骨性关节炎的联合基因治疗研究 被引量：13

1

作者 张晓玲 于长隆 +2 位作者 毛泽斌 傅欣 张继英 《中国运动医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期5-8,i0001-i0002,共6页

目的:探讨白细胞介素1受体拮抗蛋白(IL-1Ra)及白细胞介素10双基因转染在关节中的表达及在骨性关节炎(OA)治疗中的作用。方法:构建PLXRN-IL-1Ra、PLXRN-IL-10逆转录病毒载体,体外转染同种异体原代滑膜细胞,将转染了外源基因的滑膜细胞注... 目的:探讨白细胞介素1受体拮抗蛋白(IL-1Ra)及白细胞介素10双基因转染在关节中的表达及在骨性关节炎(OA)治疗中的作用。方法:构建PLXRN-IL-1Ra、PLXRN-IL-10逆转录病毒载体,体外转染同种异体原代滑膜细胞,将转染了外源基因的滑膜细胞注射入兔骨性关节炎膝关节腔。外源基因注射后第7天,用PBS灌洗兔膝关节,ELISA分析转基因表达;外源基因注射后第14天处死动物,ELISA及免疫组化分析转基因表达,软骨滑膜常规石蜡切片观察病理改变,并进行软骨组织学评分。结果:外源基因转移后14天表达尚很稳定,治疗基因在受体关节的滑膜衬里部位表达。只接受人IL-1Ra基因治疗的兔膝关节软骨损坏明显减轻;单纯人IL-10基因治疗膝关节也有一定效果;两种基因同时导入时,有非常明显的抑制软骨破坏和软骨基质降解的作用。结论:以逆转录病毒为载体将IL-1Ra、IL-10同时转移入早期骨关节炎关节内,有稳定的外源基因表达,且联合基因治疗效果明显优于单独转移入其中任何一种基因,提示靶向于多种炎性因素的治疗更为有效。 展开更多

关键词 基因转染 骨性关节炎 IL-1RA IL-10 联合基因治疗

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人NKG2D的基因克隆及其在CHO细胞中的表达 被引量：4

2

作者 许晓群 陈雪梅 +4 位作者 张彩 游力 赵昌盛 王郡甫 张建华 《细胞与分子免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期447-449,共3页

目的:构建重组人NKG2D真核表达载体并在CHO细胞表达重组人NKG2D。方法:用RT-PCR方法从NK-92细胞中调取NKG2D基因片段,克隆到pGEM-TEasy载体并对克隆的DNA片段进行序列分析。用限制内切酶EcoRI和BamHI消化pGEM-TEasy/NKG2D重组质粒,分离N... 目的:构建重组人NKG2D真核表达载体并在CHO细胞表达重组人NKG2D。方法:用RT-PCR方法从NK-92细胞中调取NKG2D基因片段,克隆到pGEM-TEasy载体并对克隆的DNA片段进行序列分析。用限制内切酶EcoRI和BamHI消化pGEM-TEasy/NKG2D重组质粒,分离NKG2D片段,并插入真核表达质粒pEGFP-N1的相应限制酶位点,酶谱分析鉴定重组表达载体pEGFP-N1/NKG2D。然后经脂质体介导转染CHO细胞。应用荧光显微镜观测、Westernblot方法和免疫组化染色对转染细胞内pEGFP-N1/NKG2D的表达进行鉴定。结果:RT-PCR扩增获得650bp基因片段,经DNA序列分析证明所获得的DNA序列与文献报道的NKG2D序列一致。转染的CHO细胞在荧光显微镜下发出强绿色荧光,Westernblot分析显示重组蛋白能特异地与抗人NKG2D单克隆抗体结合;免疫组化检测显示,转染的CHO中有棕色颗粒,证明所构建的NKG2D真核表达载体可以在细胞中表达。结论:构建了人NKG2D的哺乳动物细胞表达载体,并成功地在CHO细胞中获得重组人NKG2D的表达。 展开更多

关键词 NKG2D受体 基因转染 基因表达 CHO细胞

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山奈酚调节细胞色素P450 3A4转录表达的研究 被引量：12

