Red/ET同源重组系统介导的质粒载体快速构建

1

作者 苏春 余佳 +1 位作者 邱荣国 唐莉 《大连理工大学学报》 EI CAS CSCD 北大核心 2013年第1期12-17,共6页

Red/ET重组技术是近年来建立的一种基于高效率体内同源重组的新型遗传工程技术,该技术简便、快速.首先,通过一步融合的方法将链霉素抗性基因和氯霉素抗性基因同时克隆至pUC19上,从而构建出含有正反选择标记的载体pRC;其次,用安普霉素抗... Red/ET重组技术是近年来建立的一种基于高效率体内同源重组的新型遗传工程技术,该技术简便、快速.首先,通过一步融合的方法将链霉素抗性基因和氯霉素抗性基因同时克隆至pUC19上,从而构建出含有正反选择标记的载体pRC;其次,用安普霉素抗性基因或者氯霉素抗性基因替换了常用表达载体pET-28b上的卡那霉素抗性基因,改变了其抗性选择标记,得到的表达载体pMT和pCT可以更广泛地应用于不同宿主中;最后,还将启动和终止表达的区域定点插入pACYC184载体中,使其成为可以独立表达蛋白的表达载体p184.本研究所得到的载体为大肠杆菌宿主菌中的基因克隆和蛋白表达提供了基础. 展开更多

关键词 red et技术 同源重组 抗性基因 一步融合 正反选择标记 克隆

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利用Red/ET系统结合rpsL反向筛选敲除AcMNPV lef-10基因 被引量：1

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作者 白玉 许晓东 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2015年第12期181-190,198,共11页

【目的】利用Red/ET系统结合rpsL反向筛选建立苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)晚期表达因子lef-10点突变载体,为进一步研究AcMNPVlef-10的功能奠定基础。【方法】利用Red/ET系统结合rpsL反向筛选BAC修饰系统对AcMNPV lef-10进行点突... 【目的】利用Red/ET系统结合rpsL反向筛选建立苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)晚期表达因子lef-10点突变载体,为进一步研究AcMNPVlef-10的功能奠定基础。【方法】利用Red/ET系统结合rpsL反向筛选BAC修饰系统对AcMNPV lef-10进行点突变,由于lef-10和必需基因vp1054有重叠,所以在敲除lef-10时只能通过引进点突变使lef-10失活,避免影响vp1054的正常表达。首先,构建rpsL-AMP筛选盒,然后在野生型AcBacmid中引进点突变(方法是通过2次Red/ET重组:第1次重组在野生型AcBacmid lef-10中引进rpsL-AMP抗性筛选标记,形成一次重组Bacmid,第2次重组是在一次重组Bacmid中引进含点突变的lef-10片段),再利用链霉素反向筛选去除rpsL-AMP抗性筛选标记,同时引入相应的点突变。将从lef-10基因点突变重组菌中提取得到的AcBacmid与质粒pTriEx1.1和pTriEx-innateP-lef10分别共转染草地贪夜蛾Sf9细胞,同时用野生型AcBacmid与质粒pTriEx1.1共转染Sf9细胞作为对照,显微镜下观察病毒的复制情况,确定lef-10基因是否为AcMNPV的必需基因。【结果】通过对重组Bacmid的PCR鉴定和点突变序列的测定,证明AcMNPVlef-10基因已经发生点突变;通过共转染试验发现,随着转染时间的延长,lef-10补回型病毒和野生型病毒一样,均能在Sf9细胞中复制产生具有感染性的子代病毒粒子BV,从而对邻近细胞造成二次感染,使得细胞死亡,且lef-10补回型重组病毒产生感染性病毒粒子的能力与野生型基本一致;而由于lef-10缺失型重组病毒不能产生有感染性的病毒粒子,所以在被lef-10缺失型重组病毒转染的细胞中,细胞数目不会随着转染时间的增加而发生明显改变。【结论】利用Red/ET重组系统结合rpsL反向筛选系统可以在Ac MNPVlef-10基因中引入点突变,且lef-10是杆状病毒生活周期中的一个必需基因,其缺失会影响杆状病毒的复制。 展开更多

关键词 苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV) lef-10 red/et重组系统 rpsL反向筛选系统 基因敲除

