外泌体密切参与细胞间通讯,调控细胞生理过程,是目前癌症和其他疾病早期诊断的潜在生物标志物之一。因此,具有特定功能的外泌体的检测与分离具有重要临床意义。与此同时,开发低成本、高灵敏度的外泌体特异性识别元件,将在疾病早期诊断...外泌体密切参与细胞间通讯,调控细胞生理过程,是目前癌症和其他疾病早期诊断的潜在生物标志物之一。因此,具有特定功能的外泌体的检测与分离具有重要临床意义。与此同时,开发低成本、高灵敏度的外泌体特异性识别元件,将在疾病早期诊断和治疗过程中发挥关键作用。核酸适配体是通过指数富集配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)筛选获得的、可与靶标特异性结合的单链脱氧核糖核酸或核糖核酸,具备稳定性高、可化学合成、高亲和力和特异性以及靶标范围广等独特优势。目前,靶向外泌体的适配体已应用于细胞成像、药物递送、疾病诊疗等众多研究领域。然而,外泌体的异质性以及复杂结构,为精准识别特定外泌体的适配体筛选带来巨大挑战,高效的筛选技术是获得优良性能适配体的关键。本文总结了外泌体适配体筛选过程中关键靶点的功能及其选择策略,概述了目前应用于外泌体适配体筛选的主要方法与应用,包括磁珠-SELEX、微流控-SELEX、硝酸纤维素膜-SELEX、细胞-SELEX和毛细管电泳-SELEX等5种筛选技术,并对其分离原理、优势与限制以及最新应用进行阐述与分析。最后,对外泌体适配体筛选所面临的问题与挑战进行了总结与展望。展开更多
人中性粒细胞FcγRI(即CD64),Ig G Fc高亲和力受体之一,是早期诊断脓毒血症和系统性细菌感染的一个灵敏和特异的新标志物;目前,采用流式细胞计量术测定,难以在一般实验室开展。本研究旨在应用新型的体外筛选技术——指数富集配基的系统...人中性粒细胞FcγRI(即CD64),Ig G Fc高亲和力受体之一,是早期诊断脓毒血症和系统性细菌感染的一个灵敏和特异的新标志物;目前,采用流式细胞计量术测定,难以在一般实验室开展。本研究旨在应用新型的体外筛选技术——指数富集配基的系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术——从体外合成的随机寡核苷酸文库中筛选人FcγRI的高亲和力和高特异性的核酸适配体(aptamer)。本文以人FcγRI为靶标,将其固定在羧基活化磁珠上,进行SELEX筛选。经过8轮筛选,共获得3个重点研究的单克隆适配体。生物信息学分析结果显示,人FcγRI适配体的模拟二级结构以茎-环和G-四聚体为主,可能是FcγRI与适配体的作用位点,G-T错配常见。流式细胞计量术和荧光显微镜分析显示,筛选出的典型单克隆适配体解离常数(the dissociation constant,Kd)均达到纳摩尔水平,而且适配体只与脓毒血症中性粒细胞结合,具有良好的亲和力和特异性。本研究表明,通过SELEX技术,成功获取了人FcγRI特异性核酸适配体,为以此适配体为分子探针,进一步建立用于脓毒血症早期诊断的新方法奠定了基础。展开更多
目前,对急性白血病细胞表面特异性分子标记物所知甚少,因而白血病的诊断尚缺乏白血病细胞的特异性方法。为此,本研究采用细胞-指数富集配体系统进化(cell-systematic evolution of ligands by exponentialenrichment,cSELEX)技术,筛选...目前,对急性白血病细胞表面特异性分子标记物所知甚少,因而白血病的诊断尚缺乏白血病细胞的特异性方法。为此,本研究采用细胞-指数富集配体系统进化(cell-systematic evolution of ligands by exponentialenrichment,cSELEX)技术,筛选与急性髓系白血病(acute myeloblastic leukemia,AML)M2型(AML-M2)患者CD33+/CD34+细胞结合的核酸适配体(aptamer),为寻找AML-M2白血病细胞表面特异性分子标记物提供基础。首先,通过免疫磁珠方法分选出AML-M2患者骨髓CD33+/CD34+细胞并将其作为靶细胞,正常人CD33+/CD34+细胞为反筛选细胞,采用cSELEX技术,从单链DNA(single strand deoxyribonucleic acid,ssDNA)文库中筛选与AML-M2CD33+/CD34+细胞结合的适配体。随后,通过克隆和测序分析各适配体的结构。结果显示,经过13轮次的反复筛选,ssDNA文库的适配体与AML-M2患者CD33+/CD34+细胞的富集度从0.7%增加到52.9%,至第13轮时趋于稳定。对所获得的30个适配体序列分析表明,大多数适配体含有CCCCT、CTCTC和CTCAC保守序列中的一种。二级结构分析显示,30个适配体中含有3种不同类型的模拟二级结构。结论 :本研究成功筛选到AML-M2型白血病CD33+/CD34+细胞的适配体,这为进一步寻找AML-M2白血病细胞表面特异性分子标记物以及AML-M2型白血病的分子诊断创造了基础。展开更多