3

作者 刘冬英 祝慧娟 +1 位作者 郑一凡 朱心强 《浙江大学学报（医学版）》 CAS CSCD 2006年第1期14-17,共4页

目的:观察山奈酚能否通过活化孕烷X受体(PXR)诱导细胞色素P 450 3A 4(CYP 3A 4)的转录表达。方法:在人肝肿瘤细胞株H epG2细胞中,用瞬时共转染报告基因试验检测山奈酚对PXR介导的CYP 3A 4的转录调节作用。结果:山奈酚能通过活化PXR诱导C... 目的:观察山奈酚能否通过活化孕烷X受体(PXR)诱导细胞色素P 450 3A 4(CYP 3A 4)的转录表达。方法:在人肝肿瘤细胞株H epG2细胞中,用瞬时共转染报告基因试验检测山奈酚对PXR介导的CYP 3A 4的转录调节作用。结果:山奈酚能通过活化PXR诱导CYP 3A 4的转录表达,其诱导能力随山奈酚的浓度增大和处理时间延长而呈增强趋势。山奈酚在浓度为0.001、0.01、0.1、1.0和10.0μm o l/L下,其诱导倍数分别为0.1%二甲基亚砜(DM SO)处理组的(1.31±0.27)倍、(1.45±0.36)倍、(1.96±0.50)倍、(2.90±1.07)倍和(7.93±0.75)倍(P均<0.05)。1.0和10.0μm o l/L的山奈酚在48 h内其诱导作用随诱导时间的增加而增强,处理48 h后其诱导能力分别为0.1%DM SO处理组的(3.73±1.21)倍和(8.42±1.47)倍。结论:山奈酚能通过活化PXR诱导CYP 3A 4的转录表达。 展开更多

关键词 细胞色素P450 山奈酚 肝肿瘤 肿瘤细胞 培养的 转染 基因 受体 孕烷

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TCRVβ7.1基因修饰T细胞对乳腺癌细胞杀伤作用的研究 被引量：4

4

作者 胡丽彩 邱曙东 +3 位作者 黄树林 刘璋 林月霞 罗利琼 《中国免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第2期97-99,103,共4页

目的:观察TCRVβ-1基因转染前后正常人外周血淋巴细胞对乳腺癌细胞株杀伤活性的影响。方法:脂质体包裹pcDNA3.1Vβ7.1后转染健康人PBMC,流式细胞仪检测pcDNA3.1Vβ7.1基因表达,改良MTT法检测TCRVβ-1基因转染前后正常人外周血淋巴细胞... 目的:观察TCRVβ-1基因转染前后正常人外周血淋巴细胞对乳腺癌细胞株杀伤活性的影响。方法:脂质体包裹pcDNA3.1Vβ7.1后转染健康人PBMC,流式细胞仪检测pcDNA3.1Vβ7.1基因表达,改良MTT法检测TCRVβ-1基因转染前后正常人外周血淋巴细胞对乳腺癌细胞株杀伤活性。结果:TCRVβ-1基因转染可显著增加正常人PBMC该基因表达,转染前后正常人外周血淋巴细胞对乳腺癌细胞株杀伤活性有显著性差异。结论:用TCR基因修饰可明显提高正常人PBMC对乳腺癌细胞杀伤作用。 展开更多

关键词 乳腺癌 TCRVβ7.1基因 外周血淋巴细胞 流式细胞仪 基因表达 基因修饰 基因转染

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猪CB1基因的生物信息学分析 被引量：5

5

作者 魏星灿 贾青 +1 位作者 陶隽 胡慧艳 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2013年第12期129-132,共4页

运用生物信息学方法分析了猪和其他21个物种CB1基因CDs序列的系统进化关系和猪CB1基因编码蛋白质的理化性质与结构。结果显示,CB1基因同源性较高,且在进化中受到纯化选择的作用。猪CB1蛋白为疏水性跨膜蛋白,包含472个氨基酸残基,不含信... 运用生物信息学方法分析了猪和其他21个物种CB1基因CDs序列的系统进化关系和猪CB1基因编码蛋白质的理化性质与结构。结果显示,CB1基因同源性较高,且在进化中受到纯化选择的作用。猪CB1蛋白为疏水性跨膜蛋白,包含472个氨基酸残基,不含信号肽。其一级结构含有23个磷酸化位点、6个糖基化位点;二级结构含有47.67%的α螺旋、39.62%的无规则卷曲、12.71%的延长链;三级结构由7个α螺旋和无规则卷曲组成。研究结果表明,CB1基因可能是哺乳动物的看家基因,7条相连的α螺旋结构是猪CB1的活性位点。 展开更多

关键词 猪 大麻素1型受体基因 生物信息学

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稳定表达GlyRα1的HEK293细胞系的建立 被引量：5

6

作者 蒋玲琳 刘丽 +3 位作者 朱含章 杨青 范乐明 陈琪 《南京医科大学学报（自然科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第7期647-650,共4页