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Red重组系统及在微生物基因敲除中的应用 被引量：20

3

作者 胡堃 史兆兴 +1 位作者 赛道建 黄留玉 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2003年第5期628-632,共5页

在完成了对各种微生物基因组的测序以后,功能基因学的研究变得尤为重要。研究基因功能最直接的方法便是将待研究的基因失活。最初构建基因突变体是采用大肠杆菌的RecA系统,但是RecA重组系统操作复杂,重组效率低。最近建立了Red重组系统... 在完成了对各种微生物基因组的测序以后,功能基因学的研究变得尤为重要。研究基因功能最直接的方法便是将待研究的基因失活。最初构建基因突变体是采用大肠杆菌的RecA系统,但是RecA重组系统操作复杂,重组效率低。最近建立了Red重组系统,该系统由3个蛋白组成:α蛋白(即λ核酸外切酶),β蛋白,Gam蛋白。应用Red系统进行基因敲除,可以直接利用线性打靶DNA,两侧同源臂长度在35～60bp即可发生同源重组,且重组效率高。 展开更多

关键词 red重组系统 基因敲除 抗药性基因 微生物

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采用Red重组系统敲除铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因 被引量：8

4

作者 余华 熊浚智 +4 位作者 何晓梅 盛哈蕾 蔡文强 谢玮 张克斌 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期129-132,137,共5页

目的敲除铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因,获得无弹性蛋白酶活性的铜绿假单胞菌菌株。方法采用PCR从pKD46质粒上扩增λ噬菌体的Red重组酶基因,并将其克隆到大肠杆菌和铜绿假单胞菌穿梭质粒pUCP多克隆位点上,电击转化铜绿假单胞菌PAO1感受态... 目的敲除铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因,获得无弹性蛋白酶活性的铜绿假单胞菌菌株。方法采用PCR从pKD46质粒上扩增λ噬菌体的Red重组酶基因,并将其克隆到大肠杆菌和铜绿假单胞菌穿梭质粒pUCP多克隆位点上,电击转化铜绿假单胞菌PAO1感受态细胞,构建PAO1/pUCP-Red基因敲除体系。常规基因操作构建两端与弹性蛋白酶基因上、下游同源,中间为庆大霉素抗性基因的线性打靶片段;并将其电击转化pUCP-Red/PAO1感受态;采用庆大霉素和羧苄青霉素抗性平板初步筛选阳性重组菌;通过PCR、RT-PCR及弹性蛋白酶活性检测方法,鉴定菌株弹性蛋白酶基因的敲除情况。结果本研究通过构建Red重组系统,获得了无弹性蛋白酶活性的铜绿假单胞菌菌株。结论本研究成功敲除了铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因,所获无弹性蛋白酶活性的菌株将为系统深入研究弹性蛋白酶在铜绿假单胞菌致病性中的详细作用机理提供材料和基础。 展开更多

关键词 铜绿假单胞菌 弹性蛋白酶 基因敲除 red重组系统

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利用λRed重组系统敲除鼠伤寒沙门氏菌sopB基因 被引量：5

5

作者 李晔 张西轩 +3 位作者 郭梦征 王素英 张坤生 阮海华 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第9期171-177,共7页

利用λRed重组系统敲除鼠伤寒沙门氏菌LT2的(Salmonella enterica serovar typhimurium LT2,S.typhimurium LT2)sopB基因。以pKD4质粒为模板,扩增得到中间带有卡那霉素抗性基因且两端各带有59 bp分别与sopB基因上下游序列同源的同源打... 利用λRed重组系统敲除鼠伤寒沙门氏菌LT2的(Salmonella enterica serovar typhimurium LT2,S.typhimurium LT2)sopB基因。以pKD4质粒为模板,扩增得到中间带有卡那霉素抗性基因且两端各带有59 bp分别与sopB基因上下游序列同源的同源打靶片段,将其转化至表达Red重组酶的S.typhimurium LT2感受态细胞中;在抗生素压力和λRed重组系统帮助下,同源片段和菌体sopB基因发生同源重组,通过卡那霉素筛选得到带有抗性标记的阳性重组菌;转入重组酶表达质粒pCP20以除去抗性标记,得到保留单一FRT位点的突变菌株;利用PCR技术鉴定重组菌,并通过检测沙门氏菌效应蛋白SopB的分泌以及沙门氏菌感染HeLa细胞后pAKT的激活反应来鉴定sopB基因是否被敲除。构建的ΔsopB突变菌株失去了分泌SopB蛋白的能力,且不能够像野生型菌株那样在感染HeLa细胞的过程中激活pAkt。本研究获得了S.typhimurium LT2的sopB基因缺失突变株,为沙门氏菌感染宿主过程中SopB的功能研究提供工具,同时也为进一步探索其他类型细菌的基因敲除提供了线索。 展开更多

