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免疫沉淀联合质谱筛选与纳尔逊湾正呼肠孤病毒σNS互作的宿主RNA结合蛋白
1
作者 李润林 胡思漫 +4 位作者 骆丽可 贾雪娇 刘梦琦 李永刚 陶晓莉 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2023年第9期1546-1550,共5页
目的筛选出宿主细胞中与纳尔逊湾呼肠孤病毒(NBV)非结构蛋白σNS互作的RNA结合蛋白并分析其生物信息学功能。方法本研究通过构建NBVσNS真核表达载体pEF-HA-MB-S3,验证正确后转染HEK293T细胞,所得的细胞蛋白裂解液经RNase A处理后,利用... 目的筛选出宿主细胞中与纳尔逊湾呼肠孤病毒(NBV)非结构蛋白σNS互作的RNA结合蛋白并分析其生物信息学功能。方法本研究通过构建NBVσNS真核表达载体pEF-HA-MB-S3,验证正确后转染HEK293T细胞,所得的细胞蛋白裂解液经RNase A处理后,利用免疫沉淀富集σNS结合蛋白,经LC-MS/MS质谱分析技术鉴定分析互作蛋白,并且借助相关生信工具挖掘蛋白性质和具体功能。结果本实验成功筛选出32个与NBVσNS蛋白存在互作的候选RNA结合蛋白;生物分析结果显示,这些蛋白主要定位于细胞质与细胞核中,并且主要参与细胞代谢、生物调控、病毒翻译与转录等生物学过程。结论本研究初步分析与NBVσNS互作的RNA结合蛋白功能,为深入研究σNS蛋白在NBV生命周期中的作用机制奠定基础。 展开更多
关键词 纳尔逊湾病毒 σNS蛋白 rna结合蛋白 宿主蛋白 免疫沉淀
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紫外交联免疫沉淀技术原理及其应用
2
作者 杜亚琼 王琬瑶 +2 位作者 高帆 徐旸 时文涛 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2024年第1期136-144,共9页
紫外交联免疫沉淀(UV cross-linking immunoprecipitation,CLIP)技术最初建立于2003年。通过紫外交联、免疫沉淀、逆转录及后续的高通量测序等步骤,可在全转录组范围鉴定特定RNA结合蛋白(RNA-binding proteins,RBP)的靶标RNA序列和结合... 紫外交联免疫沉淀(UV cross-linking immunoprecipitation,CLIP)技术最初建立于2003年。通过紫外交联、免疫沉淀、逆转录及后续的高通量测序等步骤,可在全转录组范围鉴定特定RNA结合蛋白(RNA-binding proteins,RBP)的靶标RNA序列和结合位点。在近20年的应用过程中,该技术被不断改进和完善,可操作性、实验结果的准确性都有所提升,技术的应用范围也有所拓展。本文对CLIP技术的基本原理、实验方法、实际应用进行介绍,着重比较几种主流CLIP技术的异同,并对如何选择具体的技术路线提出建议。 展开更多
关键词 紫外交联免疫沉淀 高通量测序 rna结合蛋白
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RNA结合蛋白与RNA相互作用鉴定技术 被引量：6
3
作者 陈伟 许馨 孙绍光 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2017年第2期103-107,共5页
RNA结合蛋白(RNA binding proteins,RBPs)通过与RNA相互作用,广泛参与到RNA的剪切、转运、编辑、胞内定位及翻译调控等过程中。RNA领域尤其是非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)研究的快速发展,催生了多种RBPs-RNAs相互作用鉴定技术。这... RNA结合蛋白(RNA binding proteins,RBPs)通过与RNA相互作用,广泛参与到RNA的剪切、转运、编辑、胞内定位及翻译调控等过程中。RNA领域尤其是非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)研究的快速发展,催生了多种RBPs-RNAs相互作用鉴定技术。这些技术反之又推动了RNA领域的研究进程。本文对紫外交联免疫沉淀(ultraviolet crosslinking and immunoprecipitation,CLIP),CLIP cDNA文库高通量测序(high-throughput sequencing of CLIP cDNA library,HITS-CLIP),光活化核苷增强的CLIP(photoactivatable-ribonucleoside-enhanced crosslinking and immunoprecipitation,PAR-CLIP),单核苷酸分离CLIP(individual nucleotide resolution CLIP,i CLIP),TRIBE(targets of RNA-binding protein identified by editing),RNA标记,相互作用组捕获(interactome capture,IC)和Ser IC(serial RNA interactome capture)等RBPs-RNAs相互作用鉴定技术的基本原理和优缺点以及应用进行综述。 展开更多