目的:建立稳定表达甘氨酸受体α1亚基(GlyRα1)真核表达载体的人胚肾细胞(HEK293)细胞系。方法:构建pcDNA3.1-GlyRα1真核表达载体,应用脂质体介导的转染技术将该质粒导入HEK293细胞,再用G418筛选表达稳定的细胞系。真核细胞中GlyRα1... 目的:建立稳定表达甘氨酸受体α1亚基(GlyRα1)真核表达载体的人胚肾细胞(HEK293)细胞系。方法:构建pcDNA3.1-GlyRα1真核表达载体,应用脂质体介导的转染技术将该质粒导入HEK293细胞,再用G418筛选表达稳定的细胞系。真核细胞中GlyRα1的表达分别用RT-PCR与Western blot方法检测。结果:在7株转染并经G418反复筛选的HEK293细胞系中,有4株细胞系明显表达GlyRα1的mRNA及其蛋白质,其余3株细胞表达较弱或者没有表达。结论:用pcDNA3.1-GlyRα1转染的HEK293细胞经G418筛选,可成功建立GlyRα1稳定表达系。 展开更多

关键词 甘氨酸受体 基因转染 HEK293细胞 稳定表达

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RARΒ基因转染对胃癌细胞株MKN-45凋亡和存活素及半胱氨酸酶的影响 被引量：8

7

作者 范钰 郑树 赵刚 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第12期2396-2400,共5页

目的:研究RARΒ受体基因转染后,全反式维甲酸(ATRA)对低维甲酸反应性胃癌细胞系MKN-45 细胞凋亡的影响和可能机制。方法:脂质体介导真核表达载体PCMV-SCRIPT-RARΒ转染MKN一45细胞株,筛选得到阳性克隆,WESTERN BLOTTING鉴定转染成功后给... 目的:研究RARΒ受体基因转染后,全反式维甲酸(ATRA)对低维甲酸反应性胃癌细胞系MKN-45 细胞凋亡的影响和可能机制。方法:脂质体介导真核表达载体PCMV-SCRIPT-RARΒ转染MKN一45细胞株,筛选得到阳性克隆,WESTERN BLOTTING鉴定转染成功后给予RARΒ受体相应配体ATRA,MTT法测定细胞增殖水平,分别采用 NORTHERN BLOTTING、WESTERN BLOTTING检测存活素(SURVIVIN)MRNA和蛋白水平,用酶标仪比色法检测半胱氨酸酶(CASPASE)活性,采用TUNEL法检测细胞凋亡。结果:ATRA可使RARΒ受体高表达的MKN-45细胞株增殖减慢,能下调SURVIVIN MRNA和蛋白水平,增强CASPASE酶活性,并诱导胃癌细胞凋亡,效果呈浓度和作用时间依赖性。结论:RARΒ受体转染并结合使用相应配体ATRA可诱导MKN-45胃癌细胞凋亡,可能与下调SURVIVIN表达与增强CASPASE酶活性有关。 展开更多

关键词 基因转染 受体 维甲酸 细胞凋亡 存活素 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 胃肿瘤

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RIP2对大肠杆菌的抗菌作用研究 被引量：5

8

作者 席琼 胡巢凤 +2 位作者 张芸 陆大祥 蒋宇 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2011年第5期951-955,共5页

目的:探讨受体相互作用蛋白2(RIP2)对人肠细胞清除大肠杆菌的作用。方法:使用阳离子聚合物JetPeiTM介导人RIP2基因(pEGFP-C2-PIP2)转染人结肠癌SW480细胞株,以转染空质粒及未转染的SW480细胞株作为对照,应用RT-PCR检测外源性RIP2 mRNA... 目的:探讨受体相互作用蛋白2(RIP2)对人肠细胞清除大肠杆菌的作用。方法:使用阳离子聚合物JetPeiTM介导人RIP2基因(pEGFP-C2-PIP2)转染人结肠癌SW480细胞株,以转染空质粒及未转染的SW480细胞株作为对照,应用RT-PCR检测外源性RIP2 mRNA水平的变化、Western blotting法检测细胞RIP2蛋白的表达;并利用大肠杆菌ATCC25922感染转染和未转染的SW480细胞24 h,用平板培养菌落计数活菌数。应用p38MAPK通路抑制剂SB203580作用于3组细胞,计数活菌数。结果:与对照组相比,转染RIP2组其mRNA和蛋白表达水平均有明显升高(P<0.01,P<0.05),表明RIP2表达质粒成功转染SW480细胞。转染RIP2细胞能清除胞内大肠杆菌;而阻断p38 MAPK信号通路后,RIP2清除胞内大肠杆菌的作用被阻断。结论:RIP2转染细胞可有效清除胞内大肠杆菌,这种胞内细菌的清除作用可能与p38 MAPK信号通路有关。这些结果提示RIP2在细菌感染性疾病治疗中具有广阔的临床应用前景。 展开更多

