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N末端Strep蛋白标签表达载体的构建和应用 被引量：2
1
作者 石禹 吉宏张 包小峰 《中国药理学通报》 CAS CSCD 北大核心 2016年第1期98-102,共5页
目的构建携带N末端Strep(NS)蛋白标签的表达载体;在表达载体中构建衣原体RNA聚合酶亚基重组蛋白并表达。方法采用PCR的方法,通过引物引入NS蛋白标签和新的多克隆位点替代p ET21c-DH质粒中原有的T7蛋白标签和多克隆位点,选择新引入的Not ... 目的构建携带N末端Strep(NS)蛋白标签的表达载体;在表达载体中构建衣原体RNA聚合酶亚基重组蛋白并表达。方法采用PCR的方法,通过引物引入NS蛋白标签和新的多克隆位点替代p ET21c-DH质粒中原有的T7蛋白标签和多克隆位点,选择新引入的Not I酶切位点进行PCR产物的环化自连,转化DH-5α细菌后筛选阳性菌株,PCR法和基因测序法鉴定新构建的表达载体;在新构建表达载体的Bam H I和Sal I位点之间分别插入衣原体RNA聚合酶核心酶的α、β、β'亚基,获得表达NS-α、NS-β、NS-β'融合蛋白的表达载体,转化表达菌株Arctic Express,筛选阳性表达菌株,并用考马斯亮蓝染色、Western blot等法鉴定融合蛋白的表达情况。结果成功构建了携带NS蛋白标签的p ET21c-NSMCS载体,并成功将其应用于衣原体RNA聚合酶核心酶亚基融合蛋白的构建及表达。结论获得稳定表达NS-α、NS-β、NS-β'融合蛋白的表达载体,为研究衣原体基因转录调控奠定了良好的基础。 展开更多
关键词 strep蛋白标签 表达载体 融合蛋白 克隆 RNA聚合酶 衣原体
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表达Strep-tag II的重组塞内卡病毒的构建与鉴定
2
作者 史家宝 蒙靓 +4 位作者 肖培宇 范峻豪 安同庆 王海伟 于力 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期140-146,共7页
为构建表达Strep-tag II的重组塞内卡病毒(SVA),本研究在感染性cDNA克隆p SVA-I212V/S460L的基础上,采用重叠延伸PCR扩增Strep-tag II并采用无缝克隆法将其插入SVA VP1基因C端,构建感染性cDNA克隆,命名为p SVA-Strep,并采用双酶切和测... 为构建表达Strep-tag II的重组塞内卡病毒(SVA),本研究在感染性cDNA克隆p SVA-I212V/S460L的基础上,采用重叠延伸PCR扩增Strep-tag II并采用无缝克隆法将其插入SVA VP1基因C端,构建感染性cDNA克隆,命名为p SVA-Strep,并采用双酶切和测序鉴定正确后,将p SVA-Strep转染BHK-21细胞拯救重组病毒,收集病变细胞上清,并将含有病毒的细胞上清和野生型SVA(SVA-WT)分别感染BHK-21细胞,以未感染病毒的BHK-21细胞作为阴性对照,感染后24 h分别以鼠源SVA VP2蛋白单克隆抗体(MAb)5D10(1∶1000)、鼠源Strep-tag II MAb(1∶2000)作为一抗,以FITC标记的山羊抗小鼠Ig G(1∶2000)为二抗,采用间接免疫荧光试验(IFA)对重组病毒鉴定。IFA结果显示,以鼠源SVA VP2蛋白MAb 5D10为一抗,SVA-WT和重组病毒感染的细胞均出现绿色荧光,以Strep-tag II MAb作为一抗时,仅有重组病毒感染的细胞出现绿色荧光,经SVA-WT感染的BHK-21细胞及阴性对照细胞均无绿色荧光,表明拯救了Strep-tag II标记的重组病毒,并将其命名为r SVA-Strep。将r SVA-Strep在BHK-21细胞中连续传10代,每隔2代采用引物VP1-F/R经PCR鉴定并对第10代重组病毒的VP1基因测序以鉴定r SVA-Strep的遗传稳定性。