【目的】探究关键病毒基因和辅助基因对rAAV生产的影响以指导病毒基因表达框的理性设计和工艺优化,实现rAAV生产效率的提升。【方法】首先,明确用于生产rAAV的关键基因元件rep和cap基因的组成和比例,以及辅助病毒基因的关键序列对rAAV...【目的】探究关键病毒基因和辅助基因对rAAV生产的影响以指导病毒基因表达框的理性设计和工艺优化,实现rAAV生产效率的提升。【方法】首先,明确用于生产rAAV的关键基因元件rep和cap基因的组成和比例,以及辅助病毒基因的关键序列对rAAV生产的影响。然后,据此理性设计质粒上rAAV病毒基因表达框,构建新型三质粒系统。最后,通过对新型三质粒系统关键工艺参数进行优化,建立基于新型三质粒系统的rAAV高效生产工艺。【结果】合理的rep基因和cap基因表达比例对rAAV生产至关重要,辅助病毒基因表达框中仅保留关键蛋白序列E4orf6(adenovirus early region 4 open reading frame 6,E4orf6)和DBP(DNA binding protein,DBP)即可实现同样的rAAV生产效率。据此结果重新设计的新型三质粒系统瞬时转染人胚胎肾细胞(human embryonic kidney 293 cells,HEK293)时,rAAV基因组滴度较传统三质粒系统提高2.6倍。在进一步优化该系统的转染参数后,基因组滴度达到7.8×10^(11)vg/mL,单细胞产毒量达到1.5×10^(5)vg/cell,相较于优化前分别提高3.7倍和2.4倍。【结论】通过探究rAAV病毒基因和辅助病毒基因的组成与比例对病毒载体包装的影响,重新设计了rAAV的瞬时表达系统,优化并建立了新型三质粒系统的rAAV生产工艺,显著提高了rAAV的产量,其中基因组滴度提高16倍,单细胞产量提高10倍,为rAAV的高效工业化生产奠定了基础。展开更多
目的 :构建双亚基共表达鼠白细胞介素 - 12 (m IL- 12 )真核表达质粒 ,并观察其在体内外的表达。方法 :将m IL - 12 p35和 p4 0全长编码 c DNA构建在 pc DN A 3.1载体上 ,然后把 p35表达单元 (CMV- p35 - BGH PA)插入pc DNA 3.1/ p4 0载...目的 :构建双亚基共表达鼠白细胞介素 - 12 (m IL- 12 )真核表达质粒 ,并观察其在体内外的表达。方法 :将m IL - 12 p35和 p4 0全长编码 c DNA构建在 pc DN A 3.1载体上 ,然后把 p35表达单元 (CMV- p35 - BGH PA)插入pc DNA 3.1/ p4 0载体 ,使两个目的基因均受各自的启动子 CMV控制 ,构建成 m IL - 12双亚基共表达质粒 p Cm IL -12 ,并进行体内外表达。结果 :p Cm IL - 12在体外转染 COS- 7细胞后 ,经 EL ISA证实有 m IL- 12表达 ,其表达上清能在体外明显增强小鼠 NK细胞活性。小鼠皮内注射 p Cm IL - 12亦能增强小鼠 NK细胞活性。结论 :所构建的质粒在体内外均能表达有生物学活性的 m IL-展开更多
文摘【目的】探究关键病毒基因和辅助基因对rAAV生产的影响以指导病毒基因表达框的理性设计和工艺优化,实现rAAV生产效率的提升。【方法】首先,明确用于生产rAAV的关键基因元件rep和cap基因的组成和比例,以及辅助病毒基因的关键序列对rAAV生产的影响。然后,据此理性设计质粒上rAAV病毒基因表达框,构建新型三质粒系统。最后,通过对新型三质粒系统关键工艺参数进行优化,建立基于新型三质粒系统的rAAV高效生产工艺。【结果】合理的rep基因和cap基因表达比例对rAAV生产至关重要,辅助病毒基因表达框中仅保留关键蛋白序列E4orf6(adenovirus early region 4 open reading frame 6,E4orf6)和DBP(DNA binding protein,DBP)即可实现同样的rAAV生产效率。据此结果重新设计的新型三质粒系统瞬时转染人胚胎肾细胞(human embryonic kidney 293 cells,HEK293)时,rAAV基因组滴度较传统三质粒系统提高2.6倍。在进一步优化该系统的转染参数后,基因组滴度达到7.8×10^(11)vg/mL,单细胞产毒量达到1.5×10^(5)vg/cell,相较于优化前分别提高3.7倍和2.4倍。【结论】通过探究rAAV病毒基因和辅助病毒基因的组成与比例对病毒载体包装的影响,重新设计了rAAV的瞬时表达系统,优化并建立了新型三质粒系统的rAAV生产工艺,显著提高了rAAV的产量,其中基因组滴度提高16倍,单细胞产量提高10倍,为rAAV的高效工业化生产奠定了基础。
文摘目的 :构建双亚基共表达鼠白细胞介素 - 12 (m IL- 12 )真核表达质粒 ,并观察其在体内外的表达。方法 :将m IL - 12 p35和 p4 0全长编码 c DNA构建在 pc DN A 3.1载体上 ,然后把 p35表达单元 (CMV- p35 - BGH PA)插入pc DNA 3.1/ p4 0载体 ,使两个目的基因均受各自的启动子 CMV控制 ,构建成 m IL - 12双亚基共表达质粒 p Cm IL -12 ,并进行体内外表达。结果 :p Cm IL - 12在体外转染 COS- 7细胞后 ,经 EL ISA证实有 m IL- 12表达 ,其表达上清能在体外明显增强小鼠 NK细胞活性。小鼠皮内注射 p Cm IL - 12亦能增强小鼠 NK细胞活性。结论 :所构建的质粒在体内外均能表达有生物学活性的 m IL-