关键词 受体相互作用蛋白2 基因转染 抗菌作用

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人白细胞介素1受体拮抗剂基因转染人胚颞颌关节软骨细胞的实验研究 被引量：2

9

作者 李逸松 田卫东 +2 位作者 王栋 李声伟 陈希哲 《华西口腔医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2003年第1期19-21,共3页

目的　研究人白细胞介素 1受体拮抗剂 (hIL_1ra)基因转染人胚颞颌关节软骨细胞的方法和表达。方法　分离培养人胚颞颌关节软骨细胞 ,将hIL_1ra基因以阳离子脂质体Lipefectine介导进行基因转染 ,免疫细胞化学染色和ELISA法检测转染细胞中... 目的　研究人白细胞介素 1受体拮抗剂 (hIL_1ra)基因转染人胚颞颌关节软骨细胞的方法和表达。方法　分离培养人胚颞颌关节软骨细胞 ,将hIL_1ra基因以阳离子脂质体Lipefectine介导进行基因转染 ,免疫细胞化学染色和ELISA法检测转染细胞中hIL_1ra蛋白的表达。结果　使用阳离子脂质体介导hIL_1ra基因转染人胚颞颌关节软骨细胞 ,免疫细胞化学染色hIL_1ra蛋白呈阳性表达 ,瞬时转染和稳定转染时 ,转染细胞胞浆内和培养基上清液中均有目的基因的表达 ,与未经转染的对照组存在显著性差异 (P <0 0 1)。结论　体外实验证实脂质体介导hIL_1ra基因转染方法切实可行 ,为今后颞颌关节骨关节病的基因治疗提供了依据。 展开更多

关键词 人白细胞介素1 受体拮抗剂 基因转染 颞颌关节 软骨细胞 实验研究 基因转染

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雌激素受体α真核表达载体的构建及在大鼠骨髓基质干细胞中的表达 被引量：3

10

作者 祝强 王婧 +3 位作者 董隽 史立新 张旭 洪宝发 《医学研究生学报》 CAS 北大核心 2014年第1期34-37,共4页

目的雌激素在很多靶器官中发挥重要生物调节作用,主要通过雌激素受体(estrogen receptor,ER)来介导。构建ERα真核表达载体并于大鼠骨髓基质干细胞(rat marrow mesenchymal stem cells,rBMSCs)中表达,为后续研究ERα的功能奠定良好的基... 目的雌激素在很多靶器官中发挥重要生物调节作用,主要通过雌激素受体(estrogen receptor,ER)来介导。构建ERα真核表达载体并于大鼠骨髓基质干细胞(rat marrow mesenchymal stem cells,rBMSCs)中表达,为后续研究ERα的功能奠定良好的基础。方法采用RT-PCR技术从SD大鼠子宫及双侧附件中提取并扩增ERα,酶切后,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+);重组载体经PCR、酶切、测序鉴定正确后瞬时转染rBMSCs,采用RT-PCR和Western blotting分析ERα在细胞中的表达,并采用Realtime-PCR和MTT的方法比较ERα高表达后对细胞生长周期的影响。结果成功构建了重组质粒pcDNA-ERα,RT-PCR和Western blotting显示该质粒能在rBMSCs中高效表达,Realtime-PCR和MTT比较分析表明,ERα的高表达对细胞的生长产生一定的抑制作用。结论成功构建ERα真核表达载体,该载体在rBMSCs中成功转录与表达,外源性ERα基因转染能使rBMSCs的增殖受抑,可能与ERα的核内高表达相关。 展开更多

关键词 雌激素受体理 基因表达 大鼠骨髓基质干细胞 转染 鉴定

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重组人IL1-Ra与TGF-β1共转染软骨细胞的基因表达 被引量：3

11

作者 张平 蔡道章 +5 位作者 刘斌 温机智 曾春 侯雪瑞 张富程 陆慧婷 《中国临床解剖学杂志》 CSCD 北大核心 2008年第2期179-181,共3页

目的:探讨重组人IL1-Ra与TGF-β1基因转染软骨细胞的表达情况。方法:体外分离培养兔关节软骨细胞,然后用构建的IL1-Ra与TGF-β1质粒通过脂质体介导下共转染软骨细胞,通过荧光显微镜观察转基因的表达和荧光定量PCR检测其表达。结果:荧光... 目的:探讨重组人IL1-Ra与TGF-β1基因转染软骨细胞的表达情况。方法:体外分离培养兔关节软骨细胞,然后用构建的IL1-Ra与TGF-β1质粒通过脂质体介导下共转染软骨细胞,通过荧光显微镜观察转基因的表达和荧光定量PCR检测其表达。结果:荧光显微镜观察有绿色荧光蛋白表达,荧光定量PCR鉴定证实转染的软骨细胞中转基因得到表达。结论:IL1-Ra与TGF-β1基因共转染软骨细胞可以获得表达,为基因治疗骨关节炎的研究提供基础。 展开更多