结果显示,每隔两代的重组病毒经PCR扩增后均出现约780 bp的目的条带,第10代重组病毒扩增的VP1基因测序结果显示Strep-tag II基因仍在重组病毒中,且无基因突变,表明r SVA-Strep的遗传稳定性较强;将SVA-WT和r SVA-Strep分别以MOI 0.01感染BHK-21细胞,在感染后4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h和72 h收获病毒测定病毒滴度并绘制生长曲线,结果显示在病毒感染36 h内r SVA-Strep和SVA-WT生长动力学基本一致,表明Strep-tag II的引入在病毒感染36 h内对SVA的复制基本无影响。采用0.2%甲醛充分灭活r SVA-Strep,并利用Strep-TactinRXT Purification纯化试剂盒纯化该灭活病毒,将r SVA-Strep灭活病毒上清加至Strep-Tactin亲和层析柱,分别用不同体积洗脱缓冲液依次洗脱病毒并通过western blot鉴定病毒的纯化效果。对纯化过程中不同洗脱液洗脱病毒的western blot结果显示,不同体积的洗脱液中E1、E2和E3均出现VP0和VP2两条带,且E1和E2的条带最明显,表明洗脱缓冲液的最佳洗脱体积约为2.2 CV;以上结果表明r SVA-Strep可通过Strep-Tactin亲和层析柱一步法纯化。本研究在SVA中插入Strep-tag II标签,为SVA灭活疫苗的快速纯化提供技术手段,也为其他病原的快速纯化方法的建立提供参考。 展开更多
关键词 塞内卡病毒 strep-tag II 感染性克隆 抗原纯化
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表达Strep-tag的重组H5N6亚型禽流感病毒反向遗传操作系统的建立
3
作者 周圆一 王正祥 +2 位作者 汪亮 徐帅 曾巧英 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2018年第2期15-21,共7页
为构建携带Strep标签的禽流感病毒(Avian infl uenza virus,AIV)A/Goose/Hunan/109/2014(H5N6,HN109)反向遗传操作系统,RT-PCR扩增AIV HN109株8个基因片段,分别连接至p BD双向转录表达载体。通过点突变技术将NS1基因的77~84位的氨基酸... 为构建携带Strep标签的禽流感病毒(Avian infl uenza virus,AIV)A/Goose/Hunan/109/2014(H5N6,HN109)反向遗传操作系统,RT-PCR扩增AIV HN109株8个基因片段,分别连接至p BD双向转录表达载体。通过点突变技术将NS1基因的77~84位的氨基酸替换成Strep-tag。将8个重组质粒共转染293T细胞,48 h后收取细胞上清接种至9~11日龄SPF鸡胚,并检测血凝效价。结果显示,本研究成功拯救病毒株r HN109-NS1-Strep。r HN109-NS1-Strep的8个基因片段序列与亲本毒素HN109株一致;r HN109-NS1-Strep与亲本毒HN109株在MDCK细胞上复制水平相似,在小鼠体内病毒复制能力相似。结果表明,本研究已成功构建携带Strep-tag的H5N6亚型禽流感病毒反向遗传操作系统,为研究该病毒的分子致病机理、传播机制及新型疫苗的研制奠定了基础。 展开更多
关键词 禽流感病毒 H5N6亚型 strep-tag
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链球菌鉴定新方法:用DHPA法及API 20 strep鉴定链球菌
4
作者 何林 李芳芳 +2 位作者 戴小波 吴劲松 吴伟元 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第2期127-131,共5页
目的建立链球菌快速鉴定新方法。方法依据双歧鉴定法和层次分析原理建立了双歧层次分析(DHPA)法,用DHPA法及API 20 strep试条鉴定链球菌。结果DHPA法和API法对链球菌47个已知鉴定单元(KIU)鉴定的正确性均为100%,DHPA法与API法对链球菌3... 目的建立链球菌快速鉴定新方法。方法依据双歧鉴定法和层次分析原理建立了双歧层次分析(DHPA)法,用DHPA法及API 20 strep试条鉴定链球菌。结果DHPA法和API法对链球菌47个已知鉴定单元(KIU)鉴定的正确性均为100%,DHPA法与API法对链球菌3410个试验分析的总符合率为77.9%,DHPA法与API法对161株临床菌株鉴定的符合率为73.3%。结论DAPA法解决了API法存在的缺码或不能鉴定问题,是链球菌准确、快速、简便、经济和实用的鉴定方法。 展开更多