关键词 鼠伤寒沙门氏菌LT2λred 重组系统 sopB 基因敲除 同源重组

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利用Red重组系统敲除大肠杆菌rnc基因构建dsRNA原核表达体系 被引量：6

6

作者 尹国华 刘楠 +3 位作者 孙兆楠 宋云枝 朱常香 温孚江 《山东农业大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2009年第3期317-324,共8页

大肠杆菌的rnc基因编码产物为RNaseIII酶,RNaseIII酶能降解细菌中绝大多数dsRNA。利用来源于λ噬菌体的Red重组系统和重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR),敲除了大肠杆菌origami(DE3)菌株的rnc基因,获得... 大肠杆菌的rnc基因编码产物为RNaseIII酶,RNaseIII酶能降解细菌中绝大多数dsRNA。利用来源于λ噬菌体的Red重组系统和重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR),敲除了大肠杆菌origami(DE3)菌株的rnc基因,获得了RNaseIII缺失型菌株M-origami。利用电激法,将构建的TMV运动蛋白基因(movement protein gene,MP)的dsRNA表达载体LMP480导入M-origami菌株中,IPTG诱导表达的结果显示:构建的M-origami/LMP480原核表达系统能高效表达TMV运动蛋白基因的dsRNA。初步的抗病性鉴定显示,表达的dsRNA能够诱发烟草对TMV的抗性。 展开更多

关键词 red重组系统 重叠延伸PCR RNaseIII缺失菌株 DSRNA 病毒抗性

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Red/ET同源重组介导细菌人工染色体的快速修饰 被引量：4

7

作者 王军平 张友明 粟永萍 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2005年第5期468-473,共6页

随着基因组测序工程的实施与完成,如何对包含完整基因信息的特定细菌人工染色体(BAC)进行有目的修饰,已成为功能基因组学研究的一个重要环节.应用新近优化的Red/ET同源重组技术对目标BAC进行修饰,以pSC101-BAD-gbaA为依托质粒,采用rpsL... 随着基因组测序工程的实施与完成,如何对包含完整基因信息的特定细菌人工染色体(BAC)进行有目的修饰,已成为功能基因组学研究的一个重要环节.应用新近优化的Red/ET同源重组技术对目标BAC进行修饰,以pSC101-BAD-gbaA为依托质粒,采用rpsL鄄neo为正/反向筛选系统,可以快速、高效地对BAC进行剪切、插入、替换等操作,其中能够进行抗性筛选的一步BAC修饰只需一周时间,以插入非抗性标记基因Cre为代表的两步BAC修饰在两周内即可完成.通过阿拉伯多糖诱导调控和简单地变化培养温度,能使pSC101-BAD-gbaA依托质粒在发挥完Red/ET同源重组作用后自然消失,最终获得完整而纯净的修饰后BAC,为加快功能基因组学研究提供了一个可靠的实验平台. 展开更多

关键词 red/et同源重组 BAC修饰 功能基因组

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一种可转移的重组工程系统pYM-Red的建立 被引量：1

8

作者 于梅 周建光 +2 位作者 陈伟 李山虎 黄翠芬 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2005年第4期359-364,共6页