关键词 IL-1RA 转化生长因子-Β1 基因转染 软骨细胞

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人白细胞介素-1受体拮抗剂基因转染人颞颌关节软骨细胞的基因表达 被引量：2

12

作者 李逸松 田卫东 +2 位作者 李声伟 刘流 代晓明 《华西口腔医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第4期300-302,共3页

目的研究人白细胞介素-1受体拮抗剂(hIL-1ra)基因转染人颞颌关节软骨细胞的基因表达情况。方法hIL-1ra基因以阳离子脂质体介导转染体外培养的人颞颌关节软骨细胞,描记细胞生长曲线,计算细胞群体倍增时间,并采用酶联免疫吸附法检测瞬时... 目的研究人白细胞介素-1受体拮抗剂(hIL-1ra)基因转染人颞颌关节软骨细胞的基因表达情况。方法hIL-1ra基因以阳离子脂质体介导转染体外培养的人颞颌关节软骨细胞,描记细胞生长曲线,计算细胞群体倍增时间,并采用酶联免疫吸附法检测瞬时转染和稳定转染细胞中hIL-1ra蛋白的表达。结果转染细胞与正常细胞的增殖率有一定差异,转染细胞胞浆内和培养基上清液中均有hIL-1ra蛋白的表达。在细胞转染结束后48h,细胞内hIL-1ra蛋白的表达量最高,稳定转染细胞中基因表达最长时间达72d以上。结论经阳离子脂质体介导hIL-1ra基因转染人颞颌关节软骨细胞后,目的基因在细胞内有一定数量的表达。 展开更多

关键词 人白细胞介素-1受体拮抗剂 基因转染 阳离子脂质体

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NRAGE影响人食管癌细胞放射抗性的作用及其机制研究 被引量：4

13

作者 杨玉 周欢娣 +4 位作者 薛晓英 张歌 韩雪涛 田哲森 李月红 《中国癌症杂志》 CAS CSCD 北大核心 2020年第1期41-48,共8页

背景与目的:食管癌是全球威胁人类生命和健康的常见恶性肿瘤之一,中国每年食管癌发病人数占全球发病总人数的一半以上,以食管鳞癌最为常见。放疗是食管癌三大治疗手段之一,而放射抗性是导致其治疗失败的主要原因。神经营养因子受体相互... 背景与目的:食管癌是全球威胁人类生命和健康的常见恶性肿瘤之一,中国每年食管癌发病人数占全球发病总人数的一半以上,以食管鳞癌最为常见。放疗是食管癌三大治疗手段之一,而放射抗性是导致其治疗失败的主要原因。神经营养因子受体相互作用MAGE类药物(neurotrophin receptor-interacting MAGE homolog,NRAGE)在放射抗性细胞株TE13R120中表达量明显高于亲本TE13细胞,且NRAGE亚细胞定位变化可能参与食管癌细胞放射抗性的形成。通过基因转染构建NRAGE稳定表达的食管癌细胞系,以进一步明确NRAGE基因与食管鳞癌细胞放射抗性的关系,分析该基因影响放射抗性的具体机制。方法:通过基因转染构建NRAGE稳定表达的食管癌细胞系。采用细胞克隆形成实验检测细胞放射敏感性,采用流式细胞术检测细胞周期及凋亡;细胞划痕、Transwell侵袭实验检测细胞迁移、侵袭能力,采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitive polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞中β-catenin表达情况。组间差异采用t检验或方差分析。结果:实验分为转染过表达组(Eca109/NRAGE组)和空白对照组(Eca109组)。Eca109/NRAGE细胞中NRAGE的表达量明显高于Eca109(t=29.65,P<0.05)。照射后Eca109/NRAGE细胞的放射抗性显著高于Eca109。流式细胞术检测结果显示,Eca109/NRAGE细胞中对射线抵抗性最强的S期细胞比例增加,对射线最敏感的G2/M期减少。Eca109/NRAGE细胞凋亡率较Eca109细胞降低(t=3.268,P<0.05)。Eca109/NRAGE细胞迁移和侵袭能力均高于Eca109。RTFQ-PCR和Western blot检测结果显示,β-catenin的mRNA表达及蛋白水平在Eca109/NRAGE细胞中明显高于Eca109(t=15.87,P<0.05)。结论:NRAGE参与Eca109细胞放射抗性的形成,改变细胞的细胞周期分布和凋亡情况,影响细胞迁移及侵袭能力并可能影响食管癌细胞的放射敏感性,该作用可能与激活Wnt/β-catenin信号转导通路有关。 展开更多