关键词 链球菌 鉴定 双歧层次分析鉴定法 API 20 strep试条
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DNA错配修复蛋白MutS和MutL的相互作用研究(英文) 被引量：7
5
作者 毕利军 张先恩 +1 位作者 周亚凤 张治平 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2005年第12期1178-1184,共7页
MutL和MutS是DNA错配修复系统中起关键作用的修复蛋白.利用基因融合技术高效表达了MutL和MutS融合蛋白,并利用它们发展了一种研究二者相互作用的简便方法.融合蛋白MutL-GFP(Trx-His6-GFP-(Ser-Gly)6-MutL),MutL-StreptagⅡ(Trx-His6-(Se... MutL和MutS是DNA错配修复系统中起关键作用的修复蛋白.利用基因融合技术高效表达了MutL和MutS融合蛋白,并利用它们发展了一种研究二者相互作用的简便方法.融合蛋白MutL-GFP(Trx-His6-GFP-(Ser-Gly)6-MutL),MutL-StreptagⅡ(Trx-His6-(Ser-Gly)6-StreptagⅡ-(Ser-Gly)6-MutL)和MutS(Trx-His6-(Ser-Gly)6-MutS)被构建并在大肠杆菌中高效表达.收集菌体细胞、超声波破碎后离心取上清进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,结果表明有与预期分子质量相应的诱导表达条带出现,其表达量约占全细胞蛋白的30%且以可溶形式存在.利用固定化金属离子配体亲和层析柱分别纯化融合蛋白,其纯度达到90%.通过将MutS蛋白固定的方法研究两种MutL融合蛋白分别与MutS之间的相互作用.结果表明:只有MutS蛋白与含有错配碱基DNA分子结合后才与MutL蛋白发生相互作用.通过检测MutL融合蛋白标记的绿色荧光信号或酶学显色信号来鉴定相互作用的发生.建立的融合分子系统方法也为研究其他的蛋白质或生物大分子之间的相互作用提供了一个技术平台. 展开更多
关键词 融合蛋白 绿色荧光蛋白 strep tagⅡ MUTS MUTL 相互作用
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100株猪链球菌的生化检测及药物敏感性分析 被引量：11
6
作者 白雪梅 张亚兰 +5 位作者 孙娜 周永运 叶长芸 郑瀚 杜华茂 徐建国 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第5期396-398,422,共4页
目的对2005年7、8月份中国各地分离到的猪链球菌进行血清分型、生化反应检测和药物敏感性分析。方法利用购自丹麦的猪链球菌分型血清进行血清分型,用api-strep生化鉴定条进行生化鉴定,采用微量稀释法进行药物敏感性分析。结果共对100株... 目的对2005年7、8月份中国各地分离到的猪链球菌进行血清分型、生化反应检测和药物敏感性分析。方法利用购自丹麦的猪链球菌分型血清进行血清分型,用api-strep生化鉴定条进行生化鉴定,采用微量稀释法进行药物敏感性分析。结果共对100株菌株进行了检测,血清分型均为血清2型,共得到15种生化反应编码,检测的13种抗生素中,100株猪链球菌对青霉素,氨苄西林,头孢噻肟,头孢曲松,头孢吡肟,美罗培南,左旋氟沙星,氯霉素,红霉素,阿齐霉素,克林霉素,万古霉素均敏感,对四环素均耐药。结论2005年7-8月份中国各地分离到猪链球菌均为血清2型,不同菌株间生化反应存在差异,所有菌株对β-内酰氨类药物较敏感。 展开更多
关键词 猪链球菌 血清分型 api-strep生化鉴定 微量稀释法
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鳗鱼、蜂蜜中链霉素、双氢链霉素残留量的液相色谱-串联质谱法测定 被引量：10