重组工程是近几年发展的新型遗传工程技术.以PCR扩增的线性低拷贝质粒pACYCl84为载体,用Gap-repair方法从大肠杆菌DY330染色体上直接体内亚克隆了包括Red重组酶基因在内的长约6.7kb的基因序列,构建了pYM-Red重组质粒.在宿主菌W3110体内... 重组工程是近几年发展的新型遗传工程技术.以PCR扩增的线性低拷贝质粒pACYCl84为载体,用Gap-repair方法从大肠杆菌DY330染色体上直接体内亚克隆了包括Red重组酶基因在内的长约6.7kb的基因序列,构建了pYM-Red重组质粒.在宿主菌W3110体内进行了染色体上galk基因的敲除,验证了Red重组酶的生物功能,并确定了影响pYM-Red重组效率的诱导时间和线性DNA片段用量.在42℃诱导10 min和线性DNA打靶分子浓度为300 ng时,pYM-Red的重组效率可达到大约每4 000个电转存活细胞中有1个重组阳性克隆,分别比pKD46和pBR322-Red系统高5～6倍. 展开更多

关键词 重组工程 red重组系统 Gap—repair 体内克隆 pYM—red质粒

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Red重组系统介导下大肠杆菌改造体系的优化 被引量：2

9

作者 张穗生 郭媛 +5 位作者 韦廷宗 裴建新 黎贞崇 陈东 黄志民 黄日波 《广西科学》 CAS 2010年第2期160-163,共4页

对Red重组系统介导下大肠杆菌进行遗传改造的转化条件、诱导条件、复苏条件三方面实验参数进行优化研究。结果表明:电转化加入的DNA为20ng,Red重组系统感受态细胞培养浓度为OD600=0.60,所需的电击感受态细胞数为3×108;对大肠杆菌... 对Red重组系统介导下大肠杆菌进行遗传改造的转化条件、诱导条件、复苏条件三方面实验参数进行优化研究。结果表明:电转化加入的DNA为20ng,Red重组系统感受态细胞培养浓度为OD600=0.60,所需的电击感受态细胞数为3×108;对大肠杆菌基因做双敲除时,突变第2个基因的阿拉伯糖诱导最适时间比突变首个基因延长,诱导浓度为40μm,复苏时间变化对体系影响不显著。 展开更多

关键词 red重组系统 转化条件 诱导条件 复苏条件

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Red/ET重组在基因打靶载体快速构建中的应用 被引量：11

10

作者 王军平 张友明 《遗传》 CAS CSCD 北大核心 2005年第6期953-958,共6页

通过合理应用Red/ET重组技术实现基因打靶载体的快速构建。在Red/ET重组介导下,首先从基因组DNA中将靶基因片段亚克隆至打靶质粒载体中,随后将两端带有50 bp同源臂的抗性筛选基因插入并替换靶基因上的目标序列,如此两步操作即可完成一... 通过合理应用Red/ET重组技术实现基因打靶载体的快速构建。在Red/ET重组介导下,首先从基因组DNA中将靶基因片段亚克隆至打靶质粒载体中,随后将两端带有50 bp同源臂的抗性筛选基因插入并替换靶基因上的目标序列,如此两步操作即可完成一个传统型基因敲除打靶载体的构建;结合Cre-loxP系统,在传统型基因敲除打靶载体的基础上,经过再一轮的Red/ET重组就能够成功实现条件性基因敲除打靶载体的构建。整个实验过程不需要PCR扩增长、短臂序列,也不涉及酶切、连接反应,因此,不仅省时、省力,而且所构建的基因打靶载体序列准确,无突变。实验方法的建立为加速后基因组时代的基因功能研究提供了一条捷径。 展开更多

关键词 基因打靶载体构建 red/et重组 基因敲除

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采用Red重组系统构建包装菌株DH-gIII 被引量：1

11

作者 高荣凯 王芃 王琰 《微生物学杂志》 CAS CSCD 2008年第4期39-42,共4页

选择感染性噬菌体技术是研究蛋白相互作用的良好手段,获得基因III缺陷的辅助噬菌体是构成SIP体系的关键。为制备基因III缺失的辅助噬菌体,利用λRed重组系统将完整的噬菌体基因III和氯霉素抗性基因整合到大肠埃希菌DH5α的染色体上组氨... 选择感染性噬菌体技术是研究蛋白相互作用的良好手段,获得基因III缺陷的辅助噬菌体是构成SIP体系的关键。为制备基因III缺失的辅助噬菌体,利用λRed重组系统将完整的噬菌体基因III和氯霉素抗性基因整合到大肠埃希菌DH5α的染色体上组氨酸操纵元位点构建包装菌株,经氯霉素抗性筛选并用PCR及组氨酸表型鉴定,获得包装菌株DH-gIII;将缺失功能基因III的缺陷型噬菌体基因组转化到包装菌株中培养制备辅助噬菌体,以集落形成试验来检测缺陷型噬菌体的感染能力,结果滴度可达到4.3×108,只具备一次感染力,表明包装菌株构建成功,能用来制备辅助噬菌体,有望用于SIP体系。 展开更多

