导入 BAL B/ c小鼠体内 ,每隔 2 1d接种一次 ,一共免疫三次。用 ... 目的 :用 pc DNA3- SAG1真核表达质粒直接免疫小鼠 ,观察 DNA免疫所诱导的小鼠细胞免疫应答 ,为研制弓形虫疫苗奠定基础。方法 :大量制备重组质粒 pc DAN3- SAG1,然后将其导入 BAL B/ c小鼠体内 ,每隔 2 1d接种一次 ,一共免疫三次。用 MTT方法对脾脏的 NK细胞和其淋巴细胞的转化率进行测定 ;采用免疫荧光法对 CD4+、CD8+ 细胞进行测定。结果 :实验组 NK细胞杀伤率为 :70 .0± 3.6 4,而 pc DNA3及空白对照分别为 :48.5± 6 .0 8和 47.0± 5 .93。实验组 NK细胞活性比对照组明显增高 (P<0 .0 5 ) ,而 pc DNA3质粒及空白对照组差异无显著性 (P>0 .0 5 ) ;对 T淋巴细胞亚群 CD4+、CD8+进行动态分析 ,可见随着感染时间的延长 ,CD8+的数量逐渐上升 ,CD4+ / CD8+的比率逐渐下降 ,实验组与 pc DNA3质粒及空白对照有明显差异 (P<0 .0 5 ) ;Con A刺激小鼠淋巴细胞转化实验 ,能刺激免疫鼠及对照鼠淋巴细胞增生 ,实验组与 pc DNA3质粒及空白对照组差异无显著性 (P>0 .0 5 )。结论 :重组质粒pc DNA3- SAG1免疫 BAL B/ c小鼠可诱导一定的细胞免疫。 展开更多
关键词 弓形体 重组质粒 pcDNA3-SAG1 DNA疫苗 细胞免疫 免疫应答
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