7
作者 张伟 盛永刚 +2 位作者 古淑青 邓晓军 陈舜胜 《分析测试学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第6期688-692,共5页
建立了液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）法同时检测鳗鱼和蜂蜜中链霉素和双氢链霉素残留量的方法。样品用庚烷磺酸钠和磷酸盐缓冲液提取,经SUPELCO LC-C18固相萃取净化后,采用Thermo Aquasil-C18色谱柱（150 mm×4.6 mm,3μm）分离... 建立了液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）法同时检测鳗鱼和蜂蜜中链霉素和双氢链霉素残留量的方法。样品用庚烷磺酸钠和磷酸盐缓冲液提取,经SUPELCO LC-C18固相萃取净化后,采用Thermo Aquasil-C18色谱柱（150 mm×4.6 mm,3μm）分离,以含0.3%乙酸的乙腈溶液和0.3%乙酸水溶液为流动相进行梯度洗脱,多反应监测模式测定,外标法定量。该方法在10～100μg/kg质量浓度范围内线性关系良好,定量下限均为10μg/kg。方法的回收率为89.6%～110.3%,相对标准偏差为2.3%～20.9%。该方法简便、实用、准确、快捷,能够满足蜂蜜和鳗鱼中链霉素和双氢链霉素残留量的检测需要。 展开更多
关键词 液相色谱-串联质谱 蜂蜜 鳗鱼 链霉素 双氢链霉素 残留
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自腹泻猪粪便中分离两株马肠链球菌
8
作者 石丽飞 覃云鹏 陈帮演 《广西畜牧兽医》 1991年第4期29-29,共1页
1990年1月,广西百色地区猪种场发生了一起猪腹泻暴发流行。我们从猪腹泻便中分离出两株马肠链球菌。(Strep. equinus)现将分离鉴定结果报告如下: 细菌分离鉴定:在血乎板培养35℃24小时,菌落呈灰色,细小、圆整、凸起、直径为0.5～1.0mm,... 1990年1月,广西百色地区猪种场发生了一起猪腹泻暴发流行。我们从猪腹泻便中分离出两株马肠链球菌。(Strep. equinus)现将分离鉴定结果报告如下: 细菌分离鉴定:在血乎板培养35℃24小时,菌落呈灰色,细小、圆整、凸起、直径为0.5～1.0mm,有α溶血现象,呈长短不一的链状排列。 展开更多
关键词 马肠链球菌 涂片染色 strep 溶血现象 细菌分离鉴定 链状排列 触酶 血平板 肠球菌 分离菌
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抗生素和干扰素
9
《生物技术通报》 CAS CSCD 1993年第5期45-47,共3页
关键词 生物合成基因 诱变剂 羟化酶 基因融合 搅拌式 活性检测 聚蛋白胨 strep 假单胞菌 坏死因子
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放线菌
10
作者 閻遜初 《生物学教学》 1960年第5期1-3,共3页
近年来主要是由于抗菌素的筛选和发酵以及土壤微生物学的研究,大家对于放线菌都渐渐重视起来,因而微生物学中这一个比较新的部门才得到了迅速的发展,特予简单介绍,以供参考。Ⅰ.放线菌在微生物界中的分类位置放线菌是介于细菌、真菌之... 近年来主要是由于抗菌素的筛选和发酵以及土壤微生物学的研究,大家对于放线菌都渐渐重视起来,因而微生物学中这一个比较新的部门才得到了迅速的发展,特予简单介绍,以供参考。Ⅰ.放线菌在微生物界中的分类位置放线菌是介于细菌、真菌之间的一个微生物类群,由于其中比较高级的类型——放线菌属(Actinomyces)的菌落呈菌丝体状(由菌丝分枝而长成的丛团),又有气生菌丝体和分孢子,很象真菌,所以早先有许多真菌学家把它们放在真菌里面。近年来放线菌在微生物界中的位置才明确起来,它们和真菌的近似只是外貌上的,但本质上更接近细菌,以下几点可兹证明: 展开更多
关键词 土壤微生物学 微生物类群 气生菌丝体 放线菌属 真菌学家 界中 植物病害 菌索 strep 瓦克斯曼
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