关键词 包装菌株 red重组系统 辅助噬菌体

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基于Red重组系统进行基因替换的方法建立 被引量：1

12

作者 黄晓萍 郭建军 +1 位作者 钟青 罗成 《安徽农业科学》 CAS 2012年第24期11949-11950,11956,共3页

快速、高效替换目的基因是大肠杆菌基因工程菌研究的前提和基础。该试验利用Red重组系统结合基因工程技术替换基因工程菌苗中的氯霉素抗性基因,同时留下半乳糖筛选标记基因,结果在Red重组系统的帮助下成功实现了半乳糖筛选标记基因对氯... 快速、高效替换目的基因是大肠杆菌基因工程菌研究的前提和基础。该试验利用Red重组系统结合基因工程技术替换基因工程菌苗中的氯霉素抗性基因,同时留下半乳糖筛选标记基因,结果在Red重组系统的帮助下成功实现了半乳糖筛选标记基因对氯霉素抗性基因的置换,同时菌苗的其他表型特征未发生任何改变。该方法的建立将为具有新遗传特性的工程菌株和基因功能研究提供有力的工具。 展开更多

关键词 red重组系统 基因替换 筛选标记

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基于Red重组系统的阴沟肠杆菌基因重组技术 被引量：2

13

作者 张忠喜 顾金杰 +3 位作者 林汉标 廖鲜艳 史吉平 郝健 《食品工业科技》 CAS CSCD 北大核心 2018年第21期134-140,151,共8页

目的:开发一种基于Red重组系统的E.cloacae基因重组技术。方法:将Red重组酶基因连接于表达载体形成pSC-MSC-red,将Flp重组酶基因连接于表达载体形成pSC-MSC-flp。以budA基因(编码乙酰乳酸脱羧酶)为例,构建了不同长度同源臂的抗性盒。将... 目的:开发一种基于Red重组系统的E.cloacae基因重组技术。方法:将Red重组酶基因连接于表达载体形成pSC-MSC-red,将Flp重组酶基因连接于表达载体形成pSC-MSC-flp。以budA基因(编码乙酰乳酸脱羧酶)为例,构建了不同长度同源臂的抗性盒。将这些DNA片段分别转化入携带p SC-MSC-red质粒的E.cloacae进行基因重组。结果:使用同源臂长度为39和100 bp的抗性盒不能得到重组子;同源臂长度为200 bp的抗性盒可以获得重组子E.cloacaeΔbudA-773,重组效率为6.1 CFU/μg DNA;同源臂长度为500 bp时,重组效率提高到131.5 CFU/μg DNA。将表达Flp重组酶的质粒pSC-MSC-flp转化入重组菌株中传代培养成功消除了抗性标记。对重组菌株E.cloacae ΔbudA进行发酵培养实验,菌株丧失了合成乙偶姻和2,3-丁二醇的能力,表明budA基因被成功敲除。结论:本文建立了一种适用于E.cloacae的基因重组方法。 展开更多

关键词 red重组系统 阴沟肠杆菌 Α-乙酰乳酸脱羧酶 基因敲除

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利用Red重组系统敲除家蚕核型多角体病毒的vlf-1基因及对病毒复制的影响 被引量：1