关键词 神经营养因子受体基因 稳定转染 食管鳞状细胞癌 放射抗性

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甲状旁腺素受体真核表达载体的构建及稳定转染HEK293细胞系的建立 被引量：2

14

作者 孟越 谢苗苗 +4 位作者 林振 袁亮 李威 郝松 杨德鸿 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第7期956-961,共6页

目的构建小鼠甲状旁腺素受体(PTHR)及其突变受体(DSEL)全长结构基因真核表达载体,建立稳定高表达PTHR及DSEL的HEK293细胞系,以应用于甲状旁腺素(PTH)模拟肽活性药物筛选及其信号通路的研究。方法通过双酶切、胶回收方法分别纯化目的片段... 目的构建小鼠甲状旁腺素受体(PTHR)及其突变受体(DSEL)全长结构基因真核表达载体,建立稳定高表达PTHR及DSEL的HEK293细胞系,以应用于甲状旁腺素(PTH)模拟肽活性药物筛选及其信号通路的研究。方法通过双酶切、胶回收方法分别纯化目的片段(PTHR、DSEL基因)和质粒pcDNA3.1(+),二者分别由DNA限制性内切酶EcoRⅠ与NotⅠ双酶切,经T4DNA Ligase连接的方法将PTHR、DSEL基因克隆到质粒表达载体pcDNA3.1(+)中,采用测序方法及DNA限制性内切酶EcoRⅠ与NotⅠ双酶切方法鉴定重组质粒,脂质体转染法将重组体pcDNA3.1(+)-PTHR、pcDNA3.1(+)-DSEL及空质粒pcDNA3.1(+)分别转染至HEK293细胞,经G418筛选抗性细胞克隆,、RT-PCR及ELISA检测转染细胞PTHR、DSEL的表达情况。结果重组质粒经基因测序及DNA限制性内切酶EcoRⅠ与NotⅠ双酶切证实质粒表达载体pcDNA3.1(+)-PTHR、pcDNA3.1(+)-DSEL构建正确。重组体经脂质体法转染HEK293 48 h后,经G418筛选3周得到细胞抗性克隆,ELISA检测到PTHR、DSEL基因在重组质粒表达载体pcDNA3.1(+)-PTHR、pcDNA3.1(+)-DSEL转染的HEK293中成功表达。RT-PCR方法检测到PTHR、DSEL基因在转录水平的表达。ELISA方法检测到重组质粒转染的HEK293中,加入甲状旁腺激素刺激后,PLC、cAMP蛋白表达量远高于空质粒pcDNA3.1(+)转染的HEK293中PLC、cAMP的表达。结论成功构建了稳定高表达PTHR、DSEL的HEK293细胞,该稳定转染细胞系的建立为进一步研究甲状旁腺素受体下游信号通道的分子机制以及筛选其模拟肽作用的活性奠定了实验基础。 展开更多

关键词 小鼠PTHR 真核表达 全长结构基因 稳定转染

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GRβ对肾小球系膜细胞糖皮质激素效应的影响(英文) 被引量：1

15

作者 张磊 何庆南 +5 位作者 朱敏 周钢 丁娟娟 周频 吴小川 易著文 《中南大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2007年第6期941-948,共8页

目的:构建糖皮质激素受体β(GRβ)不同表达水平的肾小球系膜细胞株,研究GRβ对肾小球系膜细胞糖皮质激素效应的影响。方法:利用逆转录病毒载体pLXSN将重组GRβ正义和反义基因转入肾小球系膜细胞,经细胞培养、逆转录聚合酶链反应、基因... 目的:构建糖皮质激素受体β(GRβ)不同表达水平的肾小球系膜细胞株,研究GRβ对肾小球系膜细胞糖皮质激素效应的影响。方法:利用逆转录病毒载体pLXSN将重组GRβ正义和反义基因转入肾小球系膜细胞,经细胞培养、逆转录聚合酶链反应、基因测序和蛋白质印迹分析鉴定所构建的细胞株,应用MTT法和流式细胞术检测细胞内不同表达水平的GRβ对地塞米松的细胞增殖抑制效应和细胞周期变化的影响。结果:构建的肾小球系膜细胞分别有正确的GRβ正义和反义基因整合,转染了GRβ正义基因的肾小球系膜细胞内GRβ蛋白质表达水平明显高于转染了GRβ反义基因者(109.74±10.63vs.19.08±1.01,P<0.05);地塞米松对GRβ高表达的肾小球系膜细胞的增殖抑制效率显著低于GRβ低表达的肾小球系膜细胞(18.47%±2.12%vs.60.33%±5.29%,P<0.05)。在地塞米松的抑制下,转染了正义GRβ基因的细胞中,其S期细胞降低程度和G1期细胞升高的程度均明显低于未转染的细胞。结论:肾小球系膜细胞内高表达的GRβ具有拮抗糖皮质激素效应的作用,细胞内GRβ表达水平是决定细胞对激素敏感或抵抗的重要因素。 展开更多