关键词 rna结合蛋白 紫外交联免疫沉淀 CLIP cDNA文库高通量测序 光活化核苷增强的CLIP rna结合蛋白免疫沉淀微阵列 TRIBE rna标记 相互作用组捕获
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多能干细胞关键因子Oct4 RNA结合蛋白的分离与鉴定 被引量：1
4
作者 马姬 郭传亮 +2 位作者 范书玥 薛燕 曾凡一 《上海交通大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期4-10,共7页
目的·分离多能干细胞关键因子Oct4的RNA结合蛋白。方法·培养小鼠胚胎干细胞(R1),从中提取细胞总RNA,反转录为cDNA,PCR扩增Oct4并转录为m RNA。采用链霉素亲和层析和质谱技术筛选候选RNA结合蛋白,采用RNA免疫沉淀技术鉴定候选... 目的·分离多能干细胞关键因子Oct4的RNA结合蛋白。方法·培养小鼠胚胎干细胞(R1),从中提取细胞总RNA,反转录为cDNA,PCR扩增Oct4并转录为m RNA。采用链霉素亲和层析和质谱技术筛选候选RNA结合蛋白,采用RNA免疫沉淀技术鉴定候选RNA结合蛋白。结果·经高效液相色谱-质谱法鉴定和筛选出121个能与Oct4 3'非翻译区(untranslated region,UTR)和Oct45'UTR相结合的RNA结合蛋白,肽段图谱匹配数≥2的有11个。并对其中的7个候选RNA结合蛋白进行了进一步验证,结果显示Oct4可与DSP、SOD1、LMNA、NPM1、PSIP1、NCL和HDGF蛋白发生相互作用,其中HDGF与Oct4结合能力最强。结论·Oct4RNA结合蛋白的鉴定将为Oct4的调控机制提供一定理论依据,为后续其功能研究提供基础。 展开更多
关键词 OCT4 rna结合蛋白 胚胎干细胞 rna免疫沉淀
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利用RIP-Seq技术鉴定HepG2细胞中与HuR蛋白结合的lncRNAs 被引量：2
5
作者 黄亚洲 刘叶文 +3 位作者 王玲玲 金晶 陈茜 李伟 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2018年第4期417-426,共10页
长链非编码RNAs(long noncoding RNAs,lncRNAs)可在表观遗传水平、转录水平和转录后水平调节基因的表达,对细胞功能起着重要的调节作用。RNA结合蛋白可与很多的RNA结合,并在转录后水平发挥重要的调节作用。然而,RNA结合蛋白是否可以在... 长链非编码RNAs(long noncoding RNAs,lncRNAs)可在表观遗传水平、转录水平和转录后水平调节基因的表达,对细胞功能起着重要的调节作用。RNA结合蛋白可与很多的RNA结合,并在转录后水平发挥重要的调节作用。然而,RNA结合蛋白是否可以在细胞内广泛结合lncRNAs对其发挥调节作用,仍需进一步证实。本研究通过RNA结合蛋白免疫沉淀技术联合高通量测序(RNA binding protein immunoprecipitation-high throughput sequencing,RIP-Seq)的方法在人肝癌细胞株HepG2中,鉴定与人抗原R(human antigen R,HuR)蛋白相结合的lncRNA分子,并进行了初步的验证。首先,通过HuR-RIP实验分离与HuR蛋白结合的RNA分子,然后高通量测序及生物信息学分析。根据分析结果,鉴定出HepG2细胞中361条与HuR蛋白结合的lncRNAs分子,包括基因间lncRNA(large intergenic noncoding RNA,LincRNA)、内含子lncRNA、与编码基因正义链有重叠的lncRNA和与编码基因反义链有重叠lncRNA(antisense lncRNA)等。并进一步通过RIP-qPCR技术,对其中20条LincRNA分子进行了定量检测,验证测序结果。在HepG2细胞中敲低HuR基因表达,发现这些LincRNA分子中,11条LincRNA分子表达水平显著降低(P<0.05),2条LincRNA显著升高(P<0.05),剩余7条LincRNA表达量未发生变化(P>0.05)。本研究结果说明,HuR在细胞内可以广泛结合lncRNA分子,并且可能对结合的lncRNA分子的表达量产生影响,这也为进一步研究这些lncRNA的功能和HuR调控网络的研究提供了基础。 展开更多
关键词 人抗原R蛋白 长链非编码rna rna结合蛋白免疫沉淀技术-高通量测序 测序数据分析 HEPG2细胞