14

作者 杜超逸 于威 +4 位作者 全滟平 陈健 聂作明 吕正兵 张耀洲 《蚕业科学》 CAS CSCD 北大核心 2013年第2期283-288,共6页

利用Red重组系统和家蚕核型多角体病毒(BmNPV)Bacmid在E.coli DH10Bac中快速敲除BmNPV极晚期表达因子基因vlf-1,调查对病毒复制的影响,以探究BmNPV vlf-1基因的功能。首先从E.coli BW25113中提取能表达Red重组酶的质粒pKD46,将其转化到E... 利用Red重组系统和家蚕核型多角体病毒(BmNPV)Bacmid在E.coli DH10Bac中快速敲除BmNPV极晚期表达因子基因vlf-1,调查对病毒复制的影响,以探究BmNPV vlf-1基因的功能。首先从E.coli BW25113中提取能表达Red重组酶的质粒pKD46,将其转化到E.coli DH10Bac中,获得可用于BmNPV基因打靶的DH10Bac(含有质粒pKD46)菌株;再为发生基因同源重组设计一对长60 bp的引物,5'端长40 bp,分别为vlf-1基因的左右同源臂,3'端长20 bp,分别为氯霉素抗性基因(cat)的首尾序列;以含有cat的pKD3质粒为模板,PCR扩增含vlf-1同源臂的cat基因,即打靶线性化片段;将该线性化片段转入DH10Bac(pKD46)菌株,在Red重组酶的作用下,线性化片段与Bacmid DNA中的vlf-1基因发生同源重组。利用设计的2对特异性引物PCR验证cat基因替换vlf-1基因操作成功,获得vlf-1缺失型BmNPV。将vlf-1缺失型Bacmid DNA转染BmN细胞,利用qPCR分析vlf-1基因缺失对于病毒复制的影响,结果表明:vlf-1基因缺失对BmNPV起始DNA复制没有明显的影响,但是可能影响之后的病毒装配和侵染。 展开更多

关键词 家蚕核型多角体病毒 vlf-1基因 red重组系统 病毒复制

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表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组火鸡疱疹病毒构建及应用

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作者 宋新宇 张茜 +3 位作者 贡鑫 戚亭 陈雨 车艳杰 《中国动物检疫》 CAS 2024年第9期122-128,共7页

为构建表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组火鸡疱疹病毒(herpesvirusofturkey,HVT),以连续覆盖HVT全基因组的Fosmid文库为基础,利用Red/ET同源重组技术和Gateway LR克隆技术,将优化的携带Pec复合启动子的HA基因插入到HVT复制非必需区HVT... 为构建表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组火鸡疱疹病毒(herpesvirusofturkey,HVT),以连续覆盖HVT全基因组的Fosmid文库为基础,利用Red/ET同源重组技术和Gateway LR克隆技术,将优化的携带Pec复合启动子的HA基因插入到HVT复制非必需区HVT053与HVT054位点处的95318~95319nt之间,获得了表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组HVT(rHVT-H9-HA株),并对构建的毒株进行鉴定。结果显示,成功构建了含有HA基因的入门质粒pEntr-HA,通过Gateway克隆的LR反应将含有HA基因的表达盒转移到黏粒pFosC DEST的第53和54号基因之间形成pFosC HA;提取5个黏粒后,转染次代CEF细胞获得拯救重组病毒rHVT-H9-HA株。连续传代和动物试验结果表明,rHVT-H9-HA株毒价高,遗传稳定,可以克服母源抗体干扰,免疫持续期长,能够提供针对H9亚型禽流感的保护;同时也实现了一针防两病,效果明显优于灭活疫苗。本研究为H9亚型禽流感病毒重组HVT活载体疫苗的研制提供了技术支撑。 展开更多

关键词 重组毒株rHVT-H9-HA 火鸡疱疹病毒 HA基因 red/et同源重组技术 GatewayLR克隆技术

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禽致病性大肠杆菌CE129 Ⅵ型分泌系统主要亚单位基因hcp1、hcp2缺失株的构建与验证 被引量：5

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作者 丁雪燕 张琪 +5 位作者 田延 王亨 张伟 石宝兰 张建军 朱国强 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第5期381-385,共5页

为获得禽致病性大肠杆菌(APEC)CE129 Ⅵ型的hcp1、hcp2基因缺失株,本研究利用Red同源重组系统对APEC野生株CE129的Ⅵ型分泌系统(T6SS)hcp1和hcp2基因进行敲除,获得hcp1、hcp2基因单缺失株CE129△hcp1、CE129△hcp2和双缺失株CE129△hcp1... 为获得禽致病性大肠杆菌(APEC)CE129 Ⅵ型的hcp1、hcp2基因缺失株,本研究利用Red同源重组系统对APEC野生株CE129的Ⅵ型分泌系统(T6SS)hcp1和hcp2基因进行敲除,获得hcp1、hcp2基因单缺失株CE129△hcp1、CE129△hcp2和双缺失株CE129△hcp1△hcp2。将hcp1、hcp2基因分别克隆到表达载体pBR322和pACYC184中,构建相应的基因回补株CE129△hcp1/phcp1、CE129△hcp2/phcp2和CE129△hcp1△hcp22/phcp1phcp2。通过PCR特异性检测和基因测序显示,上述突变株与回补株均成功构建,且均能够稳定遗传。上述基因缺失株和回补株的成功构建,有助于深入了解APEC CE129菌株T6SS的作用机制,为进一步研究APEC的致病机理及其防控奠定了基础。 展开更多