关键词 糖皮质激素受体Β 糖皮质激素 基因转染 肾小球系膜细胞

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白介素1受体拮抗剂基因转染髁突软骨细胞的作用 被引量：1

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作者 李逸松 田卫东 +2 位作者 陈希哲 刘流 李声伟 《实用口腔医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期763-766,共4页

目的:研究经人白介素1受体拮抗剂(hIL-1ra)基因转染后的人颞颌关节髁突软骨细胞对IL-1作用的影响。方法:将hIL-1ra基因以阳离子脂质体介导转染体外培养的人颞颌关节髁突软骨细胞,在转染细胞和对照组细胞培养基中加入IL-1β,描记细胞生... 目的:研究经人白介素1受体拮抗剂(hIL-1ra)基因转染后的人颞颌关节髁突软骨细胞对IL-1作用的影响。方法:将hIL-1ra基因以阳离子脂质体介导转染体外培养的人颞颌关节髁突软骨细胞,在转染细胞和对照组细胞培养基中加入IL-1β,描记细胞生长曲线,计算细胞群体倍增时间,MTT法检测细胞增殖情况的变化,硝酸还原酶法测定培养液中NO2-/NO3-浓度的变化。结果:转染细胞与对照组细胞增殖情况存在差异,转染细胞高于对照组,硝酸还原酶法测定细胞培养液中NO2-/NO3-浓度,细胞培养液中NO的生成显著低于对照组(P<0.01)。结论:转染细胞hIL-1ra基因的表达对于IL-1作用存在拮抗和抑制作用。 展开更多

关键词 髁突 软骨细胞 白细胞介素1受体拮抗剂 基因转染

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特异性针对大鼠甲状旁腺激素受体1基因SiRNA表达载体的构建、鉴定及对高糖状态下INS-1细胞周期的影响 被引量：3

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作者 梁华晟 薛耀明 钟宇华 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2010年第9期2093-2096,共4页

目的构建并筛选携带针对大鼠甲状旁腺激素受体1基因(PTH1R)的pSUPERretro-GFP/Neo干扰逆转录病毒载体以及鉴定及观测高糖下对INS-1细胞周期的影响。方法根据Genbank筛选PTH1R三个阳性克隆及一个阴性克隆序列,定向克隆入逆转录病毒载体pS... 目的构建并筛选携带针对大鼠甲状旁腺激素受体1基因(PTH1R)的pSUPERretro-GFP/Neo干扰逆转录病毒载体以及鉴定及观测高糖下对INS-1细胞周期的影响。方法根据Genbank筛选PTH1R三个阳性克隆及一个阴性克隆序列,定向克隆入逆转录病毒载体pSUPERretro-GFP/Neo,并用RT-PCR和测序鉴定,将其转染至INS-1细胞中,Westernblotting观察PTH1R表达,鉴定其转染效率,筛选出最佳抑制基因后,应用流式细胞仪检测25mmol/LD-葡萄糖处理INS-1细胞周期。结果菌落RT-PCR及基因测序鉴定结果表明序列正确。并能成功转染到INS-1细胞株中,Westernblot筛选最佳抑制基因。细胞周期检测提示PTH1R沉默后抑制INS-1细胞从G0/G1期进入S期。结论成功构建并筛选出特异性沉默大鼠甲状旁腺激素受体1基因的pSUPERretro-GFP/Neo干扰逆转录病毒载体,高糖状态下PTH1R表达可能为INS-1细胞自我保护的一种作用。 展开更多

关键词 甲状旁腺激素受体1基因 小干扰RNA 小发卡结构RNA 转染 RNA干扰 细胞周期

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hERβ全长基因真核表达载体pEGFP-C1-hERβ的构建及其在PC-3M细胞中的表达 被引量：1

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作者 李峰 邵月婷 +6 位作者 何静春 秦宣锋 陈超 王驭良 孙连坤 李扬 赵雪俭 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期189-193,共5页