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烯醇化酶1通过调控PKM的可变剪接促进胃癌的进展
6
作者 王娜 乔慧 +3 位作者 邓成辉 杨磊 曾苗苗 关泉林 《中国肿瘤生物治疗杂志》 北大核心 2025年第7期706-715,共10页
目的:探讨烯醇化酶1(ENO1)对胃癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响及其分子机制。方法:通过WB法检测ENO1在人胃癌细胞HGC27、MKN-45、N-87、MGC803、BGC-823及人胃黏膜上皮细胞GES-1中的表达水平,利用CRISPR、过表达等基因编辑工具分别构建E... 目的:探讨烯醇化酶1(ENO1)对胃癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响及其分子机制。方法:通过WB法检测ENO1在人胃癌细胞HGC27、MKN-45、N-87、MGC803、BGC-823及人胃黏膜上皮细胞GES-1中的表达水平,利用CRISPR、过表达等基因编辑工具分别构建ENO1敲低及敲低—恢复表达细胞株,将MKN-45和BGC-823细胞分别分组为Ctrl组、ENO1 KD组、ENO1KD-OE组。通过克隆形成实验、EdU染色、划痕实验、Transwell实验、流式细胞术检测敲低或敲低—恢复表达ENO1对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响。构建胃癌细胞裸鼠移植瘤模型,通过小动物活体成像技术及肿瘤组织块测量观察ENO1对肿瘤生长的影响。在MKN-45细胞中通过RNA干扰技术沉默ENO1,利用RNA免疫共沉淀-转录组测序(RIP-Seq)结合生物信息学分析技术鉴定ENO1下游的靶基因,分析ENO1调控胃癌细胞增殖、迁移及侵袭的分子机制。结果:ENO1在胃癌细胞中表达水平均显著升高(P<0.01或P<0.001)。在MKN-45和BGC-823细胞中敲低ENO1可显著降低胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力并促进细胞凋亡(P<0.001或P<0.0001);回复实验结果显示,恢复ENO1的表达后,胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力均显著提高并减少细胞凋亡(P<0.05或P<0.01或P<0.001或P<0.0001)。裸鼠荷瘤实验结果表明,敲低ENO1的表达可以显著抑制裸鼠移植瘤的生长(P<0.0001)。与ENO1蛋白具有相互作用的差异基因主要富集于RNA剪切相关通路,且ENO1蛋白与PKM基因具有相互作用,胃癌组织中ENO1与PKM2基因表达事呈正相关(r=0.886)。结论:ENO1在胃癌细胞中呈高表达,其通过与PKM的前体mRNA相互作用影响PKM的RNA剪接过程,进而调控PKM2的表达水平并促进胃癌的进展。 展开更多
关键词 rna结合蛋白 烯醇化酶1 免疫沉淀 胃癌 增殖 迁移 侵袭 凋亡
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构建MS2-RIP方法用于鉴定lncRNA DANCR在肿瘤细胞中的相互作用分子 被引量：1
7
作者 巫孟师 熊敏敏 +2 位作者 彭丹 韩雪 钟小敏 《中山大学学报（医学科学版）》 CAS CSCD 北大核心 2021年第1期24-32,共9页
【目的】为了探讨lncRNA DANCR在肿瘤细胞中的作用机制,本研究拟构建一种新的MS2-RIP方法用于鉴定DANCR的相互作用分子。【方法】利用MS2噬菌体衣壳蛋白可与噬菌体复制酶编码基因5’端一段由19个碱基组成的RNA茎环结构序列,即MS2结合位... 【目的】为了探讨lncRNA DANCR在肿瘤细胞中的作用机制,本研究拟构建一种新的MS2-RIP方法用于鉴定DANCR的相互作用分子。【方法】利用MS2噬菌体衣壳蛋白可与噬菌体复制酶编码基因5’端一段由19个碱基组成的RNA茎环结构序列,即MS2结合位点(MS2 Binding Site,MS2 BS)高效结合的特点,构建串联表达MS2 BS和DANCR的过量表达质粒,通过MS2蛋白与MS2 BS的亲和作用,使DANCR得到富集,并且同步捕获与DANCR相互作用的分子,用于进一步分析鉴定。【结果】成功构建串联表达MS2 BS和DANCR的过量表达质粒用于MS2-RIP实验,该实验可显著富集DANCR以及作为阳性对照的DANCR结合蛋白EZH2。【结论】基于MS2蛋白与MS2结合位点的高效结合特性,我们针对lncRNA DANCR建立了MS2-RIP方法。该方法可有效富集DANCR以及与DANCR结合的生物活性分子,为研究DANCR的作用机制提供一种新的技术手段。 展开更多
关键词 MS2 rna结合蛋白免疫沉淀 长链非编码rna DANCR
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