关键词 red同源重组系统 Ⅵ型分泌系统 hcp1 hcp2

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UPEC双组分信号系统KguS/KguR调控基因缺失株的构建及其生长特性研究 被引量：1

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作者 李国强 朱丽萍 +2 位作者 朱丽臻 陈蕾蕾 颜世敢 《南京农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第6期1113-1117,共5页

[目的]构建尿道致病性大肠杆菌(uropathogenic Escherichia coli,UPEC) CFT073株的双组分信号系统Kgu S/KguR调控的c5032—c5037基因的缺失株,并研究基因缺失株在有氧和厌氧条件下的生长特性。[方法]运用Red重组系统将带有c5032—c5037... [目的]构建尿道致病性大肠杆菌(uropathogenic Escherichia coli,UPEC) CFT073株的双组分信号系统Kgu S/KguR调控的c5032—c5037基因的缺失株,并研究基因缺失株在有氧和厌氧条件下的生长特性。[方法]运用Red重组系统将带有c5032—c5037基因同源臂的氯霉素抗性基因取代c5032—c5037基因,在温度敏感型质粒p CP20作用下消除氯霉素抗性基因,构建基因缺失株CFT073Δc5032—c5037,用PCR和基因测序验证基因敲除是否成功,测定有氧和厌氧条件下CFT073Δc5032—c5037在以α-酮戊二酸为唯一碳源的M9培养基中培养不同时间的菌液D600值。[结果]构建了CFT073Δc5032—c5037,PCR验证及基因测序结果均表明已成功敲除c5032—c5037基因;厌氧条件下CFT073Δc5032—c5037在以α-酮戊二酸为唯一碳源的M9培养基中生长比野生型菌株CFT073缓慢,且差异极显著(P<0.01),但在有氧条件下二者的生长无显著差异。[结论]成功构建了基因缺失株CFT073Δc5032—c5037,并试验证实Kgu S/KguR调控的c5032—c5037基因在厌氧条件下参与α-酮戊二酸的利用,为进一步研究Kgu S/KguR在UPEC中的代谢适应机制奠定了基础。 展开更多

关键词 尿道致病性大肠杆菌 KguS/KguR c5032-c5037基因 red重组系统

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鼠伤寒沙门菌sRNA GcvB和伴侣蛋白Hfq对Ⅲ型分泌系统相关基因的调控 被引量：2

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作者 张家莉 潘永 +3 位作者 段世宇 令狐远凤 郑如雯 杨琦 《福建农林大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2023年第4期512-518,共7页

细菌的Ⅲ型分泌系统(T3SS)与毒力密切相关。为探究鼠伤寒沙门菌sRNA GcvB和伴侣蛋白Hfq对T3SS相关基因spaP、invC、invG、prgH、prgI、prgJ、prgK的调控,利用Red同源重组技术构建了上述基因与lacZ的融合菌株,在此基础上利用P22噬菌体转... 细菌的Ⅲ型分泌系统(T3SS)与毒力密切相关。为探究鼠伤寒沙门菌sRNA GcvB和伴侣蛋白Hfq对T3SS相关基因spaP、invC、invG、prgH、prgI、prgJ、prgK的调控,利用Red同源重组技术构建了上述基因与lacZ的融合菌株,在此基础上利用P22噬菌体转导技术分别构建上述融合菌株与gcvB、hfq的单缺失菌株,通过qPCR和β-半乳糖苷酶试验分别检测gcvB、hfq缺失后各基因的转录水平和蛋白水平的变化。结果显示:与标准菌株相比,gcvB缺失后,spaP、invC、prgH、prgI、invG的转录水平和蛋白水平均上调;prgJ、prgK的转录水平上调,蛋白水平下调。hfq缺失后,spaP、invC、prgH、prgI、invG的转录水平和蛋白水平均上调,prgH、prgI、prgJ、prgK的蛋白水平下调。表明Hfq和GcvB均可对spaP、invC、invG、prgH、prgI、prgJ、prgK进行调控。上述结果可为鼠伤寒沙门菌sRNA GcvB和Hfq的作用机理研究提供参考。 展开更多