肺癌是发病率和死亡率较高的恶性肿瘤。现阶段,用于肺癌早期诊断的血清肿瘤标志物因其特异性与敏感性均较低,严重影响肺癌的临床诊断和治疗。本文用双向热循环消减指数富集的配基进化(systematic evolution of ligands by exponential e...肺癌是发病率和死亡率较高的恶性肿瘤。现阶段,用于肺癌早期诊断的血清肿瘤标志物因其特异性与敏感性均较低,严重影响肺癌的临床诊断和治疗。本文用双向热循环消减指数富集的配基进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术,筛选肺癌和非癌血清标志物的核酸适配体,建立肺癌的检测方法,提高诊断和治疗效率。实验用环氧基琼脂磁珠为筛选介质,以非癌混合血清、肺癌混合血清作为双向靶标。应用热循环消减SELEX技术,经19轮筛选分别获得非癌和肺癌血清的特异性核酸适配体。通过高通量测序,得到40条非癌核酸适配体序列和41条肺癌核酸适配体序列。从肺癌与非癌血清特异性核酸适配体序列中分别挑选出高丰度的4条序列,合成后制成检测试剂,经临床血清验证,阳性率为90%。该检测方法检测灵敏度高,为肺癌的早期诊断和治疗提供了新的分子识别元件。展开更多
文摘外泌体密切参与细胞间通讯,调控细胞生理过程,是目前癌症和其他疾病早期诊断的潜在生物标志物之一。因此,具有特定功能的外泌体的检测与分离具有重要临床意义。与此同时,开发低成本、高灵敏度的外泌体特异性识别元件,将在疾病早期诊断和治疗过程中发挥关键作用。核酸适配体是通过指数富集配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)筛选获得的、可与靶标特异性结合的单链脱氧核糖核酸或核糖核酸,具备稳定性高、可化学合成、高亲和力和特异性以及靶标范围广等独特优势。目前,靶向外泌体的适配体已应用于细胞成像、药物递送、疾病诊疗等众多研究领域。然而,外泌体的异质性以及复杂结构,为精准识别特定外泌体的适配体筛选带来巨大挑战,高效的筛选技术是获得优良性能适配体的关键。本文总结了外泌体适配体筛选过程中关键靶点的功能及其选择策略,概述了目前应用于外泌体适配体筛选的主要方法与应用,包括磁珠-SELEX、微流控-SELEX、硝酸纤维素膜-SELEX、细胞-SELEX和毛细管电泳-SELEX等5种筛选技术,并对其分离原理、优势与限制以及最新应用进行阐述与分析。最后,对外泌体适配体筛选所面临的问题与挑战进行了总结与展望。
文摘人中性粒细胞FcγRI(即CD64),Ig G Fc高亲和力受体之一,是早期诊断脓毒血症和系统性细菌感染的一个灵敏和特异的新标志物;目前,采用流式细胞计量术测定,难以在一般实验室开展。本研究旨在应用新型的体外筛选技术——指数富集配基的系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术——从体外合成的随机寡核苷酸文库中筛选人FcγRI的高亲和力和高特异性的核酸适配体(aptamer)。本文以人FcγRI为靶标,将其固定在羧基活化磁珠上,进行SELEX筛选。经过8轮筛选,共获得3个重点研究的单克隆适配体。生物信息学分析结果显示,人FcγRI适配体的模拟二级结构以茎-环和G-四聚体为主,可能是FcγRI与适配体的作用位点,G-T错配常见。流式细胞计量术和荧光显微镜分析显示,筛选出的典型单克隆适配体解离常数(the dissociation constant,Kd)均达到纳摩尔水平,而且适配体只与脓毒血症中性粒细胞结合,具有良好的亲和力和特异性。本研究表明,通过SELEX技术,成功获取了人FcγRI特异性核酸适配体,为以此适配体为分子探针,进一步建立用于脓毒血症早期诊断的新方法奠定了基础。
文摘肺癌是发病率和死亡率较高的恶性肿瘤。现阶段,用于肺癌早期诊断的血清肿瘤标志物因其特异性与敏感性均较低,严重影响肺癌的临床诊断和治疗。本文用双向热循环消减指数富集的配基进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技术,筛选肺癌和非癌血清标志物的核酸适配体,建立肺癌的检测方法,提高诊断和治疗效率。实验用环氧基琼脂磁珠为筛选介质,以非癌混合血清、肺癌混合血清作为双向靶标。应用热循环消减SELEX技术,经19轮筛选分别获得非癌和肺癌血清的特异性核酸适配体。通过高通量测序,得到40条非癌核酸适配体序列和41条肺癌核酸适配体序列。从肺癌与非癌血清特异性核酸适配体序列中分别挑选出高丰度的4条序列,合成后制成检测试剂,经临床血清验证,阳性率为90%。该检测方法检测灵敏度高,为肺癌的早期诊断和治疗提供了新的分子识别元件。