目的:构建人雌激素受体β(hERβ)全长基因的真核表达载体pEGFP-C1-hERβ,并转染激素非依赖性前列腺癌细胞株PC-3M。方法:采用RT-PCR法从卵巢囊肿患者切除的部分正常卵巢组织中钓取hERβ全长基因(1 593 bp),与pMD18-T载体连接做全自动序... 目的:构建人雌激素受体β(hERβ)全长基因的真核表达载体pEGFP-C1-hERβ,并转染激素非依赖性前列腺癌细胞株PC-3M。方法:采用RT-PCR法从卵巢囊肿患者切除的部分正常卵巢组织中钓取hERβ全长基因(1 593 bp),与pMD18-T载体连接做全自动序列测定。将测序正确的克隆质粒pMD18-T-hERβ和表达载体pEGFP-C1分别用HindⅢ和BamHⅠ进行双酶切,应用基因重组技术构建hERβ全长基因真核表达载体pEGFP-C1-hERβ。质粒经HindⅢ和BamHⅠ双酶切和PCR电泳鉴定后,采用脂质体转染法转染PC-3M细胞。结果:重组质粒经限制性酶切鉴定得到与hERβ全长基因长度一致(1 612 bp)的酶切产物;测序分析证实,PCR产物与GenBank上登录的hERβ基因(NM_001437)序列完全一致,表明成功地完成了hERβ的扩增和表达载体的构建;荧光显微镜下可见转染的PC-3M细胞有绿色荧光蛋白的表达;PCR测定分析,转染细胞hERβ的表达增加。结论:构建完成真核表达载体pEGFP-C1-hER,βhERβ基因在PC-3M细胞内成功表达。 展开更多

关键词 受体 雌激素 激素非依赖性前列腺癌细胞 前列腺肿瘤 真核表达 遗传载体 转染

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用转染m2胆碱受体基因的CHO细胞观察知母皂甙元的作用 被引量：3

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作者 施菊 胡雅儿 +1 位作者 易宁育 夏宗勤 《上海第二医科大学学报》 CSCD 2000年第6期503-505,共3页

目的观察知母甾体皂甙元 (sarsasapogenin ,SAR)对M2 受体亚型的调节作用。　方法采用转染了m2胆碱受体基因的CHO细胞为模型 ,以非选择性的3H -QNB作单点放射配基结合分析。　结果CHOm2细胞受体密度在培养 48h达顶峰 ,以后呈进行性下降... 目的观察知母甾体皂甙元 (sarsasapogenin ,SAR)对M2 受体亚型的调节作用。　方法采用转染了m2胆碱受体基因的CHO细胞为模型 ,以非选择性的3H -QNB作单点放射配基结合分析。　结果CHOm2细胞受体密度在培养 48h达顶峰 ,以后呈进行性下降。SAR对下降的CHOm2细胞M2 受体密度有明显的上调作用 ,这一作用有一定浓度依赖性。　结论SAR对下降的M2 受体密度具有上调作用。 展开更多

关键词 M2受体亚型 CHOm2细胞 知母皂甙元 放射配基分析

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非诺贝特与过氧化体增殖物激活型受体α对人肝瘤细胞1型纤溶酶原激活物抑制剂表达的影响 被引量：1

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作者 陈静 叶平 +5 位作者 刘永学 袁广胜 杨维 韩春光 吴芳明 贺艳丽 《中华老年心脑血管病杂志》 CAS 北大核心 2006年第3期194-197,共4页

目的探讨非诺贝特对人肝瘤细胞株(HepG2)细胞1型纤维酶原激活物抑制剂(PAI-1)表达的影响及机制。方法用不同浓度非诺贝特刺激HepG2细胞,采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测PAI-1mRNA水平,发色底物法检测PAI-1的活性变化。构建... 目的探讨非诺贝特对人肝瘤细胞株(HepG2)细胞1型纤维酶原激活物抑制剂(PAI-1)表达的影响及机制。方法用不同浓度非诺贝特刺激HepG2细胞,采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测PAI-1mRNA水平,发色底物法检测PAI-1的活性变化。构建4个荧光素酶报告基因质粒,分别由PAI-1启动子序列从-804至+17间不同长度片段驱动,体外转染HepG2细胞,检测荧光素酶的活性。结果非诺贝特能使HepG2细胞PAI-1mRNA表达及蛋白活性显著降低,且呈一定剂量依赖性;还可使PAI-1转录活性显著降低;当转染质粒含有PAI-1启动子序列-636^+17、-449^+17-、276^+17 bp 3个片段时,荧光素酶活性显著增高;共转染过氧化体增殖物激活型受体α(PPARα)表达质粒(PPAR-αpSG5)的细胞在非诺贝特诱导下PAI-1转录活性显著降低。结论非诺贝特可以抑制HepG2细胞PAI-1mRNA表达及其活性,调节PAI-1的基因转录,PPARα参与非诺贝特对PAI-1基因的表达调控。 展开更多

关键词 普鲁脂芬 纤溶酶原激活物抑制物1 过氧化物酶体增殖物激活型受体 基因表达 转染

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