关键词 鼠伤寒沙门菌 red同源重组 GcvB HFQ Ⅲ型分泌系统

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双组分因子LiaRS调控短短芽胞杆菌X23伊短菌素生物合成的研究

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作者 邱丽婷 张亮 +5 位作者 刘天波 巢进 蔡海林 易克 刘清术 陈武 《中国生物防治学报》 CSCD 北大核心 2024年第5期1036-1044,共9页

双组分系统(two-component system,TCS)参与多种芽胞杆菌次级代谢产物生物合成的调控,但调控伊短菌素生物合成的TCS鲜见报道。前期转录组测序分析发现,在短短芽胞杆菌X23中,双组分因子LiaRS与伊短菌素生物合成基因簇(edeBGC)的表达趋势... 双组分系统(two-component system,TCS)参与多种芽胞杆菌次级代谢产物生物合成的调控,但调控伊短菌素生物合成的TCS鲜见报道。前期转录组测序分析发现,在短短芽胞杆菌X23中,双组分因子LiaRS与伊短菌素生物合成基因簇(edeBGC)的表达趋势一致,推测其可能参与伊短菌素生物合成的调控,通过Red/ET同源重组法敲除野生型X23的liaS和liaR基因,构建了突变体菌株,平皿对峙培养、qRT-PCR定量分析和HPLC-MS靶向代谢分析等结果表明,在相同培养条件下,突变菌株的抑菌圈直径较野生型显著增加,伊短菌素生物合成基因簇的表达量显著上调,且伊短菌素的峰面积是野生型的1.3倍。本研究发现LiaRS是伊短菌素生物合成的负调控因子,为伊短菌素的代谢工程改造提供了候选基因元件。 展开更多

关键词 短短芽胞杆菌 伊短菌素 双组分系统 LiaRS red/et同源重组

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肠炎沙门氏菌tu-fA基因缺失株的构建及其生物学特性研究 被引量：5

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作者 司微 于申业 +2 位作者 陈利苹 刘思国 李广兴 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第5期361-365,共5页

为构建肠炎沙门氏菌(S.enterica)tu-fA基因缺失株及鉴定其生物学特性,本实验利用Red重组系统,以pKD3中的FRT-氯霉素抗性(cat^r)基因-FRT序列为模板,利用含有tu-fA基因两端序列的引物,经PCR扩增同源重组DNA片段(tu-fA5'-FRT-cat^r-FR... 为构建肠炎沙门氏菌(S.enterica)tu-fA基因缺失株及鉴定其生物学特性,本实验利用Red重组系统,以pKD3中的FRT-氯霉素抗性(cat^r)基因-FRT序列为模板,利用含有tu-fA基因两端序列的引物,经PCR扩增同源重组DNA片段(tu-fA5'-FRT-cat^r-FRT-tu-fA3'),将该DNA片段电转化于含有质粒pKD46的S.enterica SM6株中进行同源重组,通过氯霉素抗性筛选tu-fA基因缺失的SM6株(SM6△tu-f A::cat),再通过导入质粒pCP20于SM6△tu-fA::cat中敲除cat r基因,从而构建了tu-fA基因缺失株SM6△tu-fA。生物学特性鉴定结果表明,基因缺失株具有良好的遗传稳定性;与亲本株相比,细菌形态未发生明显改变,但基因缺失株体外生长速率略低,利用碳源的能力有所增强;缺失株侵袭Caco-2细胞的能力与亲本株相比有所降低,表明tu-f A基因编码的延伸因子(EF-Tu)在调控细菌侵袭细胞的过程中起着一定的作用。本研究通过构建tu-fA基因缺失的S.enterica株,为进一步研究tu-fA基因编码的EF-Tu的功能奠定基础。 展开更多

关键词 red同源重组系统 tu-fA基因 缺